Name: a uniform shear assay for human platelet and cell surface receptors via cone-plate viscometry
Uploaded: 2019-06-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry at JoVE.com

وقد تم دعم العمل المتعلق بهذه الدراسة جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة والقلب والرئة ومعهد الدم منح HL082808 ، HL123984 (ار ال) ، و F31HL134241 (M.E.Q.). التمويل المقدم أيضا من المعهد الوطني للصحة القومية للعلوم الطبية العامة منحه T32GM008367 (M.E.Q.) ؛ وصناديق المنح التجريبية من الرعاية الصحية للأطفال من أتلانتا وأموري جامعه تدفق الأطفال الخلوية الاساسيه. ويود المؤلفون ان يشكروا الدكتور هانز ديميون لمشاركتهم الأجسام المضادة 6B4 ، ومركز بحوث الأطفال الخاص بالطفل الذي يقوم بالتدفق الخلوي الأساسي للدعم التقني.

تمت الموافقة علي جميع الطرق التي تستخدم الصفائح الدموية المستمدة من المتبرعين الموصوفة هنا من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لجامعه أموري/الرعاية الصحية للأطفال في أتلانتا.
1. سحب الدم وعزل الصفائح الدموية
<ol><li>رسم الدم البشري من المتبرعين الكبار صحية بالتراضي عن طريق بزل في ?...

<ol>
	<li>Sullivan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-voltage-gated+Ca2++influx+through+mechanosensitive+ion+channels+in+aortic+baroreceptor+neurons.">Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons.</a> Circulation Research. 80 (6), 861-867 (1997).</li><li>Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+stretch-activated+ion+channels+in+vascular+endothelial+cells+as+mechanotransducers.">Single stretch-activated ion channels in vascular endothelial cells as mechanotransducers.</a> Nature. 325 (6107), 811-813 (1987).</li><li>Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+Cell+Transduction,+Tuning,+and+Synaptic+Transmission+in+the+Mammalian+Cochlea.">Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea.</a> Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).</li><li>Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gentle+touch+receptors+of+mammalian+skin.">The gentle touch receptors of mammalian skin.</a> Science. 346 (6212), 950-954 (2014).</li><li>Nelson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+patterns+of+growth+controlled+by+multicellular+form+and+mechanics.">Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (33), 11594-11599 (2005).</li><li>Yu, C. H., Law, J. B., Suryana, M., Low, H. Y., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+integrin+binding+to+Arg-Gly-Asp+peptide+activates+actin+polymerization+and+contractile+movement+that+stimulates+outward+translocation.">Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (51), 20585-20590 (2011).</li><li>Wen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shear-dependent+NO-cGMP-cGKI+cascade+in+platelets+acts+as+an+auto-regulatory+brake+of+thrombosis.">A shear-dependent NO-cGMP-cGKI cascade in platelets acts as an auto-regulatory brake of thrombosis.</a> Nature Communications. 9 (1), 4301 (2018).</li><li>Marki, A., Gutierrez, E., Mikulski, Z., Groisman, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+side+view+flow+chamber+reveals+tether-to-sling+transition+in+rolling+neutrophils.">Microfluidics-based side view flow chamber reveals tether-to-sling transition in rolling neutrophils.</a> Scientific Reports. 6, 28870 (2016).</li><li>Brockman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+3D+orientation+of+piconewton+integrin+traction+forces.">Mapping the 3D orientation of piconewton integrin traction forces.</a> Nature Methods. 15 (2), 115-118 (2018).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+modular+and+universal+single+molecule+tension+sensor+using+protein+G+to+study+mechano-sensitive+receptors.">Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors.</a> Scientific Reports. 6, 21584 (2016).</li><li>Quach, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc-independent+immune+thrombocytopenia+via+mechanomolecular+signaling+in+platelets.">Fc-independent immune thrombocytopenia via mechanomolecular signaling in platelets.</a> Blood. 131 (7), 787-796 (2018).</li><li>Cao, W., Krishnaswamy, S., Camire, R. M., Lenting, P. J., Zheng, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factor+VIII+accelerates+proteolytic+cleavage+of+von+Willebrand+factor+by+ADAMTS13.">Factor VIII accelerates proteolytic cleavage of von Willebrand factor by ADAMTS13.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105 (21), 7416-7421 (2008).</li><li>Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets+and+shear+stress.">Platelets and shear stress.</a> Blood. 88 (5), 1525-1541 (1996).</li><li>Pareti, F. I., Niiya, K., McPherson, J. M., Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+two+domains+of+human+von+Willebrand+factor+that+interact+with+fibrillar+collagen+types+I+and+III.">Isolation and characterization of two domains of human von Willebrand factor that interact with fibrillar collagen types I and III.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (28), 13835-13841 (1987).</li><li>Deng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+clearance+via+shear-induced+unfolding+of+a+membrane+mechanoreceptor.">Platelet clearance via shear-induced unfolding of a membrane mechanoreceptor.</a> Nature Communications. 7, 12863 (2016).</li><li>Ikeda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+von+Willebrand+factor+and+fibrinogen+in+platelet+aggregation+under+varying+shear+stress.">The role of von Willebrand factor and fibrinogen in platelet aggregation under varying shear stress.</a> Journal of Clinical Investigation. 87 (4), 1234-1240 (1991).</li><li>Westerhof, N., Stergiopulos, N., Noble, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Snapshots of hemodynamics: an aid for clinical research and graduate education. , (2010).</li><li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+of+ectodomain+shedding+of+glycoprotein+Ibalpha+by+targeting+its+juxtamembrane+shedding+cleavage+site.">Specific inhibition of ectodomain shedding of glycoprotein Ibalpha by targeting its juxtamembrane shedding cleavage site.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (12), 2155-2162 (2013).</li><li>Samsel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry+for+morphologic+and+phenotypic+characterization+of+rare+circulating+endothelial+cells.">Imaging flow cytometry for morphologic and phenotypic characterization of rare circulating endothelial cells.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (6), 379-389 (2013).</li><li>Basiji, D. A., Ortyn, W. E., Liang, L., Venkatachalam, V., Morrissey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+image+analysis+and+imaging+by+flow+cytometry.">Cellular image analysis and imaging by flow cytometry.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 27 (3), 653-670 (2007).</li><li>Quach, M. E., Chen, W., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+platelet+clearance+and+translation+to+improve+platelet+storage.">Mechanisms of platelet clearance and translation to improve platelet storage.</a> Blood. 131 (14), 1512-1521 (2018).</li></ol>

يسمح البروتوكول الموصوف في هذه المخطوطة باجراء تقييم سريع ومتعدد الاستعمالات لتاثير القص الصفي علي مستقبلات الصفائح الدموية وسطح الخلية. وتبرز النتائج التمثيلية المحددة المقدمة هنا كيف يمكن ان تتاثر اثار اللزوجة الثنائية أو الثنائية التكافؤ بتدفق القص. بالاضافه إلى هذا التطبيق ، والفح?...

المستقبلات اليه هي البروتينات التي تستجيب للمؤثرات الميكانيكية ، مثل الضغط أو الاضطراب الميكانيكي/التشوه. بالنسبة لبعض المستقبلات اليه ، فان استشعار هذه الاضطرابات الميكانيكية واضح لوظيفة أنواع الخلايا التي يتم التعبير عنها. تاخذ ، علي سبيل المثال ، مستقبلات تمتد في الخلايا العصبية مستقبلات البارونات. هذه القناات أيون الميكانيكية تنظيم ضغط الدم عن طريق استشعار الاوعيه الدموية "تمتد"1,2. في الاذن الداخلية ، وقناات أيون علي خلايا الشعر الكشف عن تشوات الميكانيكية الناجمة عن الموجات الصوتية3، والجلدية عتبه منخفضه الميكانيكية المستقبلات (ltmrs) تسهيل نقل المعلومات عن طريق اللمس4. وفي حالات أخرى ، توفر المستقبلات الميكانيكية معلومات هامه للخلية لإنشاء التصاق أو النمو. خلايا يستطيع تحسست الصلابة من بيئتهم محليه, ويمكن اعتمدت علي مقلص قوات عن طريق ال [اكتيتن] [سيتوكلتون] وتكامل ان يملي نمو أو [سبردينغ]5,6.
عند دراسة مستقبلات-يجند التفاعلات في النماذج القائمة علي الخلايا أو الانسجه ، توجد اختبارات المشتركة التي يمكن الإبلاغ بسرعة ودقه اثار تغيير درجه الحرارة ، والحموضة ، والتركيز ، والنغمات ، والقدرة علي الغشاء ، والعديد من المعلمات الأخرى والتي يمكن ان تختلف في الجسم المجري. ومع ذلك ، فان هذه المقايسات نفسها قد تكون قصيرة عندما يتعلق الأمر بالكشف عن مساهمه القوه الميكانيكية لتنشيط مستقبلات. ما إذا كانت الخلايا الاستشعار عن البيئة الدقيقة ، والكشف عن الموجات الصوتية ، أو الاستجابة لتمتد ، شيء واحد المستقبلات الميكانيكية المذكورة أعلاه مشتركه هو انهم يشاركون في التفاعلات حيث الligand ، مستقبلات ، أو كليهما ، ترتكز علي السطح. وغالبا ما تعكس المقايسات المطورة لاختبار اثار القوي الميكانيكية علي تفاعلات المستقبلات هذا النموذج. وتستخدم ميكروفلويديكس وتدفق الغرف لدراسة اثار تدفق القص علي الخلايا والمستقبلات7,8. وتتمتع هذه الأنواع من التجارب بميزه السماح بضبط معدلات القص عن طريق سرعات التدفق الثابتة. وتستخدم التقنيات الأخرى المسبارات الجزيئية الفلورية للكشف عن القوات التي تطبقها الخلايا علي الأسطح الغنية بالحروف ، مما ينتج عنه قراءات دقيقه لحجم وتوجات القوات المشاركة في التفاعل9و10.
بالاضافه إلى الميكانيكية التي تحدث حيث يتم ربط واحد أو كلا الشريكين إلى السطح ، والإجهاد القص قد تؤثر علي البروتينات والخلايا في الحل. وغالبا ما يلاحظ هذا في خلايا الدم/البروتينات التي هي باستمرار في الدورة الدموية ، ويمكن ان تظهر عن طريق تفعيل المستقبلات الميكانيكية التي هي عاده سطح الراسية11، أو من خلال التعرض للتسلسل الهدف الذي سيكون مسدود تحت شروط ثابته12. ومع ذلك ، اقل نسبيا تقنيات فحص اثار قوه القص علي الجزيئات في الحل. بعض النهج في الحل إدخال القص عن طريق الخلايا الفورتكينغ في تعليق السوائل بسرعات ومدد متفاوتة ، علي الرغم من ان هذه النهج قد لا تسمح بتحديد دقيق جدا من الإجهاد القص المتولدة. يقيس اللزوجة التناوب بتطبيق قوه قص محدده علي السوائل. هنا نقوم بوصف طريقه تطبيقية لتحديد تاثير معدلات القص الرقائقي محدده علي الخلايا أو شظايا الخلية في الحل.
واحد من البروتينات الأكثر تعبيرا علي سطح الصفائح الدموية هو بروتين سكري (GP) مجمع Ib-IX. GPIb-التاسع هو مستقبلات الاساسيه للبروتين البلازما فون Willebrand عامل (VWF). معا, وقد تم منذ فتره طويلة المعترف بها هذا الزوج ومستقبلات كاساس للاستجابة الصفائح الدموية للضغط القص13. في حاله تلف الاوعيه الدموية ، VWF يربط لكشف الكولاجين في مصفوفة البطانة الفرعية14، التالي تجنيد الصفائح الدموية إلى موقع الاصابه عن طريق التفاعل Vwf-GPIb-IX. VWF الاشتباك إلى موقعها ملزمه في الوحدة الفرعية GPIbα إذا GPIb-التاسع تحت الإجهاد القص الفسيولوجية يدفع تتكشف من المجال الميكانيكي القريب الغشاء (MSD) الذي بدوره ينشط GPIb-التاسع15. في دراسة حديثه, وقد أظهرنا ان الأجسام المضادة ضد GPIbα, مثل تلك التي ولدت في العديد من المرضي الصفيحات المناعية (آيب), هي أيضا قادره علي حمل الصفائح الدموية إشارات عبر MSD تتكشف تحت الضغط القص11. ومع ذلك ، علي عكس VWF ، والتي تسهل القص الناجمة عن GPIb-التاسع التنشيط عن طريق التعبئة المعقدة تحت الدورة الدموية العادية ، والأجسام المضادة التكافؤ قادره علي عبور الصفائح الدموية عبر GPIb-التاسع وتتكشف MSD في الدورة الدموية. وبهذه الطريقة ، يمكن تنشيط مستقبلات ميكانيكيه التي يتم تنشيطها عاده عن طريق التجميد السطحي تحت القص في الحل. وفي هذا التقرير ، سنبين كيف تمت الاستفادة من فحص القص الموحد القائم علي الرؤية للكشف عن اثار مستويات معينه من إجهاد القص علي تنشيط المستقبلات في الحل.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:764px;" width="764">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:413px;">APC anti-human CD62P (P-Selectin)</td>
			<td style="width:128px;">BioLegend</td>
			<td style="width:135px;">304910</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:413px;">Brookfield Cap 2000+ Viscometer</td>
			<td style="width:128px;">Brookfield</td>
			<td style="width:135px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL)</td>
			<td style="width:128px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:135px;">FL-1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pooled Normal Human Plasma</td>
			<td>Precision Biologic</td>
			<td>CCN-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:413px;">Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate)</td>
			<td style="width:128px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">369714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:413px;">Vacutainer Blood Collection Set, 21G x &#190;&#34; Needle</td>
			<td style="width:128px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">367287</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a uniform shear assay for human platelet and cell surface receptors via cone-plate viscometry

العديد من الخلايا البيولوجية/الانسجه الشعور الخواص الميكانيكية للبيئات المحلية عن طريق المستقبلات اليه ، والبروتينات التي يمكن ان تستجيب لقوي مثل الضغط أو الاضطرابات الميكانيكية. المستقبلات الميكانيكية الكشف عن المحفزات ونقل الإشارات عبر تنوع كبير من أليات. بعض الأدوار الأكثر شيوعا للمستقبلات الميكانيكية هي في الاستجابات العصبية ، مثل اللمس والم ، أو خلايا الشعر التي تعمل في التوازن والسمع. الميكانيكية هي أيضا مهمة لأنواع الخلايا التي تتعرض بانتظام للإجهاد القص مثل الخلايا البطانية ، التي الاوعيه الدموية الخط ، أو خلايا الدم التي تواجه القص في الدورة الدموية العادية. عدادات الرؤية هي الاجهزه التي تكتشف لزوجه السوائل. كما يمكن استخدام مقاييس الرؤية التناوبية لتطبيق قوه قص معروفه علي السوائل. وقد استغلت قدره هذه الاداات علي إدخال القص الموحد علي السوائل لدراسة العديد من السوائل البيولوجية بما في ذلك الدم والبلازما. كما يمكن استخدام القياس البصري لتطبيق القص علي الخلايا في المحلول ، ولاختبار تاثيرات القص علي أزواج محدده من الحروف والمستقبلات. هنا ، ونحن نستخدم مخروط لوحه الرؤية لاختبار اثار المستويات المحلية من الإجهاد القص علي الصفائح الدموية التعامل مع الأجسام المضادة ضد الصفائح الدموية الميكانيكية مجمع مستقبلات GPIb التاسع.

يوضح الشكل 1 كيف يمكن للنموذج المشغل لتنشيط GPIb-IX ، الذي تم إدخاله في البداية لشرح تنشيط المستقبلات التي تعتمد علي القص عند الارتكاز علي جدار الوعاء ، ان يدعم أيضا تنشيط الصفائح الدموية التي يتم ربطها بواسطة الاربطه متعددة التكافؤ. ويبين الشكل 2 عمليات القرا?...

Watch this Scientific Journal Video about A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry at JoVE.com

A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry

فحص القص الموحد للصفيحات البشرية ومستقبلات سطح الخلية عبر اللوحة المخروطية

نحن وصف طريقه في الحل لتطبيق القص موحده لمستقبلات سطح الصفائح الدموية باستخدام مخروط لوحه الرؤية. ويمكن أيضا استخدام هذه الطريقة علي نطاق أوسع لتطبيق القص علي أنواع الخلايا الأخرى وشظايا الخلايا ولا تحتاج إلى استهداف زوج محدد للمستقبلات.

Many biological cells/tissues sense the mechanical properties of their local environments via mechanoreceptors, proteins that can respond to forces like ...

يسمح لنا هذا البروتوكول بالإجابة على مجموعة متنوعة من الأسئلة حول الطريقة التي يعمل بها القص على الخلايا في الحل ويوفر تحكمًا كبيرًا في مدة القص وحجمه. على عكس التقنيات الأخرى، التي تكشف عن تأثير القص على الخلايا التي يتم شل حركتها، هذه التقنية تسمح لنا بتطبيق القص على الخلايا في الحل وتفسح المجال أمام مجموعة من أساليب الكشف عن إشارة المصب. بعد الحصول على الدم المحيطي من متبرع بالغ موافقة وصحية في أنبوب 4.5 ملليلتر من سيترات ثلاثي الصوديوم 3.8٪، الطرد المركزي الدم للحصول على البلازما الغنية بالصفائح الدموية، واستخدام تلميح ماصة قطع في زاوية 45 درجة لإزالة بعناية أعلى، غائم، طبقة البلازما الصفراء الغنية بالصفائح الدموية.الحصول على عدد الصفائح الدموية عن طريق تعداد الدم الكامل، وضبط عدد الصفائح الدموية إلى ما يقرب من 2.5 مرات 10 إلى الصفائح الدموية الخامسة لكل ميكرولتر مع البلازما الصفائح الدموية البشرية تجمع الفقراء. ثم، ضع التعليق عند درجة حرارة 22 درجة مئوية مع دوران لطيف. لعلاج ligand، ببطء إضافة الأجسام المضادة أو ليغاند من الفائدة إلى البلازما الغنية بالصفائح الدموية، وخلط الصفائح الدموية بلطف.أثناء الحضانة، بدوره على الزكات لوحة مخروط، وتعيين درجة حرارة لوحة إلى 22 درجة مئوية. بعد خمس إلى 10 دقائق، نقل البلازما المعالجة الغنية بالصفائح الدموية إلى درجة الحرارة التي تسيطر عليها مخروط لوحة فيسكوميتر مباشرة في وسط لوحة، مع الحرص على أن يتم إيداع كل من العينة بين المخروط ولوحة عند نقطة الاتصال. لتطبيق القص على العينة، حساب القص وفقا لدليل المقاييس، وتطبيق القص على العينة بمعدل المناسبة والمدة.في نهاية التطبيق، ورفع المخروط حوالي مليمترين قبالة لوحة، بحيث العينة لا تزال على اتصال مع كل من لوحة ومخروط، واستخدام تلميح ماصة هلام تحميل لجمع خمسة إلى 10 ميكرولترات من مركز حجم العينة. ثم احتضان العينة القص مع الأجسام المضادة ضد علامات السطح من الفائدة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وإصلاح العينات في 2٪ شبهformaldehyde لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لتحليل العينات حسب قياس التدفق، قم بجمع 20,000 حدث على الأقل لكل حالة، وتحديد قوة الإشارة لكل علامة فلورية، باستخدام قيمة الارتفاع لشدة كل فلوري.ثم استخدام التحكم السلبي مع الألبومين المصل البقري أو السيارة لرسم بوابة، باستثناء الأحداث الفلورية الخلفية السلبية، وتحديد النسبة المئوية للأحداث داخل البوابة لجميع الظروف التجريبية. تعبير علامة تنشيط الصفائح الدموية ردا على تطبيق قوة القص غير منظم بطريقة تعتمد على الوقت. هنا، تظهر قراءات تمثيلية لتنشيط الصفائح الدموية البشرية في وجود جسمين مضادين يستهدفان المجال N-terminal من glycoprotein 1b-IX والأجسام المضادة للتحكم واحد تحت ظروف مُجَرَّة وثابتة.وقد زاد التعبير عن جميع علامات التنشيط الثلاث بشكل كبير في وجود قوات القص واستهداف الأجسام المضادة ، مقارنة إما بالظروف الثابتة أو في وجود أجسام مضادة للمراقبة. وتجدر الإشارة إلى أن العلاج بالأجسام المضادة بقوة غير ملزمة منخفضة جدًا بحيث لا يمكن تشغيل تنشيط glycoprotein 1b-IX لا يؤدي إلى رفع تنظيم علامة تنشيط الصفائح الدموية في ظل ظروف قوة ثابتة أو القص. علاوة على ذلك، البلازما من مرضى الجلطات المناعية التي تحتوي على أجسام مضادة ضد جليكوبروتين 1b-IX الردود تعتمد القص الزناد على النقيض من البلازما من المرضى دون جليكوبروتين 1b-IX الأجسام المضادة المستهدفة.بالإضافة إلى التحليلات الانسيابية، يمكن أيضاً أن تكون الخلايا التي تعرضت للمقطّع مُنْحَةً لللطخة الغربية، و ELISA، وتحليل المواصفات الكتلي لتحديد أيّ تغيّرات في مستوى البروتين. كما هو الحال دائما، عند استخدام عينات الدم أو الإنسان، تأكد من ارتداء معدات الحماية المناسبة واتباع سلامة المختبر والمبادئ التوجيهية لمسببات الأمراض المولودة في الدم من مؤسستك.

Research

JoVE Journal

Biology

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

والفحص الكروماتين لأنسجة المخ الإنسان

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate pHPL as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

إعداد Lysate مجمع صفائح الدم البشرية (pHPL) باعتبارها الملحق لمصل فعال خالية من الإنسان الحيوان الثقافات الخلايا الجذعية

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for ...

A &#946;-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay

A ÃƒÅ½Ã‚Â²-glucuronidase GUS Based Cell Death Assay

A β غلوكورونيداز (GUS) موت الخلية استنادا الفحص

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

الطمع القائم على فحص التفاعل خارج الخلية (AVEXIS) للكشف قابلة منخفضة تقارب التفاعلات مستقبلات يجند خارج الخلية

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics

القبض على ببتيد سكري لخلية سطح البروتينات

Cell surface proteins, including extracellular matrix proteins, participate in all major cellular processes and functions, such as growth, ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

تصور الإلتقام بالكلاذرين بوساطة من G مستقبلات البروتين يقترن قرار واحد في الحدث عبر الميكروسكوب TIRF

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

منهج في اختيار الأبتامرات تبديل الهيكل تطبيقها على اللونية الذهب جسيمات متناهية الصغر الفحص

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

الجمعية وتطبيق &quot;خواتم القص &#39;: رواية غشائي نموذج لالمداري، أحادي الاتجاه والدوري السائل تدفق وإجهاد القص

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

تصوير الخلايا الحية من تحبيب الصفائح الدموية والإفراز تحت التدفق

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain RTA Trafficking in Yeast

مقايسة مراسل المستندة إلى الأسفار بسيطة لتحديد المكونات الخلوية اللازمة للريسين سلسلة (RTA) الاتجار بالخميرة

Bacterial and plant A/B toxins exploit the natural trafficking pathways in eukaryotic cells to reach their intracellular target(s) in the cytosol and to ...