Name: a uniform shear assay for human platelet and cell surface receptors via cone-plate viscometry
Uploaded: 2019-06-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry at JoVE.com

Arbejde, der er relevant for denne undersøgelse, blev delvist støttet af National Institutes of Health (NIH) national Heart, Lung og Blood Institute giver HL082808, HL123984 (R.L.), og F31HL134241 (M.E.Q.). Støtte ydet af NIH National Institute of General Medical Sciences Grant T32GM008367 (M.E.Q.); og pilot tilskud midler fra children's Healthcare af Atlanta og Emory University Pediatric flow cytometry Core. Forfatterne vil gerne takke Dr. hans Deckmyn for at dele 6B4 antistof, og Emory children's Pediatric Research Center flow cytometry Core for teknisk support.

Alle metoder ved hjælp af donor-afledte humane trombocytter beskrevet heri blev godkendt af den institutionelle Review Board of Emory University/children's Healthcare i Atlanta.
1. blod trækning og Trombocytisolation
<ol><li>Tegn humant blod fra samtykkende raske voksne donorer via venepunktur på dagen for eksperimentet til 3,8% trinatrium citrat. En 4,5 mL blod slange er tilstrækkelig til at give tilstrækkelig trombocytrig plasma (PRP) til 20-25 forhold hos donorer, hvis trombocyttal e...

<ol>
	<li>Sullivan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-voltage-gated+Ca2++influx+through+mechanosensitive+ion+channels+in+aortic+baroreceptor+neurons.">Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons.</a> Circulation Research. 80 (6), 861-867 (1997).</li><li>Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+stretch-activated+ion+channels+in+vascular+endothelial+cells+as+mechanotransducers.">Single stretch-activated ion channels in vascular endothelial cells as mechanotransducers.</a> Nature. 325 (6107), 811-813 (1987).</li><li>Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+Cell+Transduction,+Tuning,+and+Synaptic+Transmission+in+the+Mammalian+Cochlea.">Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea.</a> Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).</li><li>Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gentle+touch+receptors+of+mammalian+skin.">The gentle touch receptors of mammalian skin.</a> Science. 346 (6212), 950-954 (2014).</li><li>Nelson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+patterns+of+growth+controlled+by+multicellular+form+and+mechanics.">Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (33), 11594-11599 (2005).</li><li>Yu, C. H., Law, J. B., Suryana, M., Low, H. Y., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+integrin+binding+to+Arg-Gly-Asp+peptide+activates+actin+polymerization+and+contractile+movement+that+stimulates+outward+translocation.">Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (51), 20585-20590 (2011).</li><li>Wen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shear-dependent+NO-cGMP-cGKI+cascade+in+platelets+acts+as+an+auto-regulatory+brake+of+thrombosis.">A shear-dependent NO-cGMP-cGKI cascade in platelets acts as an auto-regulatory brake of thrombosis.</a> Nature Communications. 9 (1), 4301 (2018).</li><li>Marki, A., Gutierrez, E., Mikulski, Z., Groisman, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+side+view+flow+chamber+reveals+tether-to-sling+transition+in+rolling+neutrophils.">Microfluidics-based side view flow chamber reveals tether-to-sling transition in rolling neutrophils.</a> Scientific Reports. 6, 28870 (2016).</li><li>Brockman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+3D+orientation+of+piconewton+integrin+traction+forces.">Mapping the 3D orientation of piconewton integrin traction forces.</a> Nature Methods. 15 (2), 115-118 (2018).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+modular+and+universal+single+molecule+tension+sensor+using+protein+G+to+study+mechano-sensitive+receptors.">Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors.</a> Scientific Reports. 6, 21584 (2016).</li><li>Quach, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc-independent+immune+thrombocytopenia+via+mechanomolecular+signaling+in+platelets.">Fc-independent immune thrombocytopenia via mechanomolecular signaling in platelets.</a> Blood. 131 (7), 787-796 (2018).</li><li>Cao, W., Krishnaswamy, S., Camire, R. M., Lenting, P. J., Zheng, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factor+VIII+accelerates+proteolytic+cleavage+of+von+Willebrand+factor+by+ADAMTS13.">Factor VIII accelerates proteolytic cleavage of von Willebrand factor by ADAMTS13.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105 (21), 7416-7421 (2008).</li><li>Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets+and+shear+stress.">Platelets and shear stress.</a> Blood. 88 (5), 1525-1541 (1996).</li><li>Pareti, F. I., Niiya, K., McPherson, J. M., Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+two+domains+of+human+von+Willebrand+factor+that+interact+with+fibrillar+collagen+types+I+and+III.">Isolation and characterization of two domains of human von Willebrand factor that interact with fibrillar collagen types I and III.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (28), 13835-13841 (1987).</li><li>Deng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+clearance+via+shear-induced+unfolding+of+a+membrane+mechanoreceptor.">Platelet clearance via shear-induced unfolding of a membrane mechanoreceptor.</a> Nature Communications. 7, 12863 (2016).</li><li>Ikeda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+von+Willebrand+factor+and+fibrinogen+in+platelet+aggregation+under+varying+shear+stress.">The role of von Willebrand factor and fibrinogen in platelet aggregation under varying shear stress.</a> Journal of Clinical Investigation. 87 (4), 1234-1240 (1991).</li><li>Westerhof, N., Stergiopulos, N., Noble, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Snapshots of hemodynamics: an aid for clinical research and graduate education. , (2010).</li><li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+of+ectodomain+shedding+of+glycoprotein+Ibalpha+by+targeting+its+juxtamembrane+shedding+cleavage+site.">Specific inhibition of ectodomain shedding of glycoprotein Ibalpha by targeting its juxtamembrane shedding cleavage site.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (12), 2155-2162 (2013).</li><li>Samsel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry+for+morphologic+and+phenotypic+characterization+of+rare+circulating+endothelial+cells.">Imaging flow cytometry for morphologic and phenotypic characterization of rare circulating endothelial cells.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (6), 379-389 (2013).</li><li>Basiji, D. A., Ortyn, W. E., Liang, L., Venkatachalam, V., Morrissey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+image+analysis+and+imaging+by+flow+cytometry.">Cellular image analysis and imaging by flow cytometry.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 27 (3), 653-670 (2007).</li><li>Quach, M. E., Chen, W., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+platelet+clearance+and+translation+to+improve+platelet+storage.">Mechanisms of platelet clearance and translation to improve platelet storage.</a> Blood. 131 (14), 1512-1521 (2018).</li></ol>

Den protokol, der er beskrevet i dette manuskript, giver mulighed for hurtig og alsidig vurdering af effekten af laminar forskydning på blodplade-og celleoverflade receptorer. De specifikke repræsentative resultater præsenteret her understreger, hvordan virkningerne af multimeriske eller bivalent ligander kan påvirkes af forskydnings strøm. Ud over denne applikation, en ensartet forskydningsanalyse har brede anvendelsesmuligheder i observation forskydnings afhængige effekter. I mangel af et kendt ligand-receptor pa...

Mechanoreceptors er proteiner, der reagerer på mekaniske stimuli, såsom tryk eller mekanisk perturbation/deformation. For nogle mechanoreceptorer, sensing disse mekaniske forstyrrelser er eksplicit til funktionen af de celletyper, som de er udtrykt. Tag for eksempel de stræk receptorer i baroreceptor neuroner; disse mekanisofølsomme Ionkanaler regulerer blodtrykket ved at registrere vaskulær "stretch"1,2. I det indre øre, ionkanaler på hårceller detekterer mekaniske deformationer forårsaget af lydbølger3, og kutane lav tærskel mekanisoreceptorer (ltmrs) lette overførslen af taktile information4. I andre tilfælde, mekanioreceptors give vigtige oplysninger til cellen for etablering af vedhæftning eller vækst. Celler kan fornemme stivheden i deres lokale miljø, og kan stole på kontraktile kræfter via actin cytoskelet og integrins at diktere vækst eller sprede6,5.
Når man studerer receptor-ligand interaktioner i celle-eller vævsbaserede modeller, findes der fælles analyser, som hurtigt og præcist kan rapportere virkningerne af at ændre temperatur, ph, ligand koncentration, tonicitet, membran potentiale, og mange andre parametre der kan variere in vivo. Men, disse samme analyser kan falde kort, når det kommer til at afsløre bidrag af mekanisk kraft til receptor aktivering. Uanset om cellerne registrerer deres mikromiljø, detekterer lydbølger eller reagerer på stretch, er en ting, som førnævnte mekanisoreceptorer har til fælles, at de deltager i interaktioner, hvor ligand, receptoren eller begge er forankret til en Overflade. Assays udviklet til at teste virkningerne af mekaniske kræfter på receptor interaktioner ofte afspejler dette paradigme. Mikrofluidics og flow kamre bruges til at studere virkningerne af forskydnings strøm på celler og receptorer7,8. Disse typer af eksperimenter har den fordel at tillade finjustering af forskydnings hastigheder via etablerede strømningshastigheder. Andre teknikker anvender fluorescerende molekylære sonder til at detektere kræfter, der påføres af celler på ligand-rige overflader, hvilket giver en nøjagtig aflæsning af omfanget og orienteringen af kræfter, der er involveret i interaktionen9,10.
Ud over mekanisk sensation, hvor den ene eller begge parter er forankret til en overflade, kan forskydnings stress påvirke proteiner og celler i opløsning. Dette observeres ofte i blodceller/proteiner, der konstant er i omløb, og kan manifestere sig via aktivering af mekanisoreceptorer, der normalt er overflade forankrede11, eller ved eksponering af målsekvenser, som ville blive tilstoppet under statiske forhold12. Men relativt færre teknikker assay virkningerne af forskydningskraft på partikler i opløsning. Nogle in-Solution tilgange introducere shear via vortexning celler i flydende suspension med varierende hastigheder og varighed, selv om disse tilgange kan ikke tillade en meget præcis bestemmelse af forskydningen stress genereret. Roterende viskosimetre måler viskositet ved at anvende en specifik forskydningskraft på væsker. Heri beskriver vi en anvendt metode til bestemmelse af effekten af specifikke laminar forskydnings rater på celler eller celle fragmenter i opløsning.
Et af de mest højt udtrykte proteiner på trombocytoverfladen er glykoprotein (GP) Ib-IX-komplekset. GPIb-IX er den primære receptor for plasmaprotein von Willebrand Factor (VWF). Sammen, denne receptor-ligand par har længe været anerkendt som grundlaget for trombocyttal respons til shear stress13. I tilfælde af vaskulære skader binder VWF sig til eksponeret kollagen i sub-Endothelial matrix14, hvorved der rekrutteres blodplader til skadestedet via vWF-GPIb-IX-interaktionen. VWF engagement i dets bindingssted i GPIbα-under enheden, hvis GPIb-IX under fysiologisk forskydnings stress inducerer udtrækning af et membran-proximalt mechanosensoriske domæne (MSD), som igen aktiverer GPIb-IX15. I en nylig undersøgelse har vi vist, at antistoffer mod GPIbα, som dem, der dannes hos mange patienter med immun trombocytopeni (ITP), også kan inducere trombocytsignalering via MSD, der udfolder sig under forskydnings stress11. I modsætning til VWF, som letter aktivering af forskydnings induceret GPIb-IX ved at immobilisere komplekset under normal cirkulation, er de bivalente antistoffer i stand til at kryds forbinde trombocytterne via GPIb-IX og udfolde MSD i omløb. På denne måde kan en mekanisoreceptor, som normalt aktiveres ved overflade immobilisering under forskydning, aktiveres i opløsningen. I denne rapport, vil vi demonstrere, hvordan en viscometer-baseret ensartet forskydningsanalyse blev gearede til at påvise virkningerne af specifikke niveauer af forskydnings stress på receptor aktivering i opløsning.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:764px;" width="764">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:413px;">APC anti-human CD62P (P-Selectin)</td>
			<td style="width:128px;">BioLegend</td>
			<td style="width:135px;">304910</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:413px;">Brookfield Cap 2000+ Viscometer</td>
			<td style="width:128px;">Brookfield</td>
			<td style="width:135px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL)</td>
			<td style="width:128px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:135px;">FL-1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pooled Normal Human Plasma</td>
			<td>Precision Biologic</td>
			<td>CCN-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:413px;">Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate)</td>
			<td style="width:128px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">369714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:413px;">Vacutainer Blood Collection Set, 21G x &#190;&#34; Needle</td>
			<td style="width:128px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">367287</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a uniform shear assay for human platelet and cell surface receptors via cone-plate viscometry

Mange biologiske celler/væv fornemmer de mekaniske egenskaber i deres lokale miljøer via mekanisoreceptorer, proteiner, der kan reagere på kræfter som tryk eller mekaniske forstyrrelser. Mechanoreceptors opdager deres stimuli og sender signaler via en stor mangfoldighed af mekanismer. Nogle af de mest almindelige roller for mechanoreceptors er i neuronal svar, som touch og smerte, eller hårceller, der fungerer i balance og hørelse. Mechanosensation er også vigtigt for celletyper, der jævnligt udsættes for forskydnings stress såsom endotelceller, hvilke linje blodkar eller blodlegemer, der oplever forskydning i normal cirkulation. Viscometers er enheder, der detekterer viskositeten af væsker. Rotational viskosimetre kan også anvendes til at anvende en kendt forskydningskraft på væsker. Evnen af disse instrumenter til at indføre en ensartet forskydning til væsker er blevet udnyttet til at studere mange biologiske væsker, herunder blod og plasma. Viscometry kan også anvendes til at anvende shear til cellerne i en opløsning, og til at teste virkningerne af shear på specifikke ligand-receptor-par. Her udnytter vi kegle-plade viskometri til at teste virkningerne af endogene niveauer af forskydnings stress på blodplader behandlet med antistoffer mod trombocytsensorisk receptor kompleks gpib-IX.

Figur 1 skitserer, hvordan Trigger-modellen for aktivering af GPIb-IX, der oprindeligt blev introduceret for at forklare forskydnings afhængig receptor aktivering, når den forankres til fartøjs væggen, også kan understøtte aktivering af trombocytter, der krydses af et multivalente ligand. Figur 2 viser udlæsninger af human trombocytaktivering behandlet med to antistoffer rettet mod N-terminal domænet for GPIb-IX (6B4 og 11A8) og et kontrol-antistof (norm...

Watch this Scientific Journal Video about A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry at JoVE.com

A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry

En ensartet Forskydningsanalyse for humant trombocyttal og celleoverflade receptorer via kegle-plade Viscometry

Vi beskriver en in-Solution metode til at anvende ensartet forskydning til blodplade overflade receptorer ved hjælp af kegle-plade viscometri. Denne metode kan også bruges mere bredt til at anvende shear til andre celletyper og celle-fragmenter og behøver ikke at målrette en specifik ligand-receptor par.

Many biological cells/tissues sense the mechanical properties of their local environments via mechanoreceptors, proteins that can respond to forces like ...

Denne protokol giver os mulighed for at besvare en række spørgsmål om den måde, at forskydning virker på celler i løsning og giver betydelig kontrol over forskydning varighed og størrelsesorden. I modsætning til andre teknikker, som registrerer effekten af forskydning på celler, der er immobiliseret, denne teknik giver os mulighed for at anvende forskydning til celler i opløsning og egner sig til et spektrum af downstream signal detektionsmetoder. Efter at have fået perifert blod fra en samtykkende, sund voksen donor i en 4,5-milliliter rør på 3,8% trinatriumcitrat, centrifuge blodet for at opnå blodplade-rige plasma, og bruge en pipette spids skåret i en 45-graders vinkel til omhyggeligt at fjerne den resulterende top, uklar, gul blodplade-rige plasmalag.Anskaf blodpladetallet via komplet blodtal, og juster blodpladetallet til ca. 2,5 gange 10 til de femte blodplader pr. mikroliter med poolet humant trombocytsårne plasma. Derefter placere suspensionen på 22 grader Celsius med blid rotation. Til ligandbehandling tilsættes langsomt antistoffet eller ligand af interesse til det blodpladerige plasma, og blodpladerne blandes forsigtigt.Under inkubationen tændes keglepladevistometeret, og pladetemperaturen indstilles til 22 grader Celsius. Efter fem til 10 minutter overføres det behandlede trombostige plasma til det temperaturstyrede kegleplade viscometer direkte i midten af pladen, idet det skal sikres, at hele prøven deponeres mellem keglen og pladen på kontaktpunktet. Hvis du vil anvende forskydningen på prøven, beregnes forskydningen i henhold til viscometermanualen, og forskydningen anvendes på prøven med den relevante hastighed og varighed.I slutningen af ansøgningen løftes keglen ca. to millimeter fra pladen, så prøven forbliver i kontakt med både pladen og keglen, og brug en gellæstepipettespids til at indsamle fem til 10 mikroliter fra midten af prøvevolumenet. Derefter inkuberes den skåret prøve med antistoffer mod overfladen markører af interesse i 20 minutter ved stuetemperatur, og fastgør prøverne i 2%paraformaldehyd i 20 minutter ved stuetemperatur. For at analysere prøverne efter flowcytometri indsamles mindst 20.000 hændelser for hver betingelse og kvantificere signalstyrken af hver lysstofmarkør ved hjælp af højdeværdien for intensiteten af hver fluorfarve.Brug derefter en negativ kontrol med kvæg serumalbumin eller køretøj til at tegne en port, bortset fra negative baggrundslysstofrør, og kvantificere procentdelen af hændelser inde i porten for alle forsøgsbetingelser. Blodpladeaktiveringsmarkørudtryk som svar på forskydningskraftanvendelse er ureguleret på en tidsafhængig måde. Her vises repræsentative udlæsninger af menneskelig trombocytaktivering i overværelse af to antistoffer, der er rettet mod N-terminaldomænet glycoprotein 1b-IX og et kontrolantistof under skåret og statiske forhold.Udtrykket af alle tre aktiveringsmarkører blev signifikant forøget ved tilstedeværelse af forskydningskræfter og målretning mod antistoffer sammenlignet med enten statiske tilstande eller ved tilstedeværelse af kontrolantistoffer. Især, behandling med antistof med en uforbindingskraft for lav til at udløse glycoprotein 1b-IX aktivering ikke udløser trombocyt aktivering markør upregulation under statiske eller forskydning kraft betingelser. Endvidere udløser plasma fra immuntrombocytopenipatienter, der indeholder antistoffer mod glykoprotein 1b-IX, forskydningsafhængige reaktioner i modsætning til plasma fra patienter uden glykoprotein 1b-IX rettet mod antistoffer.Ud over flowcytometriske analyser kan celler, der har været eksponeret for forskydning, også lyses for western blot, ELISA og massespecanalyse for at bestemme eventuelle ændringer i proteinniveauet. Som altid, når du bruger blod eller menneskelige prøver, sørg for at bære ordentlig beskyttelsesudstyr og følg lab sikkerhed og blod født patogen retningslinjer for din institution.

Research

JoVE Journal

Biology

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate pHPL as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for ...

A &#946;-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay

A ÃƒÅ½Ã‚Â²-glucuronidase GUS Based Cell Death Assay

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Aviditet baseret ekstracellulær interaktion Screening (AVEXIS) for skalerbar detektion af lav affinitet Ekstracellulære Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics

Glycopeptid Capture for Cell Surface Proteomics

Cell surface proteins, including extracellular matrix proteins, participate in all major cellular processes and functions, such as growth, ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Visualisere Clathrin endocytose af G-protein-koblede receptorer på Single-begivenhed opløsning via TIRF Mikroskopi

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

En metode til at vælge Struktur-skifte Aptamerer Anvendt på en kolorimetrisk Gold Nanopartikel Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Forsamlingen og anvendelse af &#39;Shear Rings &quot;: A Novel Endothelial Model for Orbital, ensrettet og periodisk Fluid Flow og Shear stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Levende cellebilleddannelse af blodpladegravulation og sekretion under strømning

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain RTA Trafficking in Yeast

En simpel fluorescens-baserede Reporter analyse til at identificere cellulære komponenter kræves for Ricin toksin en kæde (RTA) handel med gær

Bacterial and plant A/B toxins exploit the natural trafficking pathways in eukaryotic cells to reach their intracellular target(s) in the cytosol and to ...