Name: a uniform shear assay for human platelet and cell surface receptors via cone-plate viscometry
Uploaded: 2019-06-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry at JoVE.com

Het werk relevant voor deze studie werd gesteund voor een deel door nationale instituten van gezondheid (NIH) nationaal hart, Long, en het Instituut van het bloed verleent HL082808, HL123984 (R.L.), en F31HL134241 (M.E.Q.). Financiering ook verstrekt door NIH National Institute of General Medical Sciences Grant T32GM008367 (M.E.Q.); en pilot Grant Funds van kinderen de gezondheidszorg van Atlanta en Emory University Pediatric flow Cytometry core. De auteurs willen bedanken Dr. Hans Deckmyn voor het delen van de 6B4 antilichaam, en de Emory Children's Pediatric Research Center flow Cytometry core voor technische ondersteuning.

Alle methoden met behulp van donor-afgeleide menselijke bloedplaatjes hierin beschreven werden goedgekeurd door de Institutional Review Board van Emory University/Children's Healthcare van Atlanta.
1. bloed trekken en plaatjes isolatie
<ol><li>Trek menselijk bloed van toestemmende gezonde volwassen donors via punctie op de dag van het experiment in 3,8% trinatriumfosfaat citraat. Een 4,5 mL buis van bloed is voldoende om de opbrengst voldoende bloedplaatjes rijk plasma (PV) voor 20-25 voorwa...

<ol>
	<li>Sullivan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-voltage-gated+Ca2++influx+through+mechanosensitive+ion+channels+in+aortic+baroreceptor+neurons.">Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons.</a> Circulation Research. 80 (6), 861-867 (1997).</li><li>Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+stretch-activated+ion+channels+in+vascular+endothelial+cells+as+mechanotransducers.">Single stretch-activated ion channels in vascular endothelial cells as mechanotransducers.</a> Nature. 325 (6107), 811-813 (1987).</li><li>Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+Cell+Transduction,+Tuning,+and+Synaptic+Transmission+in+the+Mammalian+Cochlea.">Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea.</a> Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).</li><li>Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gentle+touch+receptors+of+mammalian+skin.">The gentle touch receptors of mammalian skin.</a> Science. 346 (6212), 950-954 (2014).</li><li>Nelson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+patterns+of+growth+controlled+by+multicellular+form+and+mechanics.">Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (33), 11594-11599 (2005).</li><li>Yu, C. H., Law, J. B., Suryana, M., Low, H. Y., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+integrin+binding+to+Arg-Gly-Asp+peptide+activates+actin+polymerization+and+contractile+movement+that+stimulates+outward+translocation.">Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (51), 20585-20590 (2011).</li><li>Wen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shear-dependent+NO-cGMP-cGKI+cascade+in+platelets+acts+as+an+auto-regulatory+brake+of+thrombosis.">A shear-dependent NO-cGMP-cGKI cascade in platelets acts as an auto-regulatory brake of thrombosis.</a> Nature Communications. 9 (1), 4301 (2018).</li><li>Marki, A., Gutierrez, E., Mikulski, Z., Groisman, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+side+view+flow+chamber+reveals+tether-to-sling+transition+in+rolling+neutrophils.">Microfluidics-based side view flow chamber reveals tether-to-sling transition in rolling neutrophils.</a> Scientific Reports. 6, 28870 (2016).</li><li>Brockman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+3D+orientation+of+piconewton+integrin+traction+forces.">Mapping the 3D orientation of piconewton integrin traction forces.</a> Nature Methods. 15 (2), 115-118 (2018).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+modular+and+universal+single+molecule+tension+sensor+using+protein+G+to+study+mechano-sensitive+receptors.">Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors.</a> Scientific Reports. 6, 21584 (2016).</li><li>Quach, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc-independent+immune+thrombocytopenia+via+mechanomolecular+signaling+in+platelets.">Fc-independent immune thrombocytopenia via mechanomolecular signaling in platelets.</a> Blood. 131 (7), 787-796 (2018).</li><li>Cao, W., Krishnaswamy, S., Camire, R. M., Lenting, P. J., Zheng, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factor+VIII+accelerates+proteolytic+cleavage+of+von+Willebrand+factor+by+ADAMTS13.">Factor VIII accelerates proteolytic cleavage of von Willebrand factor by ADAMTS13.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105 (21), 7416-7421 (2008).</li><li>Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets+and+shear+stress.">Platelets and shear stress.</a> Blood. 88 (5), 1525-1541 (1996).</li><li>Pareti, F. I., Niiya, K., McPherson, J. M., Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+two+domains+of+human+von+Willebrand+factor+that+interact+with+fibrillar+collagen+types+I+and+III.">Isolation and characterization of two domains of human von Willebrand factor that interact with fibrillar collagen types I and III.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (28), 13835-13841 (1987).</li><li>Deng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+clearance+via+shear-induced+unfolding+of+a+membrane+mechanoreceptor.">Platelet clearance via shear-induced unfolding of a membrane mechanoreceptor.</a> Nature Communications. 7, 12863 (2016).</li><li>Ikeda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+von+Willebrand+factor+and+fibrinogen+in+platelet+aggregation+under+varying+shear+stress.">The role of von Willebrand factor and fibrinogen in platelet aggregation under varying shear stress.</a> Journal of Clinical Investigation. 87 (4), 1234-1240 (1991).</li><li>Westerhof, N., Stergiopulos, N., Noble, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Snapshots of hemodynamics: an aid for clinical research and graduate education. , (2010).</li><li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+of+ectodomain+shedding+of+glycoprotein+Ibalpha+by+targeting+its+juxtamembrane+shedding+cleavage+site.">Specific inhibition of ectodomain shedding of glycoprotein Ibalpha by targeting its juxtamembrane shedding cleavage site.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (12), 2155-2162 (2013).</li><li>Samsel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry+for+morphologic+and+phenotypic+characterization+of+rare+circulating+endothelial+cells.">Imaging flow cytometry for morphologic and phenotypic characterization of rare circulating endothelial cells.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (6), 379-389 (2013).</li><li>Basiji, D. A., Ortyn, W. E., Liang, L., Venkatachalam, V., Morrissey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+image+analysis+and+imaging+by+flow+cytometry.">Cellular image analysis and imaging by flow cytometry.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 27 (3), 653-670 (2007).</li><li>Quach, M. E., Chen, W., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+platelet+clearance+and+translation+to+improve+platelet+storage.">Mechanisms of platelet clearance and translation to improve platelet storage.</a> Blood. 131 (14), 1512-1521 (2018).</li></ol>

Het protocol beschreven in dit manuscript maakt een snelle en veelzijdige beoordeling van het effect van laminaire shear op bloedplaatjes en cel oppervlak receptoren. De specifieke representatieve resultaten hier te onderstrepen hoe de effecten van multimeric of bivalente liganden kunnen worden beïnvloed door shear flow. In aanvulling op deze toepassing, een uniforme shear assay heeft brede toepassingen in het observeren van shear-afhankelijke effecten. Bij afwezigheid van een bekend ligand-receptor paar, kan een unifor...

Mechanoreceptoren zijn eiwitten die reageren op mechanische prikkels, zoals druk of mechanische verstoring/vervorming. Voor sommige mechanoreceptoren, het ontdekken van deze mechanische verstoringen is expliciet aan de functie van de cel types waarin zij worden uitgedrukt. Neem, bijvoorbeeld, de rek receptoren in baroreceptor neuronen; Deze mechanosensitive ionenkanalen reguleren de bloeddruk door het ontdekken van vasculaire "stretch"1,2. In het binnenoor, ion kanalen op haarcellen detecteren mechanische vervormingen veroorzaakt door geluidsgolven3, en cutane lage drempel Mechanoreceptoren (LTMRs) vergemakkelijken de overdracht van tactiele informatie4. In andere gevallen, mechanoreceptoren verstrekken belangrijke informatie aan de cel voor de totstandbrenging van adhesie of de groei. De cellen kunnen de starheid van hun lokaal milieu voelen, en kunnen op samentrekbaar krachten via actine cytoskelet en integrines baseren om de groei of het uitspreiden te dicteren5,6.
Wanneer het bestuderen van receptor-ligand interactie in cel of weefsel-gebaseerde modellen, bestaan de gemeenschappelijke analyses die snel en nauwkeurig de gevolgen kunnen rapporteren van het veranderen van temperatuur, pH, ligand concentratie, tonicity, membraan potentieel, en veel andere parameters die kan variëren in vivo. Nochtans, kunnen deze zelfde analyses plotseling vallen wanneer het over het ontdekken van de bijdrage van mechanische kracht aan receptor activering komt. Of cellen zijn sensing hun micromilieu, het opsporen van geluidsgolven, of reageren op Stretch, een ding de bovengenoemde mechanoreceptoren gemeen hebben is dat ze deelnemen aan interacties waar de ligand, receptor, of beide, zijn verankerd aan een Oppervlak. De analyses die worden ontwikkeld om de gevolgen van mechanische krachten op receptor interactie te testen wijzen vaak op dit paradigma. Microfluidics en stromings kamers worden gebruikt om de effecten van shear flow op cellen en receptoren7,8te bestuderen. Dit soort experimenten hebben het voordeel van het toestaan van Fine-tuning van de shear rates via gevestigde stroomsnelheden. Andere technieken gebruiken fluorescente moleculaire sondes om krachten te ontdekken die door cellen op ligand-rijke oppervlakten worden toegepast, opbrengend een nauwkeurige uitlezing van de omvang en de richtlijnen van krachten betrokken bij interactie9,10.
In aanvulling op mechanosensation voorkomende waar een of beide partners zijn verankerd aan een oppervlak, shear stress kan van invloed zijn eiwitten en cellen in oplossing. Dit wordt vaak waargenomen in bloedcellen/proteïnen die constant in de omloop zijn, en kunnen zich via activering van mechanoreceptoren manifesteren die normaal oppervlakte-verankerd11, of door blootstelling van doel opeenvolgingen zijn die onder afgesloten zouden zijn statische voorwaarden12. Echter, relatief minder technieken assay de effecten van shear Force op deeltjes in oplossing. Sommige in-oplossing benaderingen introduceren shear via wervelende cellen in vloeibare suspensie met verschillende snelheden en duur, hoewel deze benaderingen niet mogelijk een zeer nauwkeurige bepaling van de shear stress gegenereerd. Rotatie viscometers maatregel viscositeit door toepassing van een specifieke shear kracht op vloeistoffen. Hierin beschrijven we een toegepaste methode voor het bepalen van het effect van specifieke laminaire shear tarieven op cellen of cel fragmenten in oplossing.
Een van de hoogst uitgedrukte eiwitten op het plaatoppervlak is het glycoproteïne (GP) IB-IX complex. GPIb-IX is de primaire receptor voor de plasma proteïne Von Willebrand factor (VWF). Samen is dit receptor-ligand paar al lang erkend als de fundering van de bloedplaatjes reactie op shear stress13. In het geval van vasculaire schade, VWF bindt aan blootgesteld collageen in de sub-endothelial matrix14, waardoor het werven van bloedplaatjes op de site van de schade via de VWF-GPIB-IX interactie. VWF engagement om haar bindende site in de GPIbα subeenheid als GPIb-IX onder fysiologische shear stress induceert ontvouwen van een membraan-proximale mechanosensory domein (MSD), die op zijn beurt activeert GPIb-IX15. In een recente studie hebben we aangetoond dat antilichamen tegen GPIbα, zoals die gegenereerd in veel immuun trombocytopenie (ITP) patiënten, zijn ook in staat het induceren van bloedplaatjes signalering via MSD ontvouwen onder shear stress11. Nochtans, in tegenstelling tot VWF, die shear-veroorzaakte GPIb-IX activering door het complex onder normale omloop te immobiliseren vergemakkelijkt, kunnen de bivalente antilichamen crosslink bloedplaatjes via GPIb-IX en de MSD in omloop openen. Op deze manier, een mechanoreceptor die normaal wordt geactiveerd door de oppervlakte immobilisatie onder shear kan worden geactiveerd in oplossing. In het onderhavige verslag, zullen we aantonen hoe een viscometer-gebaseerde uniform shear assay werd benut om de effecten van specifieke niveaus van shear stress op receptor activering in oplossing te detecteren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:764px;" width="764">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:413px;">APC anti-human CD62P (P-Selectin)</td>
			<td style="width:128px;">BioLegend</td>
			<td style="width:135px;">304910</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:413px;">Brookfield Cap 2000+ Viscometer</td>
			<td style="width:128px;">Brookfield</td>
			<td style="width:135px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL)</td>
			<td style="width:128px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:135px;">FL-1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pooled Normal Human Plasma</td>
			<td>Precision Biologic</td>
			<td>CCN-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:413px;">Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate)</td>
			<td style="width:128px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">369714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:413px;">Vacutainer Blood Collection Set, 21G x &#190;&#34; Needle</td>
			<td style="width:128px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">367287</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a uniform shear assay for human platelet and cell surface receptors via cone-plate viscometry

Vele biologische cellen/weefsels voelen de mechanische eigenschappen van hun lokale milieu's via mechanoreceptoren, proteïnen die aan krachten zoals druk of mechanische verstoringen kunnen antwoorden. Mechanoreceptoren detecteren hun stimuli en zenden signalen uit via een grote diversiteit aan mechanismen. Enkele van de meest voorkomende rollen voor mechanoreceptoren zijn in neuronale reacties, zoals aanraking en pijn, of haarcellen die functioneren in balans en gehoor. Mechanosensation is ook belangrijk voor cel types die regelmatig worden blootgesteld aan shear stress, zoals endothelial cellen, die lijn bloedvaten, of bloedcellen die shear ervaring in de normale circulatie. Viscometers zijn apparaten die de viscositeit van vloeistoffen te detecteren. Rotatie viscometers kan ook worden gebruikt om een bekende shear kracht toe te passen op vloeistoffen. Het vermogen van deze instrumenten om uniforme shear te voeren om vloeistoffen is geëxploiteerd om vele biologische vloeistoffen, waaronder bloed en plasma studie. Viscosimeter kan ook worden gebruikt om shear toe te passen op de cellen in een oplossing, en om de effecten van shear op specifieke ligand-receptor paren te testen. Hier gebruiken we Cone-plate viscosimeter om de effecten van endogene niveaus van shear stress testen op bloedplaatjes behandeld met antilichamen tegen de bloedplaatjes mechanosensory receptor complex GPIb-IX.

Figuur 1 schetst hoe de trigger model van GPIB-IX activering, in eerste instantie geïntroduceerd om shear-afhankelijke receptor activering verklaren wanneer verankerd aan de vaatwand, kan ook ondersteuning activering van bloedplaatjes kruisverwijzende door een multivalente ligand. Figuur 2 toont uitlezingen van menselijke bloedplaatjes activatie behandeld door twee antilichamen gericht op de N-Terminal domein van GPIB-IX (6B4 en 11A8), en een controle antilicha...

Watch this Scientific Journal Video about A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry at JoVE.com

A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry

Een uniform shear assay voor menselijke bloedplaatjes en cel oppervlakte receptoren via Cone-plate viscosimeter

We beschrijven een in-oplossing methode om uniforme shear toe te passen op bloedplaatjes oppervlak receptoren met behulp van Cone-plate viscosimeter. Deze methode kan ook breder worden gebruikt om shear toe te passen op andere cel types en cel-fragmenten en hoeft niet te richten op een specifieke ligand-receptor paar.

Many biological cells/tissues sense the mechanical properties of their local environments via mechanoreceptors, proteins that can respond to forces like ...

Dit protocol stelt ons in staat om een verscheidenheid aan vragen te beantwoorden over de manier waarop schuintrekken werkt op cellen in oplossing en biedt aanzienlijke controle over de schuifduur en -omvang. In tegenstelling tot andere technieken, die het effect van schuintrekken op cellen detecteren die geïmmobiliseerd zijn, stelt deze techniek ons in staat om afschuif op cellen in oplossing toe te passen en leent zich voor een spectrum van downstream signaaldetectiemethoden. Na het verkrijgen van perifeer bloed van een instemmende, gezonde volwassen donor in een 4,5-milliliter buis van 3,8% trinatriumcitraat, centrifugeer het bloed om bloedplaatjes-rijk plasma te verkrijgen, en gebruik een pipette tip gesneden in een hoek van 45 graden om zorgvuldig te verwijderen van de resulterende top, troebel, gele bloedplaatjes-rijke plasmalaag.Verkrijg het aantal bloedplaatjes via volledige bloedtelling en pas het aantal bloedplaatjes aan op ongeveer 2,5 keer 10 tot de vijfde bloedplaatjes per microliter met gepoold menselijk bloedplaatjesarm plasma. Plaats vervolgens de vering op 22 graden Celsius met zachte rotatie. Voor ligand behandeling, langzaam voeg het antilichaam of ligand van belang aan de bloedplaatjes-rijke plasma, en meng de bloedplaatjes zachtjes.Zet tijdens de incubatie de kegelplaatviscometer aan en stel de plaattemperatuur in op 22 graden Celsius. Breng na vijf tot tien minuten het behandelde bloedplaatjesrijke plasma direct in het midden van de plaat direct in het midden van de plaat over op de temperatuurgecontroleerde kegelplaatviscometer, waarbij u ervoor zorgt dat al het monster tussen de kegel en de plaat op het contactpunt wordt afgezet. Als u schuintrekken op het monster wilt aanbrengen, berekent u de schaar volgens de viscometerhandleiding en past u schuin op het monster toe met de juiste snelheid en duur.Til aan het einde van de toepassing de kegel ongeveer twee millimeter van de plaat, zodat het monster in contact blijft met zowel de plaat als de kegel, en gebruik een gel-loading pipettip om vijf tot 10 microliter uit het midden van het monstervolume te verzamelen. Vervolgens incubeer het afschuifde monster met antilichamen tegen de oppervlaktemarkers van belang gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur, en bevestig de monsters in 2%paraformaldehyde gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Om de monsters te analyseren door de stroom cytometrie, het verzamelen van ten minste 20,000 gebeurtenissen voor elke aandoening, en kwantificeren van de signaalsterkte van elke fluorescerende marker, met behulp van de hoogte waarde voor de intensiteit van elke fluorofophore.Gebruik vervolgens een negatieve controle met runderserum albumin of voertuig om een poort te tekenen, met uitzondering van negatieve achtergrond fluorescerende gebeurtenissen, en kwantificeren van het percentage gebeurtenissen in de poort voor alle experimentele omstandigheden. De activeringsmarkeringsexpressie van de bloedplaatje in reactie op de toepassing van de schuifkracht is niet-gereglementeerd op een tijdsafhankelijke manier. Hier worden representatieve uitlezingen van menselijke bloedplaatjesactivering weergegeven in aanwezigheid van twee antilichamen die gericht zijn op het N-terminale domein van glycoproteïne 1b-IX en één bestrijdingsantilichaam onder afschuifde en statische omstandigheden.De expressie van alle drie de activeringsmarkers werd aanzienlijk verhoogd in aanwezigheid van afschuifkrachten en gericht op antilichamen, in vergelijking met statische omstandigheden of in aanwezigheid van controleantilichamen. Met name de behandeling met antilichamen met een niet-bindend vermogen te laag om glycoproteïne 1b-IX-activering te activeren, leidt niet tot upregulatie van bloedplaatjesactivering onder statische of schuine krachtomstandigheden. Verder activeert plasma van immuuntrombocytoeniepatiënten die antilichamen tegen glycoproteïne 1b-IX bevatten, afschuifafhankelijke reacties in tegenstelling tot plasma van patiënten zonder glycoproteïne 1b-IX die zich richten op antilichamen.Naast flowcytometrische analyses kunnen cellen die zijn blootgesteld aan schuintrekken ook worden gelysed voor westelijke vlekken, ELISA en massa-spec analyse om eventuele veranderingen in eiwitniveau te bepalen. Zoals altijd, bij het gebruik van bloed of menselijke monsters, moet u de juiste beschermingsmiddelen dragen en volg het lab veiligheid en bloed geboren ziekteverwekker richtlijnen van uw instelling.

Research

JoVE Journal

Biology

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Een Chromatine Assay voor menselijk hersenweefsel

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate pHPL as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Voorbereiding van de gepoolde humane bloedplaatjes Lysate (pHPL) als een efficiënte Supplement voor Animal Serum-Free menselijke stamcellen culturen

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for ...

A &#946;-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay

A ÃƒÅ½Ã‚Â²-glucuronidase GUS Based Cell Death Assay

Een β-glucuronidase (GUS) Op basis Dood van de Cel Assay

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Aviditeit op basis van extracellulaire Interactie Screening (AVEXIS) voor de Scalable detectie van lage-affiniteit extracellulaire receptor-ligand interacties

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics

Glycopeptide Capture voor celoppervlak Proteomics

Cell surface proteins, including extracellular matrix proteins, participate in all major cellular processes and functions, such as growth, ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Visualiseren Clathrine-gemedieerde endocytose van G-proteïne gekoppelde receptoren bij Single-event resolutie via TIRF Microscopie

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Een methode voor het selecteren-Structure schakelen Aptameren Toegepast op een Colorimetric gouden nanodeeltjes Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

De Algemene Vergadering en de toepassing van &#39;Shear Rings&#39;: A Novel endotheliale Model voor Orbital, Unidirectionele en Periodieke Fluid Flow en Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Live-cel beeldvorming van bloedplaatjes Degranulatie en afscheiding onder stroming

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain RTA Trafficking in Yeast

Een eenvoudige fluorescentie gebaseerde verslaggever Assay identificatie van cellulaire bestanddelen die nodig zijn voor ricine toxine een keten (RTA) handel in gist

Bacterial and plant A/B toxins exploit the natural trafficking pathways in eukaryotic cells to reach their intracellular target(s) in the cytosol and to ...