Name: a uniform shear assay for human platelet and cell surface receptors via cone-plate viscometry
Uploaded: 2019-06-05T14:30:00
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Les travaux pertinents à cette étude ont été appuyés en partie par les instituts nationaux de santé (NIH) National Heart, Lung et Blood Institute octroie HL082808, HL123984 (R.L.) et F31HL134241 (M.E.Q.). Financement également fourni par l’Institut national des sciences médicales générales de la NIH Grant T32GM008367 (M.E.Q.); et les fonds de subvention pilote de Children’s Healthcare d’Atlanta et de l’Université Emory cytométrie en flux pédiatrique de base. Les auteurs aimeraient remercier le Dr Hans Deckmyn pour avoir partagé l’anticorps 6B4 et le centre de cytométrie en flux de l’Emory Children’s pédiatrique Center pour le support technique.

Toutes les méthodes utilisant des plaquettes humaines dérivées des donneurs décrites dans les présentes ont été approuvées par le Comité d’examen institutionnel de l’Université Emory/Children’s Healthcare d’Atlanta.
1. prélèvement sanguin et isolement plaquettaire
<ol><li>Prélever du sang humain de donneurs adultes sains consentants par ponction veineuse le jour de l’expérience en 3,8% de citrate trisodique. Un tube de sang de 4,5 mL est suffisant pour produire suffis...

<ol>
	<li>Sullivan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-voltage-gated+Ca2++influx+through+mechanosensitive+ion+channels+in+aortic+baroreceptor+neurons.">Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons.</a> Circulation Research. 80 (6), 861-867 (1997).</li><li>Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+stretch-activated+ion+channels+in+vascular+endothelial+cells+as+mechanotransducers.">Single stretch-activated ion channels in vascular endothelial cells as mechanotransducers.</a> Nature. 325 (6107), 811-813 (1987).</li><li>Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+Cell+Transduction,+Tuning,+and+Synaptic+Transmission+in+the+Mammalian+Cochlea.">Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea.</a> Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).</li><li>Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gentle+touch+receptors+of+mammalian+skin.">The gentle touch receptors of mammalian skin.</a> Science. 346 (6212), 950-954 (2014).</li><li>Nelson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+patterns+of+growth+controlled+by+multicellular+form+and+mechanics.">Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (33), 11594-11599 (2005).</li><li>Yu, C. H., Law, J. B., Suryana, M., Low, H. Y., Sheetz, M. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+3D+orientation+of+piconewton+integrin+traction+forces.">Mapping the 3D orientation of piconewton integrin traction forces.</a> Nature Methods. 15 (2), 115-118 (2018).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+modular+and+universal+single+molecule+tension+sensor+using+protein+G+to+study+mechano-sensitive+receptors.">Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors.</a> Scientific Reports. 6, 21584 (2016).</li><li>Quach, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc-independent+immune+thrombocytopenia+via+mechanomolecular+signaling+in+platelets.">Fc-independent immune thrombocytopenia via mechanomolecular signaling in platelets.</a> Blood. 131 (7), 787-796 (2018).</li><li>Cao, W., Krishnaswamy, S., Camire, R. M., Lenting, P. J., Zheng, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factor+VIII+accelerates+proteolytic+cleavage+of+von+Willebrand+factor+by+ADAMTS13.">Factor VIII accelerates proteolytic cleavage of von Willebrand factor by ADAMTS13.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105 (21), 7416-7421 (2008).</li><li>Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. 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A., Ortyn, W. E., Liang, L., Venkatachalam, V., Morrissey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+image+analysis+and+imaging+by+flow+cytometry.">Cellular image analysis and imaging by flow cytometry.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 27 (3), 653-670 (2007).</li><li>Quach, M. E., Chen, W., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+platelet+clearance+and+translation+to+improve+platelet+storage.">Mechanisms of platelet clearance and translation to improve platelet storage.</a> Blood. 131 (14), 1512-1521 (2018).</li></ol>

Le protocole décrit dans ce manuscrit permet une évaluation rapide et polyvalente de l’effet du cisaillement laminaire sur les récepteurs des plaquettes et des cellules de surface. Les résultats représentatifs spécifiques présentés ici soulignent comment les effets des ligands multimères ou bivalents peuvent être affectés par le flux de cisaillement. En plus de cette application, un essai de cisaillement uniforme a des applications larges dans l’observation des effets dépendant du cisaillement. En l’abs...

Les mécanorécepteurs sont des protéines qui réagissent aux stimuli mécaniques, tels que la pression ou la perturbation mécanique/déformation. Pour certains mécanorécepteurs, la détection de ces perturbations mécaniques est explicite à la fonction des types de cellules dans lesquels elles sont exprimées. Prenez, par exemple, les récepteurs extensibles dans les neurones barorécepteurs; ces canaux ioniques mécanosensibles régulent la tension artérielle en détectant le «Stretch» vasculaire1,2. Dans l’oreille interne, les canaux ioniques des cellules capillaires détectent les déformations mécaniques causées par les ondes sonores3, et les mécanorécepteurs à faible seuil cutané (LTM) facilitent la transmission d’informations tactiles4. Dans d’autres cas, les mécanorécepteurs fournissent des informations importantes à la cellule pour l’établissement de l’adhérence ou de la croissance. Les cellules peuvent sentir la rigidité de leur environnement local, et peuvent compter sur les forces contractiles par l’intermédiaire du cytosquelette d’actine et des intégrines pour dicter la croissance ou la propagation5,6.
Lors de l’étude des interactions récepteur-ligand dans des modèles cellulaires ou tissulaires, il existe des dosages communs qui peuvent rapidement et précisément rapporter les effets de la modification de la température, du pH, de la concentration du ligand, de la tonicité, du potentiel membranaire et de nombreux autres paramètres qui peuvent varier in vivo. Cependant, ces mêmes dosages peuvent être courts lorsqu’il s’agit de détecter la contribution de la force mécanique à l’activation des récepteurs. Si les cellules détectent leur microenvironnement, détectant des ondes sonores, ou répondant à l’étirement, une chose que les mécanorécepteurs susmentionnés ont en commun est qu’ils participent à des interactions où le ligand, récepteur, ou les deux, sont ancrés à un surface. Les essais mis au point pour tester les effets des forces mécaniques sur les interactions des récepteurs reflètent souvent ce paradigme. Microfluidics et les chambres de débit sont utilisés pour étudier les effets du flux de cisaillement sur les cellules et les récepteurs7,8. Ces types d’expériences ont l’avantage de permettre un réglage précis des taux de cisaillement par des vitesses de débit établies. D’autres techniques emploient des sondes moléculaires fluorescentes pour détecter les forces appliquées par les cellules sur des surfaces riches en ligands, donnant une lecture précise de l’amplitude et des orientations des forces impliquées dans l’interaction9,10.
En plus de la mécanosensation survenant lorsque l’un ou les deux partenaires sont ancrés sur une surface, la contrainte de cisaillement peut affecter les protéines et les cellules en solution. Ceci est souvent observé dans les cellules sanguines/protéines qui sont constamment dans la circulation, et peut se manifester par l’activation des mécanorécepteurs qui sont normalement ancrés en surface11, ou par l’exposition des séquences cibles qui seraient occlus sous conditions statiques12. Cependant, relativement moins de techniques d’essai des effets de la force de cisaillement sur les particules en solution. Certaines approches en solution introduisent le cisaillement par des cellules de Vortex dans la suspension de fluide avec des vitesses et des durées variables, bien que ces approches ne permettent pas une détermination très précise de la contrainte de cisaillement générée. Les Viscosimètres rotatifs mesurent la viscosité en appliquant une force de cisaillement spécifique aux fluides. Nous décrivons ici une méthode appliquée pour déterminer l’effet de taux de cisaillement laminaire spécifiques sur des cellules ou des fragments de cellules en solution.
L’une des protéines les plus fortement exprimées sur la surface plaquettaire est le complexe de glycoprotéine (GP) IB-IX. Le GPIb-IX est le principal récepteur de la protéine plasmatique von Willebrand Factor (VWF). Ensemble, cette paire récepteur-ligand a longtemps été reconnue comme le fondement de la réponse plaquettaire à la contrainte de cisaillement13. En cas de lésion vasculaire, la VWF se lie au collagène exposé dans la matrice Sub-endothéliale14, ce qui permet de recruter des plaquettes sur le site de la lésion par l’intermédiaire de l’interaction vWF-GPIB-IX. L’engagement de VWF sur son site de liaison dans la sous-unité GPIbα si GPIb-IX sous contrainte de cisaillement physiologique induit le déploiement d’un domaine mécanosensoriel membranaire proximal (MSD) qui à son tour active le GPIb-IX15. Dans une étude récente, nous avons montré que les anticorps dirigés contre le GPIbα, comme ceux générés chez de nombreux patients atteints de thrombocytopénie immunitaire (ITP), sont également capables d’induire la signalisation plaquettaire par le déploiement de MSD sous contrainte de cisaillement11. Cependant, contrairement à la VWF, qui facilite l’activation du GPIb-IX induite par le cisaillement en immobilisant le complexe sous une circulation normale, les anticorps bivalents sont capables de relier les plaquettes via GPIb-IX et de déplier les TMS en circulation. De cette façon, un mécanorécepteur qui est normalement activé par l’immobilisation de surface sous cisaillement peut être activé en solution. Dans le présent rapport, nous démontrerons comment un essai de cisaillement uniforme basé sur un viscosimètre a été exploité pour détecter les effets de niveaux spécifiques de contrainte de cisaillement sur l’activation des récepteurs en solution.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:764px;" width="764">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:413px;">APC anti-human CD62P (P-Selectin)</td>
			<td style="width:128px;">BioLegend</td>
			<td style="width:135px;">304910</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:413px;">Brookfield Cap 2000+ Viscometer</td>
			<td style="width:128px;">Brookfield</td>
			<td style="width:135px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL)</td>
			<td style="width:128px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:135px;">FL-1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pooled Normal Human Plasma</td>
			<td>Precision Biologic</td>
			<td>CCN-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:413px;">Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate)</td>
			<td style="width:128px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">369714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:413px;">Vacutainer Blood Collection Set, 21G x &#190;&#34; Needle</td>
			<td style="width:128px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">367287</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a uniform shear assay for human platelet and cell surface receptors via cone-plate viscometry

De nombreuses cellules/tissus biologiques sentent les propriétés mécaniques de leurs environnements locaux via des mécanorécepteurs, des protéines qui peuvent réagir à des forces telles que la pression ou des perturbations mécaniques. Les mécanorécepteurs détectent leurs stimuli et transmettent des signaux via une grande diversité de mécanismes. Certains des rôles les plus communs pour les mécanorécepteurs sont dans les réponses neuronales, comme le toucher et la douleur, ou les cellules capillaires qui fonctionnent dans l’équilibre et l’audition. La mécanosensation est également importante pour les types de cellules qui sont régulièrement exposés à des contraintes de cisaillement telles que les cellules endothéliales, qui alignent les vaisseaux sanguins, ou les cellules sanguines qui subissent un cisaillement en circulation normale. Les viscosimètres sont des dispositifs qui détectent la viscosité des fluides. Les Viscosimètres rotatifs peuvent également être utilisés pour appliquer une force de cisaillement connue aux fluides. La capacité de ces instruments à introduire un cisaillement uniforme aux fluides a été exploitée pour étudier de nombreux fluides biologiques, y compris le sang et le plasma. La viscométrie peut également être utilisée pour appliquer le cisaillement aux cellules dans une solution, et pour tester les effets du cisaillement sur des paires spécifiques de ligands-récepteurs. Ici, nous utilisons la viscométrie à plaques coniques pour tester les effets des niveaux endogènes de contrainte de cisaillement sur les plaquettes traitées avec des anticorps dirigés contre le complexe de récepteurs mécanosensoriaux plaquettaires GPIb-IX.

La figure 1 décrit comment le modèle déclencheur de l’activation du GPIB-IX, initialement introduit pour expliquer l’activation du récepteur dépendant du cisaillement lorsqu’il est ancré à la paroi du vaisseau, peut également soutenir l’activation de plaquettes croisées par un ligand multivalents. La figure 2 montre les lectures de l’activation plaquettaire humaine traitée par deux anticorps ciblant le domaine N-terminal du GPIB-IX (6B4 et 11...

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A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry

Un dosage de cisaillement uniforme pour les récepteurs plaquettaires et de surface cellulaires humains via la viscosimètre à plaques coniques

Nous décrivons une méthode en solution pour appliquer un cisaillement uniforme aux récepteurs de surface plaquettaire à l’aide de la viscosimètre à plaques coniques. Cette méthode peut également être utilisée plus largement pour appliquer le cisaillement à d’autres types de cellules et des fragments de cellules et n’a pas besoin de cibler une paire ligand-récepteur spécifique.

Many biological cells/tissues sense the mechanical properties of their local environments via mechanoreceptors, proteins that can respond to forces like ...

Ce protocole nous permet de répondre à une variété de questions sur la façon dont le cisaillement agit sur les cellules en solution et fournit un contrôle significatif sur la durée et l’ampleur du cisaillement. Contrairement à d’autres techniques, qui détectent l’effet du cisaillement sur les cellules immobilisées, cette technique nous permet d’appliquer le cisaillement aux cellules en solution et se prête à un spectre de méthodes de détection de signaux en aval. Après avoir obtenu le sang périphérique d’un donneur adulte consentant et en bonne santé dans un tube de 4,5 millilitres de citrate trisodique de 3,8 %, centrifugeuse du sang pour obtenir du plasma riche en plaquettes, et utiliser une pointe de pipette coupée à un angle de 45 degrés pour enlever soigneusement la couche plasmatique riche en plaquettes jaunes, nuageuse et en forme de plaquette jaune qui en résulte.Obtenez le nombre de plaquettes par dénombrement complet du sang et ajustez le nombre de plaquettes à environ 2,5 fois 10 à la cinquième plaquette par microlitre avec du plasma pauvre en plaquettes humaines en commun. Ensuite, placez la suspension à 22 degrés Celsius avec une rotation douce. Pour le traitement ligand, ajouter lentement l’anticorps ou ligand d’intérêt au plasma riche en plaquettes, et mélanger les plaquettes doucement.Pendant l’incubation, allumez le viscomètre de la plaque cène et réglez la température de la plaque à 22 degrés Celsius. Après cinq à dix minutes, transférer le plasma traité riche en plaquettes sur le viscomètre à plaque cène à température contrôlée directement au centre de la plaque, en prenant soin que tout l’échantillon soit déposé entre le cône et la plaque au point de contact. Pour appliquer le cisaillement sur l’échantillon, calculez le cisaillement selon le manuel du viscomètre et appliquez le cisaillement sur l’échantillon à la vitesse et à la durée appropriées.À la fin de l’application, soulevez le cône à environ deux millimètres de la plaque, de sorte que l’échantillon reste en contact avec la plaque et le cône, et utilisez une pointe de pipette de chargement de gel pour recueillir de cinq à dix microlitres à partir du centre du volume de l’échantillon. Ensuite, incuber l’échantillon cisaillement avec des anticorps contre les marqueurs de surface d’intérêt pendant 20 minutes à température ambiante, et fixer les échantillons en paraformaldéhyde de 2% pendant 20 minutes à température ambiante. Pour analyser les échantillons par cytométrie de débit, recueillir au moins 20 000 événements pour chaque condition, et quantifier la force du signal de chaque marqueur fluorescent, en utilisant la valeur de hauteur pour l’intensité de chaque fluorophore.Ensuite, utilisez un contrôle négatif avec de l’albumine de sérum bovin ou un véhicule pour dessiner une porte, à l’exclusion des événements fluorescents de fond négatifs, et quantifier le pourcentage d’événements à l’intérieur de la porte pour toutes les conditions expérimentales. L’expression du marqueur d’activation plaquettaire en réponse à l’application de la force de cisaillement n’est pas réglementée d’une manière dépendante du temps. Ici, des readouts représentatifs de l’activation humaine de plaquette en présence de deux anticorps ciblant le domaine N-terminal de glycoprotéine 1b-IX et d’un anticorps de contrôle dans des conditions cisaillées et statiques sont montrés.L’expression des trois marqueurs d’activation a été sensiblement augmentée en présence des forces de cisaillement et des anticorps de ciblage, comparés aux conditions statiques ou en présence des anticorps de contrôle. Notamment, le traitement par anticorps avec une force non contraignante trop faible pour déclencher l’activation de la glycoprotéine 1b-IX ne déclenche pas l’upregulation du marqueur d’activation plaquettaire dans des conditions statiques ou de force de cisaillement. En outre, le plasma des patients immunisés de thrombocytopenia contenant des anticorps contre la glycoprotéine 1b-IX déclenchent des réponses dépendantes de cisaillement en contraste avec le plasma des patients sans anticorps de ciblage de glycoprotéine 1b-IX.En plus des analyses flowcytométriques, les cellules qui ont été exposées au cisaillement peuvent également être lysées pour la tache occidentale, ELISA, et l’analyse de masse-spec pour déterminer n’importe quels changements dans le niveau de protéine. Comme toujours, lors de l’utilisation d’échantillons de sang ou d’échantillons humains, assurez-vous de porter l’équipement de protection approprié et de suivre les directives de sécurité de laboratoire et d’agent pathogène né dans le sang de votre établissement.

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