Name: a uniform shear assay for human platelet and cell surface receptors via cone-plate viscometry
Uploaded: 2019-06-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry at JoVE.com

העבודה הרלוונטית למחקר זה נתמכת בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות, ריאות ומכון הדם מענקים HL082808, HL123984 (ר), F31HL134241 (M.E.Q.). מימון שסופק גם על ידי NIH המכון הלאומי של מדעי הרפואה הכללית גרנט T32GM008367 (M.E.Q.); והטייס מענק כספים משירותי הבריאות של הילדים של אטלנטה ואוניברסיטת אמורי הזרמת ילדים ליבה. המחברים רוצים להודות ד ר הנס מורן על שיתוף הנוגדן 6B4, ואת הילדים אמורי המרכז לחקר הילד זרימת Cy, ליבת ליבה לתמיכה טכנית.

כל השיטות באמצעות טסיות האדם הנגזר התורם המתואר בזאת אושרו על ידי הלוח סקירה מוסדית של אוניברסיטת אמורי/הבריאות של הילדים של אטלנטה.
1. בידוד דם וטסיות
<ol><li>לצייר דם אנושי מתוך ההסכמה תורמים מבוגרים בריאים באמצעות הניקוב ביום הניסוי לתוך 3.8% trisodium ציטראט. אחד 4.5 mL של דם הוא מס?...

<ol>
	<li>Sullivan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-voltage-gated+Ca2++influx+through+mechanosensitive+ion+channels+in+aortic+baroreceptor+neurons.">Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons.</a> Circulation Research. 80 (6), 861-867 (1997).</li><li>Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+stretch-activated+ion+channels+in+vascular+endothelial+cells+as+mechanotransducers.">Single stretch-activated ion channels in vascular endothelial cells as mechanotransducers.</a> Nature. 325 (6107), 811-813 (1987).</li><li>Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+Cell+Transduction,+Tuning,+and+Synaptic+Transmission+in+the+Mammalian+Cochlea.">Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea.</a> Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).</li><li>Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gentle+touch+receptors+of+mammalian+skin.">The gentle touch receptors of mammalian skin.</a> Science. 346 (6212), 950-954 (2014).</li><li>Nelson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+patterns+of+growth+controlled+by+multicellular+form+and+mechanics.">Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (33), 11594-11599 (2005).</li><li>Yu, C. H., Law, J. B., Suryana, M., Low, H. Y., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+integrin+binding+to+Arg-Gly-Asp+peptide+activates+actin+polymerization+and+contractile+movement+that+stimulates+outward+translocation.">Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (51), 20585-20590 (2011).</li><li>Wen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shear-dependent+NO-cGMP-cGKI+cascade+in+platelets+acts+as+an+auto-regulatory+brake+of+thrombosis.">A shear-dependent NO-cGMP-cGKI cascade in platelets acts as an auto-regulatory brake of thrombosis.</a> Nature Communications. 9 (1), 4301 (2018).</li><li>Marki, A., Gutierrez, E., Mikulski, Z., Groisman, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+side+view+flow+chamber+reveals+tether-to-sling+transition+in+rolling+neutrophils.">Microfluidics-based side view flow chamber reveals tether-to-sling transition in rolling neutrophils.</a> Scientific Reports. 6, 28870 (2016).</li><li>Brockman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+3D+orientation+of+piconewton+integrin+traction+forces.">Mapping the 3D orientation of piconewton integrin traction forces.</a> Nature Methods. 15 (2), 115-118 (2018).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+modular+and+universal+single+molecule+tension+sensor+using+protein+G+to+study+mechano-sensitive+receptors.">Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors.</a> Scientific Reports. 6, 21584 (2016).</li><li>Quach, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc-independent+immune+thrombocytopenia+via+mechanomolecular+signaling+in+platelets.">Fc-independent immune thrombocytopenia via mechanomolecular signaling in platelets.</a> Blood. 131 (7), 787-796 (2018).</li><li>Cao, W., Krishnaswamy, S., Camire, R. M., Lenting, P. J., Zheng, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factor+VIII+accelerates+proteolytic+cleavage+of+von+Willebrand+factor+by+ADAMTS13.">Factor VIII accelerates proteolytic cleavage of von Willebrand factor by ADAMTS13.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105 (21), 7416-7421 (2008).</li><li>Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets+and+shear+stress.">Platelets and shear stress.</a> Blood. 88 (5), 1525-1541 (1996).</li><li>Pareti, F. I., Niiya, K., McPherson, J. M., Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+two+domains+of+human+von+Willebrand+factor+that+interact+with+fibrillar+collagen+types+I+and+III.">Isolation and characterization of two domains of human von Willebrand factor that interact with fibrillar collagen types I and III.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (28), 13835-13841 (1987).</li><li>Deng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+clearance+via+shear-induced+unfolding+of+a+membrane+mechanoreceptor.">Platelet clearance via shear-induced unfolding of a membrane mechanoreceptor.</a> Nature Communications. 7, 12863 (2016).</li><li>Ikeda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+von+Willebrand+factor+and+fibrinogen+in+platelet+aggregation+under+varying+shear+stress.">The role of von Willebrand factor and fibrinogen in platelet aggregation under varying shear stress.</a> Journal of Clinical Investigation. 87 (4), 1234-1240 (1991).</li><li>Westerhof, N., Stergiopulos, N., Noble, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Snapshots of hemodynamics: an aid for clinical research and graduate education. , (2010).</li><li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+of+ectodomain+shedding+of+glycoprotein+Ibalpha+by+targeting+its+juxtamembrane+shedding+cleavage+site.">Specific inhibition of ectodomain shedding of glycoprotein Ibalpha by targeting its juxtamembrane shedding cleavage site.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (12), 2155-2162 (2013).</li><li>Samsel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry+for+morphologic+and+phenotypic+characterization+of+rare+circulating+endothelial+cells.">Imaging flow cytometry for morphologic and phenotypic characterization of rare circulating endothelial cells.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (6), 379-389 (2013).</li><li>Basiji, D. A., Ortyn, W. E., Liang, L., Venkatachalam, V., Morrissey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+image+analysis+and+imaging+by+flow+cytometry.">Cellular image analysis and imaging by flow cytometry.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 27 (3), 653-670 (2007).</li><li>Quach, M. E., Chen, W., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+platelet+clearance+and+translation+to+improve+platelet+storage.">Mechanisms of platelet clearance and translation to improve platelet storage.</a> Blood. 131 (14), 1512-1521 (2018).</li></ol>

הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה מאפשר הערכה מהירה ומגוונת של ההשפעה של הטיית למינאר על טסיות דם וקולטני משטח התא. תוצאות הנציג הספציפיות המוצגות כאן מדגישים כיצד ההשפעות של מולטימאריק או ביונטי ליגנדס יכולות להיות מושפעות מזרימת הטיה. בנוסף ליישום זה, שיטת גזירה אחידה כוללת יישומים רחבים בהת...

מכניטורים הם חלבונים המגיבים לגירויים מכניים, כגון לחץ או עיוות מכני/דפורמציה. עבור חלק מהמכבשים, חישת הרטבאליות המכני הללו מפורשת לתפקוד סוגי התאים בהם הם מבוטאים. לקחת, למשל, קולטני למתוח ב baroreceptor נוירונים; אלה תעלות יון מכניתיים רגישות להסדיר לחץ דם על ידי חישת כלי דם "מתיחה"1,2. באוזן הפנימית, ערוצי יון על תאי השיער לזהות דפורמציות מכניות הנגרמת על ידי גלי קול3, ו מכני הסף נמוך המכונה מכונות (ltmrs) להקל על העברת מידע מישוש4. במקרים אחרים מספקים מכניקנים מידע חשוב לתא להקמת הדבקה או התפתחות. תאים יכולים לחוש קשיחות של הסביבה המקומית שלהם, והוא יכול להסתמך על כוחות הקונאקטאליה דרך שלד ציטוטין ואינטגרציה להכתיב צמיחה או התפשטות5,6.
כאשר לומדים קולטן-ליגונים ואינטראקציות בתא או רקמות מבוססי מודלים, שכיחות משותף קיים אשר יכול במהירות ובדייקנות לדווח את ההשפעות של שינוי טמפרטורה, pH, ליג, ריכוז, טונגניות, פוטנציאל הממברנה, ופרמטרים רבים אחרים שיכול להשתנות בvivo. עם זאת, אלה מספר שאומר עלול ליפול קצר כשמדובר לזהות את התרומה של כוח מכני כדי הפעלת הקולטן. אם התאים מחישה את הסביבה המיקרוקומבית שלהם, מזהה גלי קול או מגיבים למתיחה, דבר אחד שמשותף למכונה הזאת הוא שהם משתתפים באינטראקציות שבהן הליקטור, הקולטן או שניהם, מעוגנים ל שטח. Assays שפותחה כדי לבדוק את ההשפעות של כוחות מכניים על אינטראקציות הקולטן לעתים קרובות משקפים פרדיגמה זו. מיקרופלואידיקה ותאי הזרימה משמשים לחקר ההשפעות של הטיית זרימה על תאים וקולטנים7,8. סוגים אלה של ניסויים יש את היתרון של המאפשר כוונון עדין של שיעורי הטיה באמצעות מהירויות זרימה הוקמה. טכניקות אחרות להעסיק בדיקה מולקולרית פלורסנט כדי לזהות כוחות החלים על ידי תאים על משטחים ligand-עשיר, מניב בדיקה מדויקת של סדר הגודל והכיוונים של כוחות המעורבים באינטראקציה9,10.
בנוסף לתחושה המכונה היכן אחד או שניהם מעוגנים על פני השטח, הטיה לחץ עשוי להשפיע על חלבונים ותאים בתמיסה. זה נצפה לעתים קרובות בתאי הדם/חלבונים אשר כל הזמן במחזור, ועשוי להתבטא באמצעות הפעלה של מכונות מכונות כי הם בדרך כלל מעוגן משטח11, או באמצעות חשיפה של רצפי היעד אשר יהיה לחסימה תחת תנאים סטטיים12. עם זאת, טכניקות מעטות יחסית מאפשרות את ההשפעות של כוח ההטיה על חלקיקים בתמיסה. כמה גישות ב-פתרון להציג את ההטיה באמצעות תאים vortexing בהשעיה נוזל עם מהירויות שונות ומשכים, למרות גישות אלה לא יאפשר קביעה מדויקת מאוד של לחץ ההטיה שנוצר. מדידת צמיגות ברוטציה מדידה על ידי החלת כוח מסוים בהטיה לנוזלים. כאן אנו מתארים שיטה מיושמת לקביעת ההשפעה של שיעורי הטיה ספציפיים בתאים או שברי תאים בתמיסה.
אחד החלבונים המבוזרים ביותר על משטח הטסיות הוא מתחם גליקופרוטאין (GP) ליברות-IX. GPIb-IX הוא הקולטן העיקרי עבור חלבון הפלזמה פון Willebrand פקטור (VWF). יחד, זה קולטן-ליגניים וזוג כבר מוכר כבסיס של תגובת טסיות כדי להטות את הלחץ13. במקרה של נזק כלי דם, VWF נקשר קולגן חשוף במטריקס sub-אנדותל14, ובכך לגייס טסיות לאתר של פציעה באמצעות אינטראקציה Vwf-GPIb-IX. VWF מחויבות לאתר הכריכה שלה ביחידת המשנה GPIbα אם GPIb-IX תחת הלחץ הפיזיולוגי הטיה גורם התגלגלות של התחום המכונה המאובחושי הממברנה (MSD) אשר בתורו מפעיל GPIb-IX15. במחקר שנערך לאחרונה, הראינו כי נוגדנים נגד GPIbα, כמו אלה שנוצרו תרומבוציטופניה חיסונית רבים (ITP) חולים, הם גם מסוגלים לגרימת איתות טסיות באמצעות MSD התגלגלות תחת לחץ הטיה11. עם זאת, בניגוד VWF, אשר מקלה על גזירה המושרה GPIb-IX הפעלה על ידי ששתק את הקומפלקס תחת מחזור רגיל, הנוגדנים הדו בעלי היכולת להצליב טסיות באמצעות GPIb-IX ולהתפתח MSD במחזור הדם. בדרך זו, מתקן המופעל בדרך כלל על ידי הטיית פני השטח תחת הטיה ניתן להפעיל בתמיסה. בדוח הנוכחי, ניתן להדגים כיצד מבוסס על מדים מבוססי ומוח להטות את שיטת העבודה היה ממונפת כדי לזהות את ההשפעות של רמות ספציפיות של מתח הטיה על הפעלת הקולטן בפתרון.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:764px;" width="764">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:413px;">APC anti-human CD62P (P-Selectin)</td>
			<td style="width:128px;">BioLegend</td>
			<td style="width:135px;">304910</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:413px;">Brookfield Cap 2000+ Viscometer</td>
			<td style="width:128px;">Brookfield</td>
			<td style="width:135px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL)</td>
			<td style="width:128px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:135px;">FL-1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pooled Normal Human Plasma</td>
			<td>Precision Biologic</td>
			<td>CCN-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:413px;">Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate)</td>
			<td style="width:128px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">369714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:413px;">Vacutainer Blood Collection Set, 21G x &#190;&#34; Needle</td>
			<td style="width:128px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">367287</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a uniform shear assay for human platelet and cell surface receptors via cone-plate viscometry

תאים ביולוגיים רבים לחוש את התכונות המכאניות של הסביבה המקומית שלהם באמצעות מכנינים, חלבונים שיכולים להגיב לכוחות כמו לחץ או רטבאליות מכני. מכניקנים מזהים את הגירויים שלהם ומעבירים אותות באמצעות מגוון גדול של מנגנונים. חלק מן התפקידים השכיחים ביותר עבור מכניטורים הם בתגובות נוירואליות, כמו מגע וכאב, או תאי שיער הפועלים בשיווי משקל ושמיעה. המכונה גם חשובה עבור סוגי תאים אשר נחשפים באופן קבוע למתח הטיה כגון תאים אנדותל, אשר קו כלי דם, או תאי דם אשר חווים את ההטיה במחזור הרגיל. ויסברוטרס הם מכשירים המזהים את צמיגות הנוזלים. בנוסף, ניתן להשתמש בגומדי הסיבוב להחלת כוח הטיה ידוע על נוזלים. היכולת של מכשירים אלה כדי להחדיר הטיה אחיד לנוזלים נוצל ללמוד נוזלים ביולוגיים רבים, כולל דם פלזמה. בנוסף, ניתן להשתמש ב-ויסבנסה להחלת הטיה על התאים בפתרון, ולבדיקת השפעות ההטיה בזוגות מסוימים של ליגטיים ולקולטן. כאן, אנו מנצלים חרוט-צלחת ומנסה לבחון את ההשפעות של רמות אנדודוגני של לחץ הטיה על טסיות שטופלו עם נוגדנים נגד טסיות הדם מכונאי קולטן המכונה GPIb-IX.

איור 1 מתאר כיצד מודל ההדק של הפעלת GPIb-IX, בתחילה הציג כדי להסביר הפעלת הקולטן התלוי הטיה כאשר מעוגן לקיר כלי, יכול גם לתמוך הפעלה של טסיות המקושרות על ידי ליגנטי רב. איור 2 מציג את הקריאות של הפעלת טסיות הדם האנושית שטופלו על ידי שני נוגדנים מיקוד התחום N-מסוף ש...

Watch this Scientific Journal Video about A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry at JoVE.com

A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry

מדים להטות שיטת של טסיות האדם וקולטני פני שטח התא דרך קונוס-וזיקוק הלוח

אנו מתארים שיטה בפתרון כדי להחיל להטות אחיד כדי קולטני משטח טסיות באמצעות קונוס-צלחת ויסבנסה. ניתן להשתמש בשיטה זו גם באופן כללי יותר כדי להחיל הטיה על סוגי תאים אחרים ושברי תאים, ואין צורך לייעד זוג מסוים של ליגולי-קולטן.

Many biological cells/tissues sense the mechanical properties of their local environments via mechanoreceptors, proteins that can respond to forces like ...

פרוטוקול זה מאפשר לנו לענות על מגוון שאלות על האופן שבו ההגיה פועלת על תאים בפתרון ומספק שליטה משמעותית על משך ההגיה ועוצמתה. שלא כמו טכניקות אחרות, אשר לזהות את ההשפעה של גזירה על תאים משותקים, טכניקה זו מאפשרת לנו להחיל גזירה על תאים בתסרון ומשאיל את עצמו לספקטרום של שיטות זיהוי אותות במורד הזרם. לאחר קבלת דם היקפי מתורם מבוגר מסכים ובריא בצינור 4.5 מיליליטר של 3.8% טריסודיום ציטראט, צנטריפוגה הדם כדי להשיג פלזמה עשירה טסיות דם, ולהשתמש טיפ פיפטה לחתוך בזווית של 45 מעלות כדי להסיר בזהירות את החלק העליון, מעונן, שכבת פלזמה צהובה עשירה טסיות.להשיג את ספירת טסיות הדם באמצעות ספירת דם מלאה, ולהתאים את ספירת טסיות הדם כ 2.5 פעמים 10 כדי טסיות הדם החמישית למיקרוליטר עם טסיות אנושיות בריכה פלזמה עניים. לאחר מכן, מניחים את ההשעיה על 22 מעלות צלזיוס עם סיבוב עדין. לטיפול ליגנד, לאט להוסיף את הנוגדן או ligand של עניין פלזמה עשיר טסיות, ומערבבים את טסיות הדם בעדינות.במהלך הדגירה, הפעל את מד הקרביים של לוחית הקונוס, והגדר את טמפרטורת הלוח ל -22 מעלות צלזיוס. לאחר חמש עד 10 דקות, מעבירים את הפלזמה העשירה בטסיות דם מטופלות אל מד הקרביים של צלחת הקונוסים הנשלטת בטמפרטורה ישירות במרכז הצלחת, תוך טיפול כך שכל הדגימה מופקדת בין הקונוס לצלחת בנקודת המגע. כדי להחיל גזלה על המדגם, לחשב את ההלקיה על פי מדריך viscometer, ולהחיל גזלה על המדגם בקצב ובמשך המתאים.בסוף היישום, להרים את הקונוס על שני מילימטרים מהצלחת, כך המדגם נשאר במגע עם הלוח והן את הקונוס, ולהשתמש קצה צינור טעינת ג'ל כדי לאסוף חמישה עד 10 microliters ממרכז נפח המדגם. לאחר מכן להדגיר את המדגם גזירה עם נוגדנים נגד סמני פני השטח של עניין במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, ולתקן את הדגימות ב 2% paraformaldehyde במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. כדי לנתח את הדגימות לפי ציטומטריית זרימה, לאסוף לפחות 20,000 אירועים עבור כל מצב, ולכומת את עוצמת האות של כל סמן פלואורסצנטי, באמצעות ערך הגובה עבור עוצמת כל פלואורופור.לאחר מכן השתמש בשליטה שלילית עם אלבומין סרום בקר או רכב כדי לצייר שער, למעט אירועי פלואורסצנט רקע שליליים, ולכומת את אחוז האירועים בתוך השער עבור כל תנאי הניסוי. ביטוי סמן הפעלת טסיות דם בתגובה ליישום כוח ההטיה אינו מוסדר באופן תלוי זמן. כאן, קריאה ייצוגית של הפעלת טסיות דם אנושיות בנוכחות שני נוגדנים המכוונים לתחום N-terminal של גליקופרוטאין 1b-IX ונוגדן בקרה אחד בתנאים גזירה וסטטיים מוצגים.הביטוי של כל שלושת סמני ההפעלה הוגדל באופן משמעותי בנוכחות כוחות גזיר ונוגדנים ממוקדים, בהשוואה לתנאים סטטיים או בנוכחות נוגדני בקרה. יש לציין, טיפול בנוגדן עם כוח לא מחייב נמוך מדי כדי להפעיל הפעלת גליקופרוטאין 1b-IX אינו מפעיל סמן הפעלת טסיות דם upregulation תחת תנאים כוח סטטי או גזה. כמו כן, פלזמה מחולי תרומבוציטופניה חיסונית המכילה נוגדנים נגד גליקופרוטאין 1b-IX מפעילה תגובות תלויות גזה בניגוד לפלזמה מחולים ללא גליקופרוטאין 1b-IX מיקוד נוגדנים.בנוסף לניתוחים flowcytometric, תאים שנחשפו גימה יכול גם להיות lysed עבור כתם מערבי, ELISA, וניתוח מפרט מסה כדי לקבוע את כל השינויים ברמת החלבון. כמו תמיד, בעת שימוש בדם או דגימות אנושיות, הקפד ללבוש ציוד מגן תקין ופעל בהתאם לבטיחות המעבדה והנחיות פתוגן שנולדו בדם של המוסד שלך.

Research

JoVE Journal

Biology

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Assay הכרומטין של רקמת מוח האדם

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate pHPL as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

הכנת lysate משולב טסיות דם האדם (pHPL) כתוסף יעיל עבור בעלי חיים סרום ללא בתרביות תאים האדם גזע

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for ...

A &#946;-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay

A ÃƒÅ½Ã‚Â²-glucuronidase GUS Based Cell Death Assay

Β-glucuronidase (גאס) נייד מבוסס מוות Assay

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

הלהיטות מבוסס אינטראקציה הקרנת תאיים (AVEXIS) לאיתור Scalable זיקה נמוכה קולטן ליגנד אינטראקציות תאיים

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics

Glycopeptide לכידת לפרוטאומיקה פני התא

Cell surface proteins, including extracellular matrix proteins, participate in all major cellular processes and functions, such as growth, ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

חזותי אנדוציטוזה בתיווך clathrin של רצפטורים מצמידים חלבון G בהחלטה חד אירוע באמצעות TIRF מיקרוסקופית

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

שיטה לבחירת Aptamers מיתוג מבנה יישומית לColorimetric זהב Nanoparticle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

האסיפה והיישום של &#39;טבעות Shear&#39;: מודל האנדותל חדשני Orbital, חד-כיוונית תקופתית נוזלי זרימת מתח שאר

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Live-cell הדמיה של degranulation טסיות והפרשה תחת זרימה

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain RTA Trafficking in Yeast

וזמינותו כתב המבוסס על ידי קרינה פלואורסצנטית פשוט לזהות את מרכיבי התא הדרושות רעלן ריצין שרשרת (RTA) סחר בבני אדם שמרים

Bacterial and plant A/B toxins exploit the natural trafficking pathways in eukaryotic cells to reach their intracellular target(s) in the cytosol and to ...