Name: a uniform shear assay for human platelet and cell surface receptors via cone-plate viscometry
Uploaded: 2019-06-05T14:30:00
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I lavori pertinenti a questo studio sono stati sostenuti in parte dagli istituti nazionali di sanità (NIH) National Heart, Lung e Blood Institute, che concede HL082808, HL123984 (R.L.) e F31HL134241 (M.E.Q.). Finanziamento fornito anche da NIH National Institute of General Medical Sciences Grant T32GM008367 (M.E.Q.); e i fondi di sovvenzione pilota da Children ' s Healthcare di Atlanta e Emory University Pediatric Flow citometria nucleo. Gli autori vorrebbero ringraziare il dottor Hans Deckmyn per aver condiviso l'anticorpo 6B4, e il nucleo di citometria a flusso del centro di ricerca pediatrica Emory Children ' s per il supporto tecnico.

Tutti i metodi che utilizzano le piastrine umane derivate dal donatore qui descritte sono stati approvati dal comitato di revisione istituzionale della Emory University/Children ' s Healthcare di Atlanta.
1. prelievo di sangue e isolamento piastrinico
<ol><li>Attirare il sangue umano dal consenso dei donatori adulti sani attraverso la venipuntura il giorno dell'esperimento in 3,8% citrato trisodico. Un 4,5 mL di tubo di sangue è sufficiente a produrre abbastanza plasma ricco di piastrine (P...

<ol>
	<li>Sullivan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-voltage-gated+Ca2++influx+through+mechanosensitive+ion+channels+in+aortic+baroreceptor+neurons.">Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons.</a> Circulation Research. 80 (6), 861-867 (1997).</li><li>Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+stretch-activated+ion+channels+in+vascular+endothelial+cells+as+mechanotransducers.">Single stretch-activated ion channels in vascular endothelial cells as mechanotransducers.</a> Nature. 325 (6107), 811-813 (1987).</li><li>Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+Cell+Transduction,+Tuning,+and+Synaptic+Transmission+in+the+Mammalian+Cochlea.">Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea.</a> Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).</li><li>Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+3D+orientation+of+piconewton+integrin+traction+forces.">Mapping the 3D orientation of piconewton integrin traction forces.</a> Nature Methods. 15 (2), 115-118 (2018).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+modular+and+universal+single+molecule+tension+sensor+using+protein+G+to+study+mechano-sensitive+receptors.">Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors.</a> Scientific Reports. 6, 21584 (2016).</li><li>Quach, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc-independent+immune+thrombocytopenia+via+mechanomolecular+signaling+in+platelets.">Fc-independent immune thrombocytopenia via mechanomolecular signaling in platelets.</a> Blood. 131 (7), 787-796 (2018).</li><li>Cao, W., Krishnaswamy, S., Camire, R. M., Lenting, P. J., Zheng, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factor+VIII+accelerates+proteolytic+cleavage+of+von+Willebrand+factor+by+ADAMTS13.">Factor VIII accelerates proteolytic cleavage of von Willebrand factor by ADAMTS13.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105 (21), 7416-7421 (2008).</li><li>Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. 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A., Ortyn, W. E., Liang, L., Venkatachalam, V., Morrissey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+image+analysis+and+imaging+by+flow+cytometry.">Cellular image analysis and imaging by flow cytometry.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 27 (3), 653-670 (2007).</li><li>Quach, M. E., Chen, W., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+platelet+clearance+and+translation+to+improve+platelet+storage.">Mechanisms of platelet clearance and translation to improve platelet storage.</a> Blood. 131 (14), 1512-1521 (2018).</li></ol>

Il protocollo descritto in questo manoscritto consente una valutazione rapida e versatile dell'effetto della cesoia laminare sui recettori della superficie piastrinica e cellulare. I risultati rappresentativi specifici presentati qui sottolineano come gli effetti dei ligandi multimerica o bivalenti possono essere influenzati dal flusso di taglio. Oltre a questa applicazione, un saggio di taglio uniforme ha ampie applicazioni nell'osservare gli effetti di taglio-dipendente. In assenza di una coppia di recettori ligando co...

I meccanorecettori sono proteine che rispondono agli stimoli meccanici, come la pressione o la perturbazione meccanica/deformazione. Per alcuni meccanorecettori, il rilevamento di queste perturbazioni meccaniche è esplicito alla funzione dei tipi di cellule in cui sono espressi. Prendete, per esempio, i recettori elasticizzati nei neuroni barorecettori; questi canali ionici meccanosensibili regolano la pressione sanguigna rilevando il "tratto" vascolare1,2. Nell'orecchio interno, i canali ionici sulle cellule dei capelli rilevano deformazioni meccaniche causate da onde sonore3e i meccanorecettori a soglia bassa cutanea (ltmrs) facilitano la trasmissione delle informazioni tattili4. In altri casi, i meccanorecettori forniscono informazioni importanti alla cellula per la creazione di adesione o crescita. Le cellule possono percepire la rigidità del loro ambiente locale e possono contare su forze contrattili tramite il citoscheletro e le integrine actina per dettare la crescita o la diffusione di5,6.
Studiando le interazioni recettore-ligando in modelli cellulari o basati su tessuti, esistono saggi comuni che possono segnalare in modo rapido e accurato gli effetti dell'alterazione della temperatura, del pH, della concentrazione di ligando, della tonicità, del potenziale di membrana e di molti altri parametri che possono variare in vivo. Tuttavia, questi stessi saggi possono cadere in breve quando si tratta di rilevare il contributo della forza meccanica all'attivazione del recettore. Se le cellule stanno rilevando il loro microambiente, rilevando onde sonore o rispondendo a stiramento, una cosa che i suddetti meccanorecettori hanno in comune è che partecipano a interazioni in cui il ligando, recettore, o entrambi, sono ancorati a un superficie. I saggi sviluppati per testare gli effetti delle forze meccaniche sulle interazioni dei recettori spesso riflettono questo paradigma. Microfluidica e camere di flusso sono utilizzati per studiare gli effetti del flusso di taglio su cellule e recettori7,8. Questi tipi di esperimenti hanno il vantaggio di consentire la messa a punto dei tassi di taglio tramite velocità di flusso consolidate. Altre tecniche impiegano sonde molecolari fluorescenti per rilevare le forze applicate dalle cellule su superfici ricche di ligando, ottenendo una lettura accurata della grandezza e degli orientamenti delle forze coinvolte nell'interazione9,10.
Oltre alla meccanosensazione che si verifica quando uno o entrambi i partner sono ancorati ad una superficie, lo stress da taglio può influenzare le proteine e le cellule in soluzione. Questo è spesso osservato nelle cellule del sangue/proteine che sono costantemente in circolazione, e può manifestarsi tramite l'attivazione di meccanorecettori che sono normalmente ancorati in superficie11, o attraverso l'esposizione di sequenze bersaglio che sarebbero occlusi sotto condizioni statiche12. Tuttavia, relativamente meno tecniche di saggio gli effetti della forza di taglio sulle particelle in soluzione. Alcuni approcci in-Solution introducono il taglio attraverso le cellule Vortex in sospensione fluida con velocità e durate variabili, anche se questi approcci potrebbero non consentire una determinazione molto precisa della sollecitazione di taglio generata. I viscosimetri rotazionali misurano la viscosità applicando una forza di taglio specifica ai fluidi. Qui descriviamo un metodo applicato per determinare l'effetto di specifiche velocità di taglio laminare su cellule o frammenti di cellule in soluzione.
Una delle proteine più altamente espresse sulla superficie piastrinica è il complesso di glicoproteina (GP) IB-IX. GPIb-IX è il recettore primario per la proteina plasmatica von Willebrand Factor (VWF). Insieme, questa coppia recettore-ligante è stata a lungo riconosciuta come il fondamento della risposta piastrinica alla sollecitazione di taglio13. In caso di danno vascolare, il VWF si lega al collagene esposto nella matrice sub-endoteliale14, reclutando così le piastrine nel sito di lesione tramite l'interazione VWF-GPIb-IX. Il coinvolgimento del VWF nel suo sito di legame nella subunità GPIbα se GPIb-IX sotto stress di taglio fisiologico induce lo svolgimento di un dominio meccanosensoriale prossimale (MSD) a membrana, che a sua volta attiva GPIb-IX15. In uno studio recente, abbiamo dimostrato che gli anticorpi contro il GPIbα, come quelli generati in molti pazienti affetti da trombocitopenia immunitaria (ITP), sono anche in grado di indurre la segnalazione piastrinica tramite MSD che si sta svolgendo sotto sforzo di taglio11. Tuttavia, a differenza di VWF, che facilita l'attivazione di GPIb-IX indotta da taglio immobilizzando il complesso in normali condizioni di circolazione, gli anticorpi bivalenti sono in grado di Crosslink piastrine tramite GPIb-IX e dispiegano la MSD in circolazione. In questo modo, un meccanorecettore che viene normalmente attivato dall'immobilizzazione superficiale sotto il taglio può essere attivato in soluzione. Nella presente relazione, dimostreremo come è stato sfruttato un saggio di taglio uniforme basato su un viscosimetro per rilevare gli effetti di specifici livelli di stress da taglio sull'attivazione del recettore in soluzione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:764px;" width="764">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:413px;">APC anti-human CD62P (P-Selectin)</td>
			<td style="width:128px;">BioLegend</td>
			<td style="width:135px;">304910</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:413px;">Brookfield Cap 2000+ Viscometer</td>
			<td style="width:128px;">Brookfield</td>
			<td style="width:135px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL)</td>
			<td style="width:128px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:135px;">FL-1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pooled Normal Human Plasma</td>
			<td>Precision Biologic</td>
			<td>CCN-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:413px;">Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate)</td>
			<td style="width:128px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">369714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:413px;">Vacutainer Blood Collection Set, 21G x &#190;&#34; Needle</td>
			<td style="width:128px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">367287</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a uniform shear assay for human platelet and cell surface receptors via cone-plate viscometry

Molte cellule/tessuti biologici percepiscono le proprietà meccaniche dei loro ambienti locali tramite meccanorecettori, proteine che possono rispondere alle forze come la pressione o le perturbazioni meccaniche. I meccanorecettori rilevano i loro stimoli e trasmettono segnali attraverso una grande varietà di meccanismi. Alcuni dei ruoli più comuni per i meccanorecettori sono nelle risposte neuronali, come il tatto e il dolore, o le cellule dei capelli che funzionano in equilibrio e udito. La meccanosensazione è anche importante per i tipi di cellule che sono regolarmente esposti a stress da taglio come le cellule endoteliali, che linea vasi sanguigni, o cellule del sangue che sperimentano il taglio in circolazione normale. I viscosimetri sono dispositivi che rilevano la viscosità dei fluidi. I viscosimetri rotazionali possono essere utilizzati anche per applicare una forza di taglio nota ai fluidi. La capacità di questi strumenti di introdurre un taglio uniforme ai fluidi è stata sfruttata per studiare molti fluidi biologici, tra cui sangue e plasma. La viscometria può anche essere utilizzata per applicare il taglio alle cellule in una soluzione e per testare gli effetti del taglio su specifiche coppie del recettore del Ligano. Qui, usiamo la viscometria cono-piastra per testare gli effetti dei livelli endogeni di stress da taglio sulle piastrine trattate con anticorpi contro il complesso recettore meccanosensoriale piastrinica GPIb-IX.

La Figura 1 illustra come il modello di trigger dell'attivazione di GPIb-IX, inizialmente introdotto per spiegare l'attivazione del recettore dipendente dal taglio quando ancorato alla parete del vaso, può anche supportare l'attivazione di piastrine incrociate da un ligando multivalente. La Figura 2 Mostra letture dell'attivazione piastrinica umana trattate da due anticorpi che si rivolgono al dominio N-terminale di GPIB-IX (6B4 e 11A8) e un anticorpo di contro...

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A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry

Un saggio di taglio uniforme per piastrine umane e recettori superficiali delle cellule tramite viscometria conica

Descriviamo un metodo in-Solution per applicare un taglio uniforme ai recettori della superficie piastrinica utilizzando la viscometria a piastra conica. Questo metodo può anche essere utilizzato in modo più ampio per applicare il taglio ad altri tipi di cellule e frammenti di cellule e non è necessario indirizzare una coppia specifica del recettore ligare.

Many biological cells/tissues sense the mechanical properties of their local environments via mechanoreceptors, proteins that can respond to forces like ...

Questo protocollo ci consente di rispondere a una varietà di domande sul modo in cui il taglio agisce sulle cellule in soluzione e fornisce un controllo significativo sulla durata e l'entità del taglio. A differenza di altre tecniche, che rilevano l'effetto del taglio sulle cellule immobilizzate, questa tecnica ci consente di applicare il taglio alle cellule in soluzione e si presta a uno spettro di metodi di rilevamento del segnale a valle. Dopo aver ottenuto sangue periferico da un donatore adulto sano e consenzioso in un tubo da 4,5 millilitri di citrato trisodico al 3,8%, centrifugare il sangue per ottenere plasma ricco di piastrine e utilizzare una punta di pipetta tagliata con un angolo di 45 gradi per rimuovere con cura lo strato plasmatico superiore, torbido e giallo ricco di piastrine risultante.Ottenere il conteggio piastrinica tramite l'ettaro completo e regolare il conteggio delle piastrine a circa 2,5 volte 10 alla quinta piastrine per microlitro con plasma a base di piastrine umane in pool. Quindi, posizionare la sospensione a 22 gradi Celsius con una rotazione delicata. Per il trattamento del ligando, aggiungere lentamente l'anticorpo o il ligando di interesse al plasma ricco di piastrine e mescolare delicatamente le piastrine.Durante l'incubazione, accendere il viscometer a cono e impostare la temperatura della piastra a 22 gradi Celsius. Dopo cinque o 10 minuti, trasferire il plasma trattato ricco di piastrine sul viscometer a cono controllato a temperatura direttamente al centro della piastra, facendo attenzione che tutto il campione sia depositato tra il cono e la piastra nel punto di contatto. Per applicare la cesoia al campione, calcolare la cesoia in base al manuale viscometer e applicare la cesoia al campione alla velocità e alla durata appropriate.Al termine dell'applicazione, sollevare il cono a circa due millimetri dalla piastra, in modo che il campione rimanga a contatto sia con la piastra che con il cono, e utilizzare una punta della pipetta a caricamento in gel per raccogliere da cinque a 10 microlitri dal centro del volume del campione. Quindi incubare il campione tranciato con anticorpi contro i marcatori superficiali di interesse per 20 minuti a temperatura ambiente e fissare i campioni in paraformaldeide al 2% per 20 minuti a temperatura ambiente. Per analizzare i campioni per citometria di flusso, raccogliere almeno 20.000 eventi per ogni condizione e quantificare la potenza del segnale di ogni marcatore fluorescente, utilizzando il valore di altezza per l'intensità di ogni fluoroforo.Quindi utilizzare un controllo negativo con albumina di siero bovino o veicolo per disegnare un cancello, esclusi gli eventi fluorescenti di sfondo negativi, e quantificare la percentuale di eventi all'interno del cancello per tutte le condizioni sperimentali. L'espressione del marcatore di attivazione piastrinica in risposta all'applicazione della forza di taglio non è regolamentata in modo dipendente dal tempo. Qui vengono mostrate letture rappresentative dell'attivazione piastrinica umana in presenza di due anticorpi mirati al dominio N-terminale della glicoproteina 1b-IX e di un anticorpo di controllo in condizioni tranciate e statiche.L'espressione di tutti e tre i marcatori di attivazione è stata significativamente aumentata in presenza di forze di taglio e anticorpi mirati, rispetto alle condizioni statiche o in presenza di anticorpi di controllo. In particolare, il trattamento con anticorpi con una forza non vincolante troppo bassa per innescare l'attivazione della glicoproteina 1b-IX non innesca l'upregolazione del marcatore di attivazione piastrinica in condizioni statiche o di forza di taglio. Inoltre, il plasma proveniente da pazienti con trombocitopenia immunitaria contenente anticorpi contro la glicoproteina 1b-IX innesca risposte dipendenti dal taglio in contrasto con il plasma da pazienti senza glicoproteina 1b-IX che prendono di mira anticorpi.Oltre alle analisi flowcitometriche, le cellule che sono state esposte al taglio possono anche essere lese per l'analisi western blot, ELISA e mass-spec per determinare eventuali cambiamenti nel livello proteico. Come sempre, quando si utilizzano campioni di sangue o umani, assicurarsi di indossare dispositivi di protezione adeguati e seguire le linee guida sulla sicurezza del laboratorio e sugli agenti patogeni nati dal sangue del tuo istituto.

Research

JoVE Journal

Biology

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Ricerca

Biologia

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