Name: a uniform shear assay for human platelet and cell surface receptors via cone-plate viscometry
Uploaded: 2019-06-05T14:30:00
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O trabalho pertinente a este estudo foi apoiado em parte pelos institutos nacionais de saúde (NIH) National Heart, Lung e Blood Institute concede HL082808, HL123984 (R.L.), e F31HL134241 (M.E.Q.). Financiamento também fornecido pelo NIH National Institute of General Medical Sciences Grant T32GM008367 (M.E.Q.); e fundos de subvenção piloto da Children ' s Healthcare de Atlanta e Emory Universidade pediátrica fluxo cytometry Core. Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Hans Deckmyn por compartilhar o anticorpo 6B4 e o núcleo de citometria de fluxo pediátrico do Emory Children ' s Center para suporte técnico.

Todos os métodos que utilizam plaquetas humanas derivadas de doadores aqui descritos foram aprovados pelo Conselho de revisão institucional da Emory University/Children ' s Healthcare of Atlanta.
1. tração do sangue e isolação da plaqueta
<ol><li>Desenhe sangue humano de doadores adultos saudáveis consentantes via punção venosa no dia do experimento em 3,8% de citrato trisódico. Um tubo de 4,5 mL de sangue é suficiente para produzir bastante plasma rico em plaquetas (PRP) para 20-...

<ol>
	<li>Sullivan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-voltage-gated+Ca2++influx+through+mechanosensitive+ion+channels+in+aortic+baroreceptor+neurons.">Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons.</a> Circulation Research. 80 (6), 861-867 (1997).</li><li>Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+stretch-activated+ion+channels+in+vascular+endothelial+cells+as+mechanotransducers.">Single stretch-activated ion channels in vascular endothelial cells as mechanotransducers.</a> Nature. 325 (6107), 811-813 (1987).</li><li>Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+Cell+Transduction,+Tuning,+and+Synaptic+Transmission+in+the+Mammalian+Cochlea.">Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea.</a> Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).</li><li>Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+integrin+binding+to+Arg-Gly-Asp+peptide+activates+actin+polymerization+and+contractile+movement+that+stimulates+outward+translocation.">Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (51), 20585-20590 (2011).</li><li>Wen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shear-dependent+NO-cGMP-cGKI+cascade+in+platelets+acts+as+an+auto-regulatory+brake+of+thrombosis.">A shear-dependent NO-cGMP-cGKI cascade in platelets acts as an auto-regulatory brake of thrombosis.</a> Nature Communications. 9 (1), 4301 (2018).</li><li>Marki, A., Gutierrez, E., Mikulski, Z., Groisman, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+side+view+flow+chamber+reveals+tether-to-sling+transition+in+rolling+neutrophils.">Microfluidics-based side view flow chamber reveals tether-to-sling transition in rolling neutrophils.</a> Scientific Reports. 6, 28870 (2016).</li><li>Brockman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+3D+orientation+of+piconewton+integrin+traction+forces.">Mapping the 3D orientation of piconewton integrin traction forces.</a> Nature Methods. 15 (2), 115-118 (2018).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+modular+and+universal+single+molecule+tension+sensor+using+protein+G+to+study+mechano-sensitive+receptors.">Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors.</a> Scientific Reports. 6, 21584 (2016).</li><li>Quach, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc-independent+immune+thrombocytopenia+via+mechanomolecular+signaling+in+platelets.">Fc-independent immune thrombocytopenia via mechanomolecular signaling in platelets.</a> Blood. 131 (7), 787-796 (2018).</li><li>Cao, W., Krishnaswamy, S., Camire, R. M., Lenting, P. J., Zheng, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factor+VIII+accelerates+proteolytic+cleavage+of+von+Willebrand+factor+by+ADAMTS13.">Factor VIII accelerates proteolytic cleavage of von Willebrand factor by ADAMTS13.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105 (21), 7416-7421 (2008).</li><li>Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets+and+shear+stress.">Platelets and shear stress.</a> Blood. 88 (5), 1525-1541 (1996).</li><li>Pareti, F. I., Niiya, K., McPherson, J. M., Ruggeri, Z. 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A., Ortyn, W. E., Liang, L., Venkatachalam, V., Morrissey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+image+analysis+and+imaging+by+flow+cytometry.">Cellular image analysis and imaging by flow cytometry.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 27 (3), 653-670 (2007).</li><li>Quach, M. E., Chen, W., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+platelet+clearance+and+translation+to+improve+platelet+storage.">Mechanisms of platelet clearance and translation to improve platelet storage.</a> Blood. 131 (14), 1512-1521 (2018).</li></ol>

O protocolo descrito neste manuscrito permite uma avaliação rápida e versátil do efeito da cisalhamento laminar nos receptores de plaquetas e de superfície celular. Os resultados representativos específicos aqui apresentados sublinham como os efeitos dos ligantes multiméricos ou bivalentes podem ser afetados pelo fluxo de cisalhamento. Além desta aplicação, um ensaio de cisalhamento uniforme tem amplas aplicações na observação de efeitos de cisalhamento-dependentes. Na ausência de um par conhecido do ligan...

Os mecanoreceptores são proteínas que respondem a estímulos mecânicos, como pressão ou perturbação mecânica/deformação. Para alguns mecanoreceptores, a detecção dessas perturbações mecânicas é explícita à função dos tipos de células em que são expressas. Tome, por exemplo, os receptores do estiramento em neurônios do barorreceptor; Estas canaletas mechanosensitive do íon regulam a pressão sanguínea detectando o "estiramento vascular"1,2. Na orelha interna, os canais iônicos nas células ciliadas detectam deformações mecânicas causadas por ondas sonoras3, e os mecanoreceptores cutâneos de baixo limiar (ltmrs) facilitam a transmissão da informação tátil4. Em outros casos, os mecanorreceptores fornecem a informação importante à pilha para o estabelecimento da adesão ou do crescimento. As pilhas podem sentir a rigidez de seu ambiente local, e podem confiar em forças contrátil através do citoesqueleto e das integrinas do actina para ditar o crescimento ou a propagação5,6.
Ao estudar as interações receptor-ligante em modelos celulares ou tecidos, existem ensaios comuns que podem relatar com rapidez e precisão os efeitos da alteração da temperatura, pH, concentração de ligantes, tonicidade, potencial de membrana e muitos outros parâmetros que pode variar in vivo. No entanto, esses mesmos ensaios podem ficar curtos quando se trata de detectar a contribuição da força mecânica para a ativação do receptor. Se as células estão sentindo seu microambiente, detectando ondas sonoras, ou respondendo a esticar, uma coisa que os mecanoreceptores acima mencionados têm em comum é que eles estão participando de interações onde o ligand, receptor, ou ambos, estão ancorados a um Superfície. Os ensaios desenvolvidos para testar os efeitos das forças mecânicas nas interações dos receptores freqüentemente refletem esse paradigma. Microfluínicos e câmaras de fluxo são usados para estudar os efeitos do fluxo de cisalhamento em células e receptores7,8. Estes tipos de experimentos têm a vantagem de permitir o ajuste fino das taxas de cisalhamento através de velocidades de fluxo estabelecidas. Outras técnicas empregam sondas moleculares fluorescentes para detectar forças aplicadas pelas células em superfícies ricas em ligantes, produzindo uma leitura acurada da magnitude e orientações das forças envolvidas na interação9,10.
Além do que o mechanosensation que ocorre onde um ou ambos os sócios são ancorados a uma superfície, a tensão de cisalhamento pode afetar proteínas e pilhas na solução. Isto é muitas vezes observado em células sanguíneas/proteínas que estão constantemente na circulação, e pode manifestar-se através da ativação de mecanoreceptors que normalmente são ancorados na superfície11, ou através da exposição de sequências-alvo que seriam fechadas condições estáticas12. No entanto, relativamente menos técnicas de ensaio os efeitos da força de cisalhamento sobre as partículas em solução. Algumas abordagens em solução introduzem cisalhamento através de células vortexing em suspensão fluida com velocidades e durações variadas, embora essas abordagens não permitam uma determinação muito precisa do estresse de cisalhamento gerado. Os Viscosímetros rotatórios medem a viscosidade aplicando uma força de tesoura específica aos líquidos. Nisto nós descrevemos um método aplicado para determinar o efeito de taxas laminar específicas da tesoura em pilhas ou em fragmentos da pilha na solução.
Uma das proteínas mais altamente expressas na superfície plaquetária é o complexo de glicoproteína (GP) IB-IX. O GPIb-IX é o principal receptor da proteína plasmática de von Willebrand factor (fvw). Junto, este par do receptor-ligand tem sido reconhecido por muito tempo como a Fundação da resposta da plaqueta ao esforço de cisalhamento13. Em caso de dano vascular, o fvw se liga ao colágeno exposto na matriz subendotelial14, recrutando assim plaquetas para o local de lesão por meio da interação VWF-GPIB-IX. Engajamento do VWF em seu local de ligação na subunidade GPIbα se GPIb-IX estresse fisiológico de cisalhamento induz o desdobramento de um domínio mecanosensorial membrana-proximal (MSD) que, por sua vez, ativa o GPIb-IX15. Em um estudo recente, nós mostramos que os anticorpos de encontro a GPIbα, como aqueles gerados em muitos pacientes do thrombocytopenia imune (ITP), são igualmente capazes de induzir a sinalização da plaqueta através do desdobramento de MSD o esforço de cisalhamento11. No entanto, diferentemente do fvw, que facilita a ativação do GPIb-IX induzida por cisalhamento ao imobilizar o complexo circulação normal, os anticorpos bivalentes são capazes de ligar as plaquetas através do GPIb-IX e desdobrar a MSD em circulação. Desta maneira, um Mecanorreceptor que seja ativado normalmente pela imobilização de superfície a tesoura pode ser ativado na solução. No presente relato, demonstraremos como um ensaio de cisalhamento uniforme baseado em viscosímetro foi aproveitado para detectar os efeitos de níveis específicos de estresse de cisalhamento na ativação do receptor em solução.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:764px;" width="764">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:413px;">APC anti-human CD62P (P-Selectin)</td>
			<td style="width:128px;">BioLegend</td>
			<td style="width:135px;">304910</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:413px;">Brookfield Cap 2000+ Viscometer</td>
			<td style="width:128px;">Brookfield</td>
			<td style="width:135px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL)</td>
			<td style="width:128px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:135px;">FL-1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pooled Normal Human Plasma</td>
			<td>Precision Biologic</td>
			<td>CCN-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:413px;">Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate)</td>
			<td style="width:128px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">369714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:413px;">Vacutainer Blood Collection Set, 21G x &#190;&#34; Needle</td>
			<td style="width:128px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">367287</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a uniform shear assay for human platelet and cell surface receptors via cone-plate viscometry

Muitas células/tecidos biológicos sentem as propriedades mecânicas de seus ambientes locais através de mecanoreceptors, proteínas que podem responder a forças como pressão ou perturbações mecânicas. Os mechanoreceptors detectam seus estímulos e transmitem sinais através de uma grande diversidade de mecanismos. Alguns dos papéis os mais comuns para mecanorreceptores estão em respostas neuronal, como o toque e a dor, ou as pilhas de cabelo que funcionam no contrapeso e na audição. O mechanosensation é igualmente importante para os tipos da pilha que são expostos regularmente ao esforço de cisalhamento tal como pilhas endothelial, que alinham os vasos sanguíneos, ou as pilhas de sangue que experimentam a tesoura na circulação normal. Os viscometers são dispositivos que detectam a viscosidade dos líquidos. Os Viscosímetros rotatórios podem igualmente ser usados para aplicar uma força de tesoura conhecida aos líquidos. A capacidade destes instrumentos para introduzir a tesoura uniforme aos líquidos foi explorada para estudar muitos líquidos biológicos que incluem o sangue e o plasma. O viscometry pode igualmente ser usado para aplicar a tesoura às pilhas em uma solução, e para testar os efeitos da tesoura em pares específicos do ligand-receptor. Aqui, utilizamos o viscosimetria da cone-placa para testar os efeitos de níveis endógenos de tensão de cisalhamento em plaquetas tratadas com anticorpos contra o complexo do receptor mecanosensorial plaquetária GPIB-IX.

A Figura 1 descreve como o modelo de gatilho da ativação do GPIB-IX, inicialmente introduzido para explicar a ativação do receptor dependente de cisalhamento quando ancorado na parede do vaso, também pode suportar a ativação de plaquetas reticuladas por um ligante multivalente. A Figura 2 mostra leituras de Ativação plaquetária humana tratadas por dois anticorpos direcionados ao domínio N-terminal de GPIB-IX (6b4 e 11A8) e um anticorpo controle (IgG n...

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A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry

Um ensaio de cisalhamento uniforme para receptores de superfície de células e plaquetas humanas através de Viscometry de cone-Plate

Nós descrevemos um método da em-solução para aplicar a tesoura uniforme aos receptores de superfície da plaqueta usando o viscometry da cone-placa. Esse método também pode ser usado de forma mais ampla para aplicar cisalhamento a outros tipos de células e fragmentos de células e não precisa direcionar um par de receptor de ligante específico.

Many biological cells/tissues sense the mechanical properties of their local environments via mechanoreceptors, proteins that can respond to forces like ...

Este protocolo nos permite responder a uma variedade de perguntas sobre a forma como a tesoura age sobre as células na solução e fornece um controle significativo sobre a duração e a magnitude da tesoura. Ao contrário de outras técnicas, que detectam o efeito da tesoura nas células que são imobilizadas, essa técnica nos permite aplicar tesoura às células em solução e se presta a um espectro de métodos de detecção de sinal a jusante. Depois de obter sangue periférico de um doador adulto saudável e consentido em um tubo de 4,5 mililitros de citrato de trissódico de 3,8%, centrífugas no sangue para obter plasma rico em plaquetas e usar uma ponta de pipeta cortada em um ângulo de 45 graus para remover cuidadosamente a camada de plasma superior, nublada e amarela rica em plaquetas.Obtenha a contagem de plaquetas através da contagem completa de plaquetas, e ajuste a contagem de plaquetas para aproximadamente 2,5 vezes 10 para as quintas plaquetas por microliter com plasma de plaquetas humanas agrupadas. Em seguida, coloque a suspensão a 22 graus Celsius com rotação suave. Para o tratamento de ligas, adicione lentamente o anticorpo ou ligante de interesse ao plasma rico em plaquetas, e misture as plaquetas suavemente.Durante a incubação, ligue o viscometro de placa de cone e coloque a temperatura da placa em 22 graus Celsius. Após cinco a 10 minutos, transfira o plasma rico em plaquetas tratadas para o viscometro de placa de cone controlado pela temperatura diretamente no centro da placa, tomando cuidado para que toda a amostra seja depositada entre o cone e a placa no ponto de contato. Para aplicar a tesoura na amostra, calcule a tesoura de acordo com o manual do viscotômetro e aplique a tesoura na amostra na taxa e duração apropriadas.No final da aplicação, retire o cone cerca de dois milímetros da placa, de modo que a amostra permaneça em contato com a placa e o cone, e use uma ponta de pipeta de carregamento de gel para coletar de cinco a dez microliters do centro do volume da amostra. Em seguida, incubar a amostra com anticorpos contra os marcadores de interesse da superfície por 20 minutos à temperatura ambiente, e fixar as amostras em 2% de paraformaldeído por 20 minutos à temperatura ambiente. Para analisar as amostras por citometria de fluxo, coletar pelo menos 20.000 eventos para cada condição e quantificar a força do sinal de cada marcador fluorescente, utilizando o valor de altura para a intensidade de cada fluoróforo.Em seguida, use um controle negativo com albumina ou veículo de soro bovino para desenhar um portão, excluindo eventos fluorescentes de fundo negativos, e quantificar a porcentagem de eventos dentro do portão para todas as condições experimentais. A expressão do marcador de ativação plaquetária em resposta à aplicação da força de tesoura não é regulamentada de forma dependente do tempo. Aqui, leituras representativas da ativação de plaquetas humanas na presença de dois anticorpos voltados para o domínio n-terminal de glicoproteína 1b-IX e um anticorpo de controle sob condições de tesoura e estática são mostrados.A expressão dos três marcadores de ativação foi significativamente aumentada na presença de forças de tesoura e anticorpos de alvo, em comparação com condições estáticas ou na presença de anticorpos de controle. Notavelmente, o tratamento com anticorpos com uma força desvinculada muito baixa para desencadear a ativação da glicoproteína 1b-IX não desencadeia a regulação do marcador de ativação plaquetária sob condições estáticas ou de força de tesoura. Além disso, o plasma de pacientes imuno-trombocitopenia contendo anticorpos contra glicoproteína 1b-IX desencadeiam respostas dependentes de tesoura em contraste com o plasma de pacientes sem glicoproteína 1b-IX visando anticorpos.Além das análises flucittométricas, as células expostas à cisalhamento também podem ser lícitas para a análise de manchas ocidentais, ELISA e análise de espectro de massa para determinar quaisquer alterações no nível da proteína. Como sempre, ao usar amostras de sangue ou humanos, certifique-se de usar equipamentos de proteção adequados e seguir as diretrizes de segurança do laboratório e do patógeno nascido no sangue de sua instituição.

Research

JoVE Journal

Biology

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Biologia

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Preparation of Pooled Human Platelet Lysate pHPL as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

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