Name: a uniform shear assay for human platelet and cell surface receptors via cone-plate viscometry
Uploaded: 2019-06-05T14:30:00
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El trabajo pertinente a este estudio fue apoyado en parte por los institutos nacionales de salud (NIH) del Instituto Nacional del corazón, los pulmones y la sangre otorga HL082808, HL123984 (R.L.), y F31HL134241 (M.E.Q.). Los fondos también proporcionados por el Instituto Nacional de ciencias médicas generales de NIH otorgan T32GM008367 (M.E.Q.); y fondos de becas piloto de children's Healthcare of Atlanta y la citometría de flujo pediátrica de la Universidad Emory Core. A los autores les gustaría agradecer al Dr. Hans Deckmyn por compartir el anticuerpo 6B4, y el centro de investigación pediátrica de la citometría de flujo de Emory children's para soporte técnico.

Todos los métodos que utilizan plaquetas humanas derivadas de donantes descritos en el presente documento fueron aprobados por la Junta de revisión institucional de la Universidad Emory/children's Healthcare de Atlanta.
1. extraer sangre y aislamiento plaquetario
<ol><li>Extraer sangre humana del consentimiento de donantes adultos sanos a través de la venopunción en el día del experimento en citrato de trisodio al 3,8%. Un tubo de 4,5 mL de sangre es suficiente para producir suficiente ...

<ol>
	<li>Sullivan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-voltage-gated+Ca2++influx+through+mechanosensitive+ion+channels+in+aortic+baroreceptor+neurons.">Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons.</a> Circulation Research. 80 (6), 861-867 (1997).</li><li>Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+stretch-activated+ion+channels+in+vascular+endothelial+cells+as+mechanotransducers.">Single stretch-activated ion channels in vascular endothelial cells as mechanotransducers.</a> Nature. 325 (6107), 811-813 (1987).</li><li>Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+Cell+Transduction,+Tuning,+and+Synaptic+Transmission+in+the+Mammalian+Cochlea.">Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea.</a> Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).</li><li>Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+3D+orientation+of+piconewton+integrin+traction+forces.">Mapping the 3D orientation of piconewton integrin traction forces.</a> Nature Methods. 15 (2), 115-118 (2018).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+modular+and+universal+single+molecule+tension+sensor+using+protein+G+to+study+mechano-sensitive+receptors.">Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors.</a> Scientific Reports. 6, 21584 (2016).</li><li>Quach, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc-independent+immune+thrombocytopenia+via+mechanomolecular+signaling+in+platelets.">Fc-independent immune thrombocytopenia via mechanomolecular signaling in platelets.</a> Blood. 131 (7), 787-796 (2018).</li><li>Cao, W., Krishnaswamy, S., Camire, R. M., Lenting, P. J., Zheng, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factor+VIII+accelerates+proteolytic+cleavage+of+von+Willebrand+factor+by+ADAMTS13.">Factor VIII accelerates proteolytic cleavage of von Willebrand factor by ADAMTS13.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105 (21), 7416-7421 (2008).</li><li>Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets+and+shear+stress.">Platelets and shear stress.</a> Blood. 88 (5), 1525-1541 (1996).</li><li>Pareti, F. I., Niiya, K., McPherson, J. M., Ruggeri, Z. 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A., Ortyn, W. E., Liang, L., Venkatachalam, V., Morrissey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+image+analysis+and+imaging+by+flow+cytometry.">Cellular image analysis and imaging by flow cytometry.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 27 (3), 653-670 (2007).</li><li>Quach, M. E., Chen, W., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+platelet+clearance+and+translation+to+improve+platelet+storage.">Mechanisms of platelet clearance and translation to improve platelet storage.</a> Blood. 131 (14), 1512-1521 (2018).</li></ol>

El protocolo descrito en este manuscrito permite una evaluación rápida y versátil del efecto de la cizalla laminar sobre los receptores de las plaquetas y de la superficie celular. Los resultados representativos específicos presentados aquí subrayan cómo los efectos de los ligandos multiméricos o bivalentes pueden verse afectados por el flujo de cizallamiento. Además de esta aplicación, un ensayo de cizallamiento uniforme tiene amplias aplicaciones en la observación de efectos que dependen de la cizalla. En aus...

Los mecánicos son proteínas que responden a estímulos mecánicos, como la presión o la perturbación/deformación mecánica. Para algunos mecánicos, la detección de estas perturbaciones mecánicas es explícita a la función de los tipos de células en las que se expresan. Tomar, por ejemplo, los receptores de estiramiento en las neuronas barorreceptora; estos canales de iones mecanosensibles regulan la presión arterial por detección vascular "estiramiento"1,2. En el oído interno, los canales de iones en las células ciliadas detectan las deformaciones mecánicas causadas por las ondas sonoras3, y los mecánicos de bajo umbral cutáneo (ltmrs) facilitan la transmisión de la información táctil4. En otros casos, los mecánicos proporcionan información importante a la célula para el establecimiento de la adherencia o el crecimiento. Las células pueden percibir la rigidez de su entorno local, y pueden depender de fuerzas contráctiles a través del citoesqueleto de actina e integrinas para dictar crecimiento o propagación de5,6.
Cuando se estudian interacciones receptor-ligando en modelos basados en células o tejidos, existen ensayos comunes que pueden reportar de forma rápida y precisa los efectos de alterar la temperatura, el pH, la concentración de ligando, la tonicidad, el potencial de la membrana y muchos otros parámetros que pueden variar en vivo. Sin embargo, estos mismos ensayos pueden caer corto cuando se trata de detectar la contribución de la fuerza mecánica a la activación del receptor. Ya sea que las células detectan su microambiente, detecten ondas sonoras o respondan al estiramiento, una cosa que los mecánicos antes mencionados tienen en común es que están participando en interacciones donde el ligando, receptor, o ambos, están anclados a un Superficie. Los ensayos desarrollados para probar los efectos de las fuerzas mecánicas en las interacciones del receptor a menudo reflejan este paradigma. Las cámaras de flujo y microfluidos se utilizan para estudiar los efectos del flujo de cizallamiento en las células y los receptores7,8. Estos tipos de experimentos tienen la ventaja de permitir el ajuste fino de las tasas de cizallamiento a través de velocidades de flujo establecidas. Otras técnicas emplean sondas moleculares fluorescentes para detectar las fuerzas aplicadas por las células en superficies ricas en ligando, produciendo una lectura precisa de la magnitud y las orientaciones de las fuerzas involucradas en la interacción9,10.
Además de la mecanosensación que ocurre cuando uno o ambos socios están anclados a una superficie, el estrés cortante puede afectar las proteínas y las células en solución. Esto se observa a menudo en las células sanguíneas/proteínas que están constantemente en la circulación, y puede manifestarse a través de la activación de los mecánicos que normalmente están anclados en la superficie11, o a través de la exposición de las secuencias de destino que sería ocludido bajo condiciones estáticas12. Sin embargo, relativamente menos técnicas de ensayo de los efectos de la fuerza de cizallamiento en partículas en solución. Algunos enfoques en la solución introducen la cizalla a través de las células de vórtex en la suspensión de fluidos con diferentes velocidades y duraciones, aunque estos enfoques pueden no permitir una determinación muy precisa de la tensión de cizallamiento generada. Los viscosítros rotatorios miden la viscosidad aplicando una fuerza de cizallamiento específica a los fluidos. Aquí describimos un método aplicado para determinar el efecto de las tasas de cizallamiento laminar específicas en las células o fragmentos celulares en solución.
Una de las proteínas más altamente expresadas en la superficie de las plaquetas es el complejo IB-IX de glicoproteína (GP). GPIb-IX es el receptor primario de la proteína plasmática von Willebrand factor (FWF). Juntos, este par receptor-ligand ha sido reconocido durante mucho tiempo como la base de la respuesta plaquetaria a la tensión de cizallamiento13. En caso de daño vascular, el VWF se une al colágeno expuesto en la matriz sub-endotelial14, reclutando así las plaquetas en el sitio de la lesión a través de la interacción vWF-GPIB-IX. La participación del VWF en su sitio de Unión en la subunidad GPIbα si el GPIb-IX bajo tensión fisiológica de cizallamiento induce el despliegue de un dominio mecanosensorial de membrana proximal (MSD) que a su vez activa el GPIb-IX15. En un estudio reciente, hemos demostrado que los anticuerpos contra el GPIbα, como los generados en muchos pacientes con trombocitopenia inmunitaria (PTI), también son capaces de inducir la señalización plaquetaria vía MSD desplegando bajo tensión de cizallamiento11. Sin embargo, a diferencia del VWF, que facilita la activación inducida por cizalla GPIb-IX ininmovilizando el complejo bajo circulación normal, los anticuerpos bivalentes son capaces de unir las plaquetas a través de GPIb-IX y desplegar el MSD en circulación. De esta manera, un mecánico que normalmente se activa por inmovilización superficial bajo cizalla se puede activar en solución. En el presente informe, demostraremos cómo se aprovechó un ensayo de cizallamiento uniforme basado en viscómetro para detectar los efectos de niveles específicos de tensión de cizallamiento en la activación del receptor en la solución.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:764px;" width="764">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:413px;">APC anti-human CD62P (P-Selectin)</td>
			<td style="width:128px;">BioLegend</td>
			<td style="width:135px;">304910</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:413px;">Brookfield Cap 2000+ Viscometer</td>
			<td style="width:128px;">Brookfield</td>
			<td style="width:135px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL)</td>
			<td style="width:128px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:135px;">FL-1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pooled Normal Human Plasma</td>
			<td>Precision Biologic</td>
			<td>CCN-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:413px;">Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate)</td>
			<td style="width:128px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">369714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:413px;">Vacutainer Blood Collection Set, 21G x &#190;&#34; Needle</td>
			<td style="width:128px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">367287</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a uniform shear assay for human platelet and cell surface receptors via cone-plate viscometry

Muchas células/tejidos biológicos detectan las propiedades mecánicas de sus ambientes locales a través de mecánicos, proteínas que pueden responder a fuerzas como la presión o perturbaciones mecánicas. Los mecánicos detectan sus estímulos y transmiten señales a través de una gran diversidad de mecanismos. Algunas de las funciones más comunes para los mecánicos son las respuestas neuronales, como el tacto y el dolor, o las células ciliadas que funcionan en el equilibrio y la audición. La mechanosensation también es importante para los tipos celulares que se exponen regularmente a la tensión de cizallamiento como las células endoteliales, que la línea de los vasos sanguíneos, o células sanguíneas que experimentan cizalla en la circulación normal. Los viscometers son dispositivos que detectan la viscosidad de los fluidos. Los viscosítros rotatorios también se pueden utilizar para aplicar una fuerza de cizallamiento conocida a los fluidos. La capacidad de estos instrumentos para introducir una cizalla uniforme en los fluidos ha sido explotada para estudiar muchos fluidos biológicos, incluyendo sangre y plasma. Viscometry también se puede utilizar para aplicar cizallamiento a las células en una solución, y para probar los efectos de la cizalla en pares de ligando-receptores específicos. Aquí, utilizamos viscometría de placa cónica para probar los efectos de los niveles endógenos de estrés por cizallamiento en las plaquetas tratadas con anticuerpos contra el complejo de receptores mecanosensoriales plaquetarios GPIB-IX.

La figura 1 describe cómo el modelo desencadenante de activación del GPIB-IX, inicialmente introducido para explicar la activación del receptor dependiente de la cizalla cuando se ancla a la pared del recipiente, también puede apoyar la activación de plaquetas reticuladas por un ligando multivalente. La figura 2 muestra lecturas de la activación plaquetaria humana tratadas por dos anticuerpos dirigidos al dominio N-terminal de GPIB-IX (6B4 y 11A8), y un an...

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A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry

Un ensayo de cizalla uniforme para los receptores humanos de plaquetas y de superficie celular a través de Viscometry de placa cónica

Describimos un método en solución para aplicar una cizalla uniforme a los receptores de superficie plaquetaria usando viscometry de placa cónica. Este método también se puede utilizar más ampliamente para aplicar cizallamiento a otros tipos de células y fragmentos de células y no necesita apuntar a un par de ligando-receptor específico.

Many biological cells/tissues sense the mechanical properties of their local environments via mechanoreceptors, proteins that can respond to forces like ...

Este protocolo nos permite responder a una variedad de preguntas sobre la forma en que el cizallamiento actúa sobre las células en la solución y proporciona un control significativo sobre la duración y magnitud del cizallamiento. A diferencia de otras técnicas, que detectan el efecto del cizallamiento en las células que están inmovilizadas, esta técnica nos permite aplicar cizallamiento a las células en solución y se presta a un espectro de métodos de detección de señal aguas abajo. Después de obtener sangre periférica de un donante adulto sano y consentidos en un tubo de 4,5 mililitros de citrato trisódico al 3,8%, centrifugar la sangre para obtener plasma rico en plaquetas y utilice una punta de pipeta cortada en un ángulo de 45 grados para eliminar cuidadosamente la capa plasmática superior, turbia y rica en plaquetas resultante.Obtenga el recuento de plaquetas a través del hemograma completo y ajuste el recuento de plaquetas a aproximadamente 2,5 veces 10 a la quinta plaqueta por microlitro con plasma pobre en plaquetas humanas agrupados. A continuación, coloque la suspensión a 22 grados centígrados con una rotación suave. Para el tratamiento del ligando, agregue lentamente el anticuerpo o ligando de interés al plasma rico en plaquetas, y mezcle las plaquetas suavemente.Durante la incubación, encienda el viscosímetro de placa de cono y ajuste la temperatura de la placa a 22 grados celsius. Después de cinco a 10 minutos, transfiera el plasma rico en plaquetas tratado al viscosímetro de placa de cono controlado por temperatura directamente en el centro de la placa, teniendo cuidado de que toda la muestra se deposite entre el cono y la placa en el punto de contacto. Para aplicar la cizalladura a la muestra, calcule la cizalla de acuerdo con el manual del viscosímetro y aplique la cizalla a la muestra a la velocidad y duración adecuadas.Al final de la aplicación, levante el cono a unos dos milímetros de la placa, de modo que la muestra permanezca en contacto tanto con la placa como con el cono, y utilice una punta de pipeta de carga en gel para recoger de cinco a 10 microlitros del centro del volumen de la muestra. A continuación, incubar la muestra cizallada con anticuerpos contra los marcadores superficiales de interés durante 20 minutos a temperatura ambiente, y fijar las muestras en 2%paraformaldehído durante 20 minutos a temperatura ambiente. Para analizar las muestras por citometría de flujo, recoja al menos 20.000 eventos para cada condición y cuantifique la intensidad de la señal de cada marcador fluorescente, utilizando el valor de altura para la intensidad de cada fluoróforo.A continuación, utilice un control negativo con albúmina sérica bovina o vehículo para dibujar una puerta, excluyendo los eventos fluorescentes de fondo negativos, y cuantificar el porcentaje de eventos dentro de la puerta para todas las condiciones experimentales. La expresión del marcador de activación plaquetaria en respuesta a la aplicación de fuerza de cizallamiento no está regulada en función del tiempo. Aquí, se muestran lecturas representativas de la activación de plaquetas humanas en presencia de dos anticuerpos dirigidos al dominio N-terminal de la glicoproteína 1b-IX y un anticuerpo de control en condiciones estáticas y cizalladas.La expresión de los tres marcadores de activación se incrementó significativamente en presencia de fuerzas de cizallamiento y anticuerpos dirigidos, en comparación con condiciones estáticas o en presencia de anticuerpos de control. En particular, el tratamiento con anticuerpos con una fuerza de unión demasiado baja para desencadenar la activación de la glicoproteína 1b-IX no desencadena la regulación de la regulación del marcador de activación plaquetaria en condiciones estáticas o de fuerza cortante. Además, el plasma de pacientes con trombocitopenia inmune que contiene anticuerpos contra la glicoproteína 1b-IX desencadena respuestas dependientes del cizallamiento en contraste con el plasma de pacientes sin glicoproteína 1b-IX dirigido a anticuerpos.Además de los análisis flowcitométricos, las células que han estado expuestas a la cizalladura también se pueden utilizar para el análisis de manchas occidentales, ELISA y especificaciones de masa para determinar cualquier cambio en el nivel de proteína. Como siempre, cuando utilice sangre o muestras humanas, asegúrese de usar el equipo de protección adecuado y siga las pautas de seguridad de laboratorio y patógenos nacidos en la sangre de su institución.

Research

JoVE Journal

Biology

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Un ensayo de la cromatina de tejido cerebral humano

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Investigación

Biología

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate pHPL as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Preparación de combinados lisado plaquetario humano (pHPL) como un suplemento eficaz de los animales libres de suero humano culturas de células madre

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for ...

A &#946;-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay

A ÃƒÅ½Ã‚Â²-glucuronidase GUS Based Cell Death Assay

A β-glucuronidasa (GUS), basada en células de ensayo Muerte

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Avidez detección basada en la interacción extracelular (AVEXIS) para la detección escalable de extracelular de baja afinidad interacciones ligando-receptor

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics

Captura Glicopéptido Proteómica Superficie Celular

Cell surface proteins, including extracellular matrix proteins, participate in all major cellular processes and functions, such as growth, ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Visualización de endocitosis mediada por clatrina de G receptores acoplados a proteínas en la Resolución Individual de eventos a través de TIRF de Microscopía

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Un método para la selección de aptámeros Estructura de conmutación Aplicado a una de nanopartículas de oro ensayo colorimétrico

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

La Asamblea y la Aplicación de &#39;Shear Anillos&#39;: A Novel endotelial Modelo de Orbital, unidireccional y periódica flujo de fluido y la tensión de cizallamiento

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Imágenes de células vivas de desgranulación plaquetaria y secreción bajo flujo

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain RTA Trafficking in Yeast

Un análisis Simple reportero basado en fluorescencia para identificar los componentes celulares necesarios para la toxina de ricina una cadena (RTA) trata de levadura

Bacterial and plant A/B toxins exploit the natural trafficking pathways in eukaryotic cells to reach their intracellular target(s) in the cytosol and to ...