Name: a uniform shear assay for human platelet and cell surface receptors via cone-plate viscometry
Uploaded: 2019-06-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry at JoVE.com

Bu çalışmada ilgili çalışmalar kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (NıH) Ulusal Kalp, akciğer ve kan Enstitüsü hibe HL082808, HL123984 (LID) ve F31HL134241 (M.E.Q.) tarafından desteklenmektedir. Fon da NıH Ulusal Enstitüsü Genel Tıp Bilimleri Grant T32GM008367 (M.E.Q.) tarafından sağlanan; ve Atlanta çocuk sağlık ve Emory Üniversitesi Pediatrik akış sitometri çekirdek pilot hibe fonları. Yazarlar, 6B4 antikor paylaşımı için Dr. Hans Deckmyn teşekkür etmek istiyorum ve teknik destek için Emory çocuk Pediatrik araştırma merkezi akış sitometri çekirdek.

Burada açıklanan donör türevi insan trombositleri kullanan tüm yöntemler, Emory University/Atlanta çocuk sağlık hizmetleri kurumsal Inceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır.
1. kan çekme ve trombosit Izolasyonu
<ol><li>% 3,8 Trisodyum sitrat içine deney gününde damara yoluyla sağlıklı yetişkin bağışçılar rızası olan yetişkinlere insan kanı çizin. Bir 4,5 mL tüp kan, trombosit sayısı 250 x 103 Ile μL başına yakın olan bağışçılardan 20-25 i...

<ol>
	<li>Sullivan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-voltage-gated+Ca2++influx+through+mechanosensitive+ion+channels+in+aortic+baroreceptor+neurons.">Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons.</a> Circulation Research. 80 (6), 861-867 (1997).</li><li>Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+stretch-activated+ion+channels+in+vascular+endothelial+cells+as+mechanotransducers.">Single stretch-activated ion channels in vascular endothelial cells as mechanotransducers.</a> Nature. 325 (6107), 811-813 (1987).</li><li>Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+Cell+Transduction,+Tuning,+and+Synaptic+Transmission+in+the+Mammalian+Cochlea.">Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea.</a> Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).</li><li>Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gentle+touch+receptors+of+mammalian+skin.">The gentle touch receptors of mammalian skin.</a> Science. 346 (6212), 950-954 (2014).</li><li>Nelson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+patterns+of+growth+controlled+by+multicellular+form+and+mechanics.">Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (33), 11594-11599 (2005).</li><li>Yu, C. H., Law, J. B., Suryana, M., Low, H. Y., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+integrin+binding+to+Arg-Gly-Asp+peptide+activates+actin+polymerization+and+contractile+movement+that+stimulates+outward+translocation.">Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (51), 20585-20590 (2011).</li><li>Wen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shear-dependent+NO-cGMP-cGKI+cascade+in+platelets+acts+as+an+auto-regulatory+brake+of+thrombosis.">A shear-dependent NO-cGMP-cGKI cascade in platelets acts as an auto-regulatory brake of thrombosis.</a> Nature Communications. 9 (1), 4301 (2018).</li><li>Marki, A., Gutierrez, E., Mikulski, Z., Groisman, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+side+view+flow+chamber+reveals+tether-to-sling+transition+in+rolling+neutrophils.">Microfluidics-based side view flow chamber reveals tether-to-sling transition in rolling neutrophils.</a> Scientific Reports. 6, 28870 (2016).</li><li>Brockman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+3D+orientation+of+piconewton+integrin+traction+forces.">Mapping the 3D orientation of piconewton integrin traction forces.</a> Nature Methods. 15 (2), 115-118 (2018).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+modular+and+universal+single+molecule+tension+sensor+using+protein+G+to+study+mechano-sensitive+receptors.">Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors.</a> Scientific Reports. 6, 21584 (2016).</li><li>Quach, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc-independent+immune+thrombocytopenia+via+mechanomolecular+signaling+in+platelets.">Fc-independent immune thrombocytopenia via mechanomolecular signaling in platelets.</a> Blood. 131 (7), 787-796 (2018).</li><li>Cao, W., Krishnaswamy, S., Camire, R. M., Lenting, P. J., Zheng, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factor+VIII+accelerates+proteolytic+cleavage+of+von+Willebrand+factor+by+ADAMTS13.">Factor VIII accelerates proteolytic cleavage of von Willebrand factor by ADAMTS13.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105 (21), 7416-7421 (2008).</li><li>Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets+and+shear+stress.">Platelets and shear stress.</a> Blood. 88 (5), 1525-1541 (1996).</li><li>Pareti, F. I., Niiya, K., McPherson, J. M., Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+two+domains+of+human+von+Willebrand+factor+that+interact+with+fibrillar+collagen+types+I+and+III.">Isolation and characterization of two domains of human von Willebrand factor that interact with fibrillar collagen types I and III.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (28), 13835-13841 (1987).</li><li>Deng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+clearance+via+shear-induced+unfolding+of+a+membrane+mechanoreceptor.">Platelet clearance via shear-induced unfolding of a membrane mechanoreceptor.</a> Nature Communications. 7, 12863 (2016).</li><li>Ikeda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+von+Willebrand+factor+and+fibrinogen+in+platelet+aggregation+under+varying+shear+stress.">The role of von Willebrand factor and fibrinogen in platelet aggregation under varying shear stress.</a> Journal of Clinical Investigation. 87 (4), 1234-1240 (1991).</li><li>Westerhof, N., Stergiopulos, N., Noble, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Snapshots of hemodynamics: an aid for clinical research and graduate education. , (2010).</li><li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+of+ectodomain+shedding+of+glycoprotein+Ibalpha+by+targeting+its+juxtamembrane+shedding+cleavage+site.">Specific inhibition of ectodomain shedding of glycoprotein Ibalpha by targeting its juxtamembrane shedding cleavage site.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (12), 2155-2162 (2013).</li><li>Samsel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry+for+morphologic+and+phenotypic+characterization+of+rare+circulating+endothelial+cells.">Imaging flow cytometry for morphologic and phenotypic characterization of rare circulating endothelial cells.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (6), 379-389 (2013).</li><li>Basiji, D. A., Ortyn, W. E., Liang, L., Venkatachalam, V., Morrissey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+image+analysis+and+imaging+by+flow+cytometry.">Cellular image analysis and imaging by flow cytometry.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 27 (3), 653-670 (2007).</li><li>Quach, M. E., Chen, W., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+platelet+clearance+and+translation+to+improve+platelet+storage.">Mechanisms of platelet clearance and translation to improve platelet storage.</a> Blood. 131 (14), 1512-1521 (2018).</li></ol>

Bu yazıda açıklanan protokol, laminar kesmesinin trombosit ve hücre yüzeyi reseptörlerine etkisini hızlı ve çok yönlü olarak değerlendirmenizi sağlar. Burada sunulan spesifik temsili sonuçlar, multimerik veya iki bivalent ligin etkilerini kesme akışından nasıl etkileneceğini alt çizgi olarak sundu. Bu uygulamaya ek olarak, bir üniforma kesme tahlil kesme bağımlı etkileri gözlem geniş uygulamalar vardır. Bilinen bir ligand reseptör çifti yokluğunda, bir Tekdüzen kesme tahlil aynı zamanda h?...

Mekanik uyarıcı, basınç veya mekanik Persleme/deformasyon gibi teknik uyaranlara yanıt veren proteinlerdir. Bazı mekaniği için, bu mekanik perturbations algılama onlar ifade edilir hücre türlerinin işlevine açık. Örneğin, baroreseptör nöronların streç reseptörleri alın; Bu mechanosensitive iyon kanalları vasküler algılayarak kan basıncını düzenleyen "Stretch"1,2. İç kulak, saç hücrelerinde iyon kanalları ses dalgaları3neden mekanik deformasyonlar algılar ve kutanöz düşük eşik mekanoreseptörler (ltmrs) dokunsal bilgi iletimi kolaylaştırır4. Diğer durumlarda, makinoreceptors yapışma veya büyüme kurulması için hücreye önemli bilgiler sağlar. Hücreler kendi yerel ortamının sertlik hissi ve büyüme veya yayılma dikte etmek için aktin siterit ve integrinler aracılığıyla kontril güçler güvenebilirsiniz5,6.
Hücre veya doku tabanlı modellerde reseptör-ligand etkileşimleri okurken, sıcaklık, pH, ligand konsantrasyonu, tonisite, membran potansiyeli ve diğer birçok parametre değiştirme etkilerini hızlı ve doğru bir şekilde raporlayabilen ortak özellikler var Hangi içinde vivo değişebilir. Bununla birlikte, mekanik gücün reseptör aktivasyonuna katkısı tespit etmek için söz konusu olduğunda bu aynı destek kısa düşebilir. Hücrelerin mikro ortamlarını algılayıp, ses dalgaları algılanmasını veya gerdirmek için yanıt verdiğini, yukarıda bahsedilen mekanik iletkenlerin ortak olduğu bir şey, ligand, reseptör veya her iki kişinin de bağlantılı olduğu etkileşimlere katıldıkları Yüzey. Mekanik kuvvetlerin reseptör etkileşimlerinde etkilerini test etmek için geliştirilen testler genellikle bu paradigmasını yansıtır. Microfluidics ve akış odaları hücreleri ve reseptörleri üzerinde kesme akışının etkilerini incelemek için kullanılan7,8. Bu tür deneyler, kurulan akış hızları aracılığıyla kesme oranlarının ince ayarlarına izin verme avantajına sahiptir. Diğer teknikler, ligand zengini yüzeylerdeki hücreler tarafından uygulanan güçleri algılamak için floresan moleküler problar kullanırlar, etkileşiminde yer alan güçlerin büyüklüğü ve oryantasyonlarını doğru bir şekilde okuyabilmektedir9,10.
Bir veya her iki ortağın bir yüzeye sabitlendiği mekanosensation ek olarak, kesme stres çözeltisindeki proteinleri ve hücreleri etkileyebilir. Bu genellikle sürekli sirkülasyonda olan kan hücrelerinde/proteinlerde gözlenen, ve normalde yüzey-bağlantılı olan mekanoreseptörler aktivasyonu ile tezahür edebilir11, veya altında okcluded olacak hedef sıraları maruz kalma yoluyla statik koşullar12. Ancak, nispeten daha az teknikler çözelti parçacıkları üzerinde kesme kuvveti etkilerini tahlil. Bazı çözelti yaklaşımlar değişen hızları ve süreleri ile sıvı süspansiyonu hücrelerde vortekslenir yoluyla kesme tanıtmak, bu yaklaşımlar oluşturulan kesme stres çok kesin bir belirlenmesi izin vermeyebilir rağmen. Rotasyonel viskoziteler, sıvılara belirli bir kesme kuvveti uygulayarak viskozitesi ölçer. Burada, belirli laminar kesme oranlarının hücrelerde veya hücre parçacıklarının çözümdeki etkisini belirlemek için uygulanan bir yöntem açıklanmaktadır.
Trombosit yüzeyinde en çok ifade edilen proteinlerden biri de glikoprotein (GP) IB-IX kompleksidir. GPIB-IX, plazma proteininin Von Willebrand factor (VWF) için birincil reseptörüdür. Birlikte, bu reseptör-ligand çifti uzun kesme stres13trombosit tepkisi temeli olarak tanınmıştır. Vasküler hasar durumunda, VWF alt endotel matriks14içinde maruz kollajen bağlar, böylece VWF-GPIB-IX etkileşimi yoluyla yaralanma siteye trombosit işe. VWF, gpibα altbirim 'teki bağlayıcı sitesine GPIB-IX fizyolojik kesme stres altında ise, bir membran-proksimal mechanosensory alan (MSD) açılırsa, bu da GPIB-IX15' i aktive eder. Son zamanlarda yapılan bir çalışmada, birçok Bağışıklık trombositopeni (ıTP) hastalarında oluşturulan gibi, GPIbα karşı antikorların, aynı zamanda kayma stres altında unfolding MSD üzerinden trombosit sinyalizasyon inducing yeteneğine sahip olduğunu göstermiştir11. Ancak, VWF aksine, hangi normal dolaşım altında kompleks immobilizing tarafından kesme kaynaklı GPIB-IX aktivasyon kolaylaştırır, iki bivalent antikorlar GPIB-IX üzerinden trombosit Crosslink edebiliyoruz ve dolaşım MSD açın. Bu şekilde, normalde kesme altında yüzey immobilizasyonu ile aktive olan bir mekaniği solüsyonda aktive edilebilir. Bu raporda, biz bir Viskozimetre tabanlı üniforma kesme tahlil çözeltisi reseptör aktivasyonu üzerinde kesme stres belirli düzeylerinin etkilerini algılamak için nasıl yararlanıldı gösterecektir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:764px;" width="764">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:413px;">APC anti-human CD62P (P-Selectin)</td>
			<td style="width:128px;">BioLegend</td>
			<td style="width:135px;">304910</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:413px;">Brookfield Cap 2000+ Viscometer</td>
			<td style="width:128px;">Brookfield</td>
			<td style="width:135px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL)</td>
			<td style="width:128px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:135px;">FL-1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pooled Normal Human Plasma</td>
			<td>Precision Biologic</td>
			<td>CCN-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:413px;">Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate)</td>
			<td style="width:128px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">369714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:413px;">Vacutainer Blood Collection Set, 21G x &#190;&#34; Needle</td>
			<td style="width:128px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">367287</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a uniform shear assay for human platelet and cell surface receptors via cone-plate viscometry

Pek çok biyolojik hücre/doku, mekanik özellikleri, basınç veya mekanik pertürasyonlar gibi kuvvetlere yanıt verebilecek proteinler yoluyla yerel ortamlarının mekanik özelliklerini ifade ederler. Makinoreceptors onların uyaranlara algılar ve mekanizmaları büyük bir çeşitlilik yoluyla sinyalleri iletir. Makinoreceptors için en yaygın rollerden bazıları, dokunma ve ağrı gibi nöronal tepkiler, ya da denge ve işitme fonksiyonu saç hücreleri vardır. Mechanosensation aynı zamanda normal sirkülasyonda kesme deneyimi hangi hat kan damarları, ya da kan hücreleri gibi endotel hücreleri olarak kesme stresine düzenli olarak maruz hücre türleri için önemlidir. Viskozimetre, sıvıların viskozitesini algılayan cihazlardır. Rotasyonel viskozimetreler, sıvılara bilinen bir kesme kuvveti uygulamak için de kullanılabilir. Bu enstrümanlar sıvılara üniforma kesme tanıtmak için yeteneği kan ve plazma dahil olmak üzere birçok biyolojik sıvılar çalışmak için sömürülüyor. Viskozimetre Ayrıca bir çözelti hücrelerine kesme uygulamak ve belirli ligand-reseptör çiftleri üzerinde kesme etkilerini sınamak için kullanılabilir. Burada, trombosit mechanoduyusal reseptör kompleksi GPIb-IX karşı antikorlar ile tedavi trombositler üzerinde kesme stres endojen düzeylerinin etkilerini sınamak için koni-plaka viskozimetresi kullanıyoruz.

Şekil 1 nasıl GPIB-IX aktivasyonunun tetik modelinin, başlangıçta damar duvarına bağlı olarak kesme bağımlı reseptör aktivasyonunu açıklamak için nasıl tanıtıldığı özetlenmiştir, aynı zamanda multivalent ligand tarafından çapraz bağlı trombositlerin aktivasyonunu destekleyebilir. Şekil 2 , GPIB-IX (6b4 ve 11a8) ' in N-terminal alanını hedefleyen iki antikor tarafından tedavi edilen insan trombosit aktivasyonunun okumasını ve yam...

Watch this Scientific Journal Video about A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry at JoVE.com

A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry

Koni-plaka viskozimetre ile ınsan trombosit ve hücre yüzeyi reseptörleri için Tekdüzen kesme tahlil

Koni plaka Viskozimetre kullanılarak trombosit yüzey reseptörlerine Tekdüzen kesme uygulamak için bir çözüm içi yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, diğer hücre türlerine ve hücre parçalara kesme uygulamak için daha geniş ölçüde kullanılabilir ve belirli bir ligand-reseptör çifti hedeflemek gerekmez.

Many biological cells/tissues sense the mechanical properties of their local environments via mechanoreceptors, proteins that can respond to forces like ...

Bu protokol, kesmenin çözümdeki hücreler üzerinde nasıl hareket ettiği yle ilgili çeşitli soruları yanıtlamamıza olanak tanır ve kesme süresi ve büyüklüğü üzerinde önemli bir kontrol sağlar. Makası hareketsiz hale getiren hücreler üzerindeki etkisini algılayan diğer tekniklerin aksine, bu teknik, solüsyondaki hücrelere kesme uygulamamızı sağlar ve kendini aşağı akım sinyal algılama yöntemlerinin bir spektrumuna verir. %3,8 trisodyum sitrat içeren 4,5 mililitrelik tüpte, sağlıklı yetişkin bir donörden periferik kan aldıktan sonra, trombosit açısından zengin plazma elde etmek için kanı santrifüj edin ve elde edilen üst, bulutlu, sarı trombosit açısından zengin plazma tabakasını dikkatlice çıkarmak için 45 derecelik açıyla kesilen pipet ucunu kullanın.Tam kan sayımı ile trombosit sayısını elde edin ve trombosit sayısını yaklaşık 2,5 kez 10'a, mikrolitre başına, havuzlu insan trombosit-zayıf plazmaile beşinci trombositlere ayarlayın. Daha sonra, hafif bir dönüş ile 22 santigrat derece süspansiyon yerleştirin. Ligand tedavisi için trombosit açısından zengin plazmaya antikor veya ligand'ı yavaşça ekleyin ve trombositleri hafifçe karıştırın.Kuluçka sırasında, koni plakalı viscometer açın ve 22 santigrat derece plaka sıcaklığı ayarlayın. 5-10 dakika sonra, tedavi trombosit açısından zengin plazmayı doğrudan plakanın ortasındaki sıcaklık kontrollü koni plakalı viscometer'a aktarın ve tüm numunenin temas noktasında koni ile plaka arasında birikintisi göz önünde bulundurulmasını sağlar. Makası örneğe uygulamak için, makaslamayı viscometer kılavuzuna göre hesaplayın ve makaslamayı uygun oranda ve süreyle numuneye uygulayın.Uygulamanın sonunda, numunenin hem plaka yla hem de koniyle temas halinde kalması için koniyi plakadan yaklaşık iki milimetre kaldırın ve numune hacminin merkezinden beş ila 10 mikrolitre toplamak için jel yükleme pipet ucu kullanın. Daha sonra sheared numunesini oda sıcaklığında 20 dakika boyunca ilgi yüzey belirteçlerine karşı antikorlarla kuluçkaya yatırın ve numuneleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca %2 paraformaldehit le sabitleyin. Akış sitometrisi ile örnekleri analiz etmek için, her koşul için en az 20.000 olay toplamak ve her floresan belirteç sinyal gücünü ölçmek, her florofor yoğunluğu için yükseklik değerini kullanarak.Daha sonra negatif arka plan floresan olayları hariç, bir kapı çizmek için büyükbaş serum albumin veya araç ile negatif bir kontrol kullanın ve tüm deneysel koşullar için kapı içinde olayların yüzdesini ölçmek. Kesme kuvveti uygulamasına yanıt olarak trombosit aktivasyon marker ekspresyonu zamana bağlı bir şekilde düzenlenmemiştir. Burada glikoprotein 1b-IX'un N-terminal etki alanını hedefleyen iki antikor varlığında insan trombosit aktivasyonunun temsili okumaları ve yığılmalı ve statik koşullar altında bir kontrol antikorları gösterilmiştir.Her üç aktivasyon belirteçlerinin ekspresyonu, ya statik koşullara ya da kontrol antikorlarının varlığına kıyasla kesme kuvvetleri nin varlığında ve antikorları hedef alarak önemli ölçüde artırıldı. Özellikle, glikoprotein 1b-IX aktivasyonunu tetikleyemeyecek kadar düşük bağlayıcı olmayan bir kuvvetle antikor ile tedavi, statik veya kesme kuvveti koşullarında trombosit aktivasyon markerinin düzenlenmesini tetiklemez. Ayrıca, glikoprotein 1b-IX'a karşı antikor içeren immün trombositopeni hastalarından alınan plazma, glikoprotein 1b-IX hedefleyen antikorları olmayan hastalardan gelen plazmanın aksine makas bağımlı yanıtları tetikler.Akış sitometrik analizlere ek olarak, kesmeye maruz kalan hücreler de protein düzeyindeki değişiklikleri belirlemek için batı leke, ELISA ve kütle-spec analizi için lysed olabilir. Her zaman olduğu gibi, kan veya insan örnekleri kullanırken, uygun koruyucu ekipman giymek ve kurumunuzun laboratuvar güvenliği ve kan doğan patojen yönergeleri takip emin olun.

Research

JoVE Journal

Biology

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

İnsan Beyninin Doku Kromatin Testi

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate pHPL as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Hayvan Serum Ücretsiz İnsan Kök Hücre Kültürleri Verimli Ek olarak Pooled İnsan Trombosit Lizat (pHPL) hazırlanması

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for ...

A &#946;-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay

A ÃƒÅ½Ã‚Â²-glucuronidase GUS Based Cell Death Assay

A β-glucuronidase (GUS) Tabanlı Hücre Ölümü Testi

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Düşük afiniteli Ekstrasellüler Reseptör-ligand Etkileşimlerinin Ölçeklenebilir Algılama için Avidite tabanlı Ekstrasellüler Etkileşim Gösterimi (AVEXIS)

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics

Hücre Yüzey Proteomics için glikopeptiddir Yakalama

Cell surface proteins, including extracellular matrix proteins, participate in all major cellular processes and functions, such as growth, ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

TIRF Mikroskopi ile Tek olay ebatları da G protein-bağlanmış alıcılar üzerinden Klatrin dolayımlı endositoz görselleştirme

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Bir Kolorimetrik Altın Nanopartikül Testi Uygulanan Yapı-anahtarlama aptamers seçilmesi için bir yöntem

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Montaj ve &#39;Kayma Rings&#39; Uygulama: Orbital tek yönlü ve Periyodik Akışkan Akışının ve Kayma Stres için Yeni Bir Endotel Modeli

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Akım altında Trombosit Degranülasyonu ve Salgılamanın Canlı Hücreli Görüntüleme

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain RTA Trafficking in Yeast

Hücresel bileşenleri tanımlamak için basit Floresans tabanlı muhabir tahlil Risin toksin için Maya ticareti bir zincir (RTA) gerekli.

Bacterial and plant A/B toxins exploit the natural trafficking pathways in eukaryotic cells to reach their intracellular target(s) in the cytosol and to ...