Name: quantification of monocyte chemotactic activity in vivo and characterization of blood monocyte derived macrophages
Uploaded: 2019-08-12T13:30:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages at JoVE.com

Dette projekt blev støttet af tilskud til R.A. fra NIH (AT006885).

Alle de metoder, der er beskrevet i denne protokol, er blevet godkendt af Udvalget for institutionel dyrepasning og-anvendelse på Wake Forest School of Medicine.
1. fremstilling af MCP-1-lastet vækstfaktor-reduceret kælder membran-afledt opløsning
Bemærk: Dette er en steril procedure.
<ol><li>Rengør celle kulturens hætte med et desinfektionsmiddel, inden du tilbereder den afledte opløsning af kælder membranen (f. eks. Matrigel).</li>
	<li>Forbered en enkelt pakket steril 1 mL sprøjte, og tør toppen af hætteglasset med en spritserviet, der er afledt af opløsningen, op, før du lægger den i sprøjten.</li>
	<li>Helt tø vækstfaktor-reduceret kælder membran-afledte løsning på is. Forsigtig: Hvis kælderen membran matrix er optøet ved stuetemperatur (RT), sikre en lille is partikelrester at forhindre opløsningen fra gelelling.</li>
	<li>Når optøet, Åbn hætteglasset og bland MCP-1 eller 1xPBS med 0,1% BSA i cellekulturen hætte.</li>
	<li>Forbered en 1 mL steril sprøjte med en 26 G nål og afkøles på is.</li>
	<li>Forbered en stamopløsning af MCP-1 ved at opløse MCP-1 til en endelig koncentration på 50 μg/mL i 1x PBS med 0,1% BSA.</li>
	<li>MCP-1 fortyndes i 5 mL kold kælder membran-afledt opløsning til en endelig koncentration på 500 ng/mL. Forbered en tilsvarende mængde af kælder membran-afledt opløsning med køretøj kun (1x PBS indeholder 0,1% BSA).</li>
	<li>Indlæs 500 μL af den base i kælderen membran-afledte opløsning (med eller uden MCP-1) i den kolde 1 mL sprøjte.</li>
	<li>Fjern alle luftbobler fra den injektionssprøjte, der er afledt af en kælder membran, før du foretager injektionen for at sikre en ensartet stik dannelse.</li>
</ol>2. injektion af basalmembran-afledt opløsning
<ol><li>Spray 70% ethanol omkring procedureområdet før og under injektionerne for at desinficere miljøet.</li>
	<li>For at fremkalde anæstesi, placere musen i en anæstesi kammer og sæt O2 flow meter til 1 liter/min derefter justere vaporizer til 2% isoflurane.</li>
	<li>Overvåg dybden af anæstesi ved at overvåge respiratorisk hastighed (hastighed/min), cornea refleks og bevægelse af whiskers.</li>
	<li>Under hele proceduren, opretholde anæstesi ved hjælp af en næse kegle.</li>
	<li>Under proceduren holde overvågning af respiratorisk hastighed (hastighed/min), cornea refleks og bevægelse af whiskers at kontrollere dybden af anæstesi.</li>
	<li>Efter at have bekræftet manglende respons på tå knivspids, Injicer langsomt (ca. 100 μL/s) den kælder membran-afledte opløsning subkutant i højre (ingen MCP-1) og venstre (med MCP-1) flanke af musen, hhv. Hvis injektionen er for langsom, kan de base-afledte gel-propper i kælderen blive uregelmæssigt formet eller endda fragmenterede og svære at fjerne.</li>
	<li>Hold sprøjten for 20-30 s efter injektionen for at forhindre lækage af opløsningen og for at tillade et enkelt glat gel-stik til dannelse.</li>
	<li>Efter injektion, placere musen på opvarmning pad med overvågning indtil opsving.</li>
	<li>Returnere musen til den oprindelige bur, når musen er fuldt genoprettet.</li>
</ol>3. høst i kælderen membran-afledte gel stik
<ol><li>Afvejes to separate 1,5 mL mikrocentrifuge glas til hver mus og mærk dem.</li>
	<li>Tre dage efter injektion af den kælder membran-afledte opløsning, aflive musen i bedøvelses kammeret ved hjælp af 3% isofluran efterfulgt af livmoderhals dislokation.</li>
	<li>Fjern musens rygskind ved hjælp af hårklippere eller Anvend hårfjernings creme med bomulds tippet pinde i 5 minutter og tør derefter af.</li>
	<li>Hold muse huden ved hjælp af pincet omkring den nedre thorax og øvre Lændehvirvler og lav en 2 mm lang indsnit i huden.</li>
	<li>Skær midterlinjen af bagsiden af musen fra et snit, der er lavet op til halshvirvler og ned til 1 cm over caudal hvirvel Junction (hale Junction) ved hjælp af kirurgisk saks.</li>
	<li>Adskille huden fra muskellag og PIN-ned huden på en polystyren skum platform.</li>
	<li>Hold forsigtigt den fiber kapsel, der indeholder det membran afledte gel-stik, ved hjælp af fine pincet, og fjern den fibrøse kapsel med en fin saks for at rengøre stikket.</li>
	<li>Fjern det rensede gel-stik til kælder membran, og overfør det til 1,5 mL mikrocentrifuge (Se 3,1).</li>
	<li>Mikrocentrifuge røret vejes med det rensede gel-stik i kælder membranen, og vægten af det membranbaserede gel-stik i kælderen beregnes.</li>
</ol>4. fordøje kælderen membran-afledte gel stik
<ol><li>Tø dispase (10 mL) på isen.</li>
	<li>Mince kælderen membran-afledte gel stik i mikrocentrifuge røret ved hjælp af ren fin saks.</li>
	<li>Der tilsættes 800 μL dispase i hvert mikrocentrifuge glas, som indeholder gel-stik til kælder membran.</li>
	<li>Vortex med maksimal hastighed for 10 s at afbryde stikket.</li>
	<li>Mikrocentrifuge rørene inkuberes i 2 timer ved 37 °C ved 1.400 rpm i en termo ixer for helt at opløse det membranbaserede gel-stik i kælderen.</li>
	<li>Efter 2 timer centrifugeres ved 400 x g i 10 minutter ved rt. forsigtigt fjerne og kassere supernatanten.</li>
	<li>Resuspension af pellet i 1 mL 1x PBS ved invertering eller aflytning.</li>
	<li>Centrifugerings formen gentages ved 200 x g i 10 minutter ved rt. Fjern forsigtigt supernatanten, og kassér den.</li>
	<li>Resuspension af pellet i 300 μL PBS.</li>
	<li>Tag 50 μL cellesuspension i et separat mikrocentrifuge glas.</li>
	<li>Tilsæt 0,5 μl værelse am (1 M) til cellesuspensionen. Bemærk: Calcein AM er en grøn fluorescerende cellelevedygtighed farvestof, som kun ophobes i levende celler.</li>
	<li>Cellerne inkubates i en CO2 -inkubator ved 37 °c i 10 min.</li>
	<li>Tæl grønne fluorescerende (levende) og ikke-fluorescerende (døde) celler ved hjælp af en automatiseret celle tæller.</li>
</ol>5. bestemmelse af cellens sammensætning i cellesuspensionen ved hjælp af single-cell Western blot (scWB) analyse
<ol><li>ScWB-chippen rehydreres inden brug i 15 mL 1x affjedrings buffer i en Petri skål i mindst 10 minutter ved RT.</li>
	<li>1 mL af den fortyndede enkelt cellesuspension (10000-100000 celler/mL) tilsættes til den rehydrerede chip. Sæt overfladen på bunden af en 10 cm Petri skål. Sørg for, at overfladen er sat fladt.</li>
	<li>Dæk Petri skålen med et låg for at undgå tørring og lad cellerne nøjes med 5-15 min. ved gradient.</li>
	<li>Placer chippen under en lys-felt mikroskop og inspicere brøndene ved 10x forstørrelse. Bemærk: Ca. 15-20% mikrobrønde bør være besat af en enkelt celle, mindre end 2% af brøndene skal indeholde 2 eller flere celler</li>
	<li>VIP 10 cm Petri skålen indeholdende chippen med 45 grader.</li>
	<li>Vask chippen med 1x affjedrings buffer for at fjerne ikke-erobrede celler fra overfladen af chippen ved hjælp af blid pipettering fra top til bund af chippen. Gentag 3 gange.</li>
	<li>Forbered den enkelt celle vestlige instrument.</li>
	<li>Indstil lysis tid, elektroforese tid, og UV Capture tid. Brug følgende indstillinger til at analysere rekrutterede makrofager, som er genvundet fra det membranbaserede gel-stik i kælderen: lysis time: 0 s; elektroforese tid: 160 s; UV Capture tid 240 s.</li>
	<li>Læg forsigtigt chippen i elektroforese cellen af enkelt celle vestligt instrument, gel-side vendt. Vær forsigtig med ikke at beskadige gel-siden af chippen.</li>
	<li>Hæld lysis/løbe buffer i kammeret og helt dække hele enkelt celle vestlige chip. Start celle lysis.</li>
	<li>Kør scWB instrument ved hjælp af den indstilling, der er angivet i 5,8.</li>
	<li>Når kørslen er færdig, skal du overføre chippen til en 10 cm Petri skål og vaske chippen to gange med 1x vaskebuffer i 10 minutter ved RT.</li>
	<li>Klargør fortyndinger af primært antistof (anti-vinculin: 1:10; anti-CD45:1:15, anti-CD11b: 1:20, anti-F4/80:1:10) i et samlet volumen på 80 μL antistoffortynder (bland 8 μL antistof 1 plus 8 μL antistof 2 plus 64 μL fortyndingsmiddel).</li>
	<li>Tilsæt 80 μL af den primære antistof opløsning til antistof sonde kammeret, og sænk chip-gel-siden nedad, så antistof opløsningen væger over chippen.</li>
	<li>Inkuber med den primære antistof opløsning i 2 timer ved RT.</li>
	<li>Vask chippen tre gange i 10 minutter i 1x vaskebuffer på rysteapparatet.</li>
	<li>Vask chippen én gang i 10 minutter i vandet på shaker for at afalt gelen.</li>
	<li>Forbered en 1:20 fortynding af sekundært antistof i et samlet volumen på 80 μL (Bland 2 μL sekundært antistof plus 78 μL fortyndingsmiddel).</li>
	<li>Inkuber chippen med sekundært antistof i 1 time ved RT beskyttet mod lys.</li>
	<li>Vask chippen tre gange i 10 minutter med 1x vaskebuffer på rysteapparatet.</li>
	<li>Spin chippen ved hjælp af en slide spinner for at fjerne eventuelle resterende vaskebuffer.</li>
	<li>Scan chippen på en dual-laser microarray scanner ved 5 μm opløsning på den spektral kanal af fluoroforet koblet til de sekundære antistoffer.</li>
	<li>Analysér data ved hjælp af scWB-specifik software.</li>
</ol>6. stripning af scWB chip
<ol><li>Opbevar den scannede chip i vaskebuffer, indtil den er klar til at strippe.</li>
	<li>Placer vandbad i en røg hætte.</li>
	<li>Placer en 50 mL Rørholder i vandbad med vandet kun 1 cm over stativet, og Indstil vandtemperaturen ved 60 °C.</li>
	<li>Forbered stripping buffer. For 1 liter strippende bufferopløsning opløses 9,85 g Tris-HCl (pH 6,8) og 20 g SDS i 900 mL destilleret vand, og pH justeres. Derefter fyldes med destilleret vand til 1L. Tilsæt 0,8% (v/v) af β-mercaptoethanol (β-ME; 14,3 M) umiddelbart før hver brug.</li>
	<li>Efter den første scanning, placere chippen i en 10 cm Petri skål før stripping.</li>
	<li>For hver chip skal du tage 40 mL stripping buffer og tilsæt 320 μl β-ME. Forsigtig: β-Me er giftigt og farligt for mennesker og miljø. Følgende procedure skal udføres i en røg hætte.</li>
	<li>Anbring chippen i beholderen, og forsegl beholderen med parafilm for at undgå, at vandet siver ud i beholderen.</li>
	<li>Placer beholderen inde i rørholderen i det foropvarmede vandbad.</li>
	<li>Inkuber i 90 min.</li>
	<li>Fjern forsigtigt chippen fra beholderen og Placer den i en frisk Petri skål.</li>
	<li>Vask kort chippen en gang med 1x vaskebuffer. Tilsæt derefter 15 mL 1x vaskebuffer til Petri skålen.</li>
	<li>Vask chippen i 15 minutter på en shaker. Gentag vaske trinnet fire gange. Bemærk: Chip er klar til det næste primære antistof (Se trin 5,12-5,21).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Moore, K. J., Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+in+the+pathogenesis+of+atherosclerosis.">Macrophages in the pathogenesis of atherosclerosis.</a> Cell. 145 (3), 341-355 (2011).</li><li>Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-mediated+inflammation+in+metabolic+disease.">Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 738-749 (2011).</li><li>McNelis, J. C., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages,+immunity,+and+metabolic+disease.">Macrophages, immunity, and metabolic disease.</a> Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).</li><li>Akiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genistein,+a+specific+inhibitor+of+tyrosine-specific+protein+kinases.">Genistein, a specific inhibitor of tyrosine-specific protein kinases.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (12), 5592-5595 (1987).</li><li>Nahrendorf, M., Pittet, M. J., Swirski, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes:+protagonists+of+infarct+inflammation+and+repair+after+myocardial+infarction.">Monocytes: protagonists of infarct inflammation and repair after myocardial infarction.</a> Circulation. 121 (22), 2437-2445 (2010).</li><li>Gosling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCP-1+deficiency+reduces+susceptibility+to+atherosclerosis+in+mice+that+overexpress+human+apolipoprotein+B.">MCP-1 deficiency reduces susceptibility to atherosclerosis in mice that overexpress human apolipoprotein B.</a> Journal of Clinical Investigation. 103 (6), 773-778 (1999).</li><li>Fantuzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+CCR2+expression+and+functional+response+to+monocyte+chemotactic+protein+(MCP-1)+during+the+differentiation+of+human+monocytes:+role+of+secreted+MCP-1+in+the+regulation+of+the+chemotactic+response.">Loss of CCR2 expression and functional response to monocyte chemotactic protein (MCP-1) during the differentiation of human monocytes: role of secreted MCP-1 in the regulation of the chemotactic response.</a> Blood. 94 (3), 875-883 (1999).</li><li>Boring, L., Gosling, J., Cleary, M., Charo, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+lesion+formation+in+CCR2-/-+mice+reveals+a+role+for+chemokines+in+the+initiation+of+atherosclerosis.">Decreased lesion formation in CCR2-/- mice reveals a role for chemokines in the initiation of atherosclerosis.</a> Nature. 394 (6696), 894-897 (1998).</li><li>Han, K. H., Tangirala, R. K., Green, S. R., Quehenberger, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+CCR2+expression+and+monocyte+chemoattractant+protein-1-mediated+chemotaxis+in+human+monocytes.+A+regulatory+role+for+plasma+LDL.">Chemokine receptor CCR2 expression and monocyte chemoattractant protein-1-mediated chemotaxis in human monocytes. A regulatory role for plasma LDL.</a> Arteriosclerosis Thrombosis Vascular Biology. 18 (12), 1983-1991 (1998).</li><li>Kanda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCP-1+contributes+to+macrophage+infiltration+into+adipose+tissue,+insulin+resistance,+and+hepatic+steatosis+in+obesity.">MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (6), 1494-1505 (2006).</li><li>Davies, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+the+adhesion+molecules+ICAM-1,+VCAM-1,+PECAM,+and+E-selectin+in+human+atherosclerosis.">The expression of the adhesion molecules ICAM-1, VCAM-1, PECAM, and E-selectin in human atherosclerosis.</a> Journal of Pathology. 171, 223-229 (1993).</li><li>Anderson, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cholesterol-lowering+and+antioxidant+therapy+on+endothelium-dependent+coronary+vasomotion+(see+comments).">The effect of cholesterol-lowering and antioxidant therapy on endothelium-dependent coronary vasomotion (see comments).</a> New England Journal of Medicine. 332 (8), 488-493 (1995).</li><li>Herold, S., Mayer, K., Lohmeyer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+lung+injury:+how+macrophages+orchestrate+resolution+of+inflammation+and+tissue+repair.">Acute lung injury: how macrophages orchestrate resolution of inflammation and tissue repair.</a> Frontiers in Immunology. 2, (2011).</li><li>Qiao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol+Oxidative+Stress+Induced+by+Metabolic+Disorders+Amplifies+Macrophage+Chemotactic+Responses+and+Accelerates+Atherogenesis+and+Kidney+Injury+in+LDL+Receptor-Deficient+Mice.">Thiol Oxidative Stress Induced by Metabolic Disorders Amplifies Macrophage Chemotactic Responses and Accelerates Atherogenesis and Kidney Injury in LDL Receptor-Deficient Mice.</a> Arteriosclerosis Thrombosis Vascular Biology. 29, 1779-1786 (2009).</li><li>Ullevig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+Oxidase+4+Mediates+Monocyte+Priming+and+Accelerated+Chemotaxis+Induced+by+Metabolic+Stress.">NADPH Oxidase 4 Mediates Monocyte Priming and Accelerated Chemotaxis Induced by Metabolic Stress.</a> Arteriosclerosis Thrombosis Vascular Biology. 32 (2), 415-426 (2012).</li><li>Kim, H. S., Ullevig, S. L., Zamora, D., Lee, C. F., Asmis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+MAPK+phosphatase+1+controls+monocyte+migration+and+macrophage+recruitment.">Redox regulation of MAPK phosphatase 1 controls monocyte migration and macrophage recruitment.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 109 (41), E2803-E2812 (2012).</li><li>Kim, H. S., Tavakoli, S., Piefer, L. A., Nguyen, H. N., Asmis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytic+MKP-1+is+a+Sensor+of+the+Metabolic+Environment+and+Regulates+Function+and+Phenotypic+Fate+of+Monocyte-Derived+Macrophages+in+Atherosclerosis.">Monocytic MKP-1 is a Sensor of the Metabolic Environment and Regulates Function and Phenotypic Fate of Monocyte-Derived Macrophages in Atherosclerosis.</a> Scientific Reports. 6, 34223 (2016).</li><li>Ponce, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tube+formation:+an+in+vitro+matrigel+angiogenesis+assay.">Tube formation: an in vitro matrigel angiogenesis assay.</a> Methods in Molecular Biology. 467, 183-188 (2009).</li><li>Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+assays:+a+critical+overview.">Angiogenesis assays: a critical overview.</a> Clinical Chemistry. 49 (1), 32-40 (2003).</li><li>Kim, H. S., Ullevig, S. L., Nguyen, H. N., Vanegas, D., Asmis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+14-3-3zeta+controls+monocyte+migration.">Redox regulation of 14-3-3zeta controls monocyte migration.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (7), 1514-1521 (2014).</li><li>Short, J. D., Downs, K., Tavakoli, S., Asmis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Thiol+Redox+Signaling+in+Monocytes+and+Macrophages.">Protein Thiol Redox Signaling in Monocytes and Macrophages.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 816-835 (2016).</li><li>Tavakoli, S., Asmis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+and+thiol+redox+signaling+in+the+macrophage+biology+of+atherosclerosis.">Reactive oxygen species and thiol redox signaling in the macrophage biology of atherosclerosis.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 17 (12), 1785-1795 (2012).</li><li>Ullevig, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+S-Glutathionylation+Mediates+Macrophage+Responses+to+Metabolic+Cues+from+the+Extracellular+Environment.">Protein S-Glutathionylation Mediates Macrophage Responses to Metabolic Cues from the Extracellular Environment.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 836-851 (2016).</li></ol>

Vi udviklede en in vivo chemotaxis assay, gør brug af de unikke fysiske egenskaber af den kælder membran-afledte matrix og evnen til at indlæse denne unikke matrix med kemokiner og injicere det i mus. Analysen giver os mulighed for at vurdere i levende mus reaktionsevne af monocytter (og makrofager) til Chemokines, som illustreret her for MCP-1, og virkningerne af enten genetisk manipulation eller farmakologiske, kosten og andre miljømæssige eksponeringer på monocyt chemotaxis. Fordi den chemokin gradient vi skaber i disse mus er hovedsagelig upåvirket af genetisk, farmakologisk, kosten eller miljømæssig eksponering, ændringer i monocyt chemotaktisk aktivitet faktisk afspejler funktionelle ændringer i disse monocytter og, som vi viste tidligere også omprogrammering på både protein og transkriptional niveau17,20. Vi rapporterede, at metabolisk stress hos mus øger monocyt reaktionsevne til chemoattraktant, og at denne hyper-chemotaktisk aktivitet korrelerer med øget protein S-glutathionylering, en reversibel, redox-afhængig posttranslationel protein modifikation, som i de fleste tilfælde fører til tab af enzymatisk og protein funktion21,22, og i nogle tilfælde endda fremmer protein nedbrydning16,23.
For at kunne udføre denne procedure og opnå optimale resultater med denne analyse er det afgørende, at nøjagtige mængder af kælder membran-afledt opløsning injiceres langsomt for at skabe en ental velformet stik og fibrøse kapsler bør fjernes helt at få rene propper, når høst kælder membran-afledte gel stik, letter opløsningen af hele stikket i dispase løsning. Vores data viser, at efterlader stikket i dyrene i tre dage optimerer 1) signal intensiteten, dvs antallet af monocytter og makrofager rekrutteret i hvert stik, 2) selektiviteten af signalet, dvs indholdet af monocytter og makrofager inden for samlede cellepopulationer og 3) specificiteten af signalet, dvs stigningen i monocytter og makrofager som reaktion på MCP-1 i forhold til køretøjet. Endelig viser vi, hvordan de mest moderne enkelt cellebaserede tilgange i forbindelse med den base, der er afledt af gassæden, kan bruges til at karakterisere de monocytter, der rekrutteres i stikkene, og dermed opnå et øjebliksbillede af den potentielle fænotype af de monocyt-afledte makrofager, der rekrutteres til steder med skade i en given musemodel som reaktion på specifikke genetiske, farmakologiske, kosten eller miljømæssige indgreb.
Der er en række begrænsninger af analysen til at blive overvejet. Først, mus håndtering, herunder anæstesi, injektion af kælderen membran-afledte løsning, og kirurgisk dissektion kræver praksis at generere enkelte stik og reproducerbare data. For det andet, mens de fleste celler rekrutteret i MCP-1 indlæste stik er monocytter og makrofager, et betydeligt antal er ikke. Dette kan påvirke fortolkningen af andre, ikke-enkelt cellebaserede analytiske analyser udført på denne cellepopulation. Endelig, da cellelyse betingelser for scWB er milde, migrations afstande af proteiner kan afvige fra standard WB og kan ikke korrelere med protein størrelse. Derfor skal både cellelyse og kørselstider valideres for hvert nyt protein, der skal testes, og hvert primært antistof, der anvendes.

Rekrutteringen af monocytter-afledte makrofager er afgørende for udviklingen af kroniske inflammatoriske sygdomme forbundet med metaboliske lidelser, herunder åreforkalkning og fedme1,2,3, 4. Antallet af mono byte-afledte makrofager på steder af vævsskade samt deres plasticitet er afgørende for væv homøostase og reparation. Både under-og over-rekruttering af mono byte-afledte makrofager kan forringe sårheling5. Udløse lokal vævs betændelse, for eksempel ved ophobning og oxidation af low-density lipoprotein (LDL) i aorta væggen eller inflammatorisk aktivering af adipocytter af fedtsyrer eller bakteriel lipopolysaccharid lækage gennem tarm barriere, fører til frigivelse af inflammatoriske mediatorer, herunder kemo okiner såsom monocyt chemoattraktant protein-1 (MCP-1/CCL2). MCP-1 er medlem af c-c chemokine-familien og en vigtig kemoattraktant, der er ansvarlig for rekrutteringen af monocyt-afledte makrofager til steder med vævs betændelse og-skade6,7,8, 9,10. Inflammatorisk aktivering af vaskulær endotelet resulterer i ekspression af sammenvoksninger molekyler såsom intercellulære adhæsions molekyle 1 (ICAM-1) og vaskulære celle adhæsions molekyle 1 (VCAM-1)11,12, så cirkulerende monocytter aktiveret af MCP-1 til at rulle sammen, fastholde sig til og efterfølgende transmigrere til subendothelial rum12. Infiltrerer monocytter differentiere i makrofager, som kan aktiveres i en proinflammatorisk fænotype, der driver den akutte inflammatoriske proces. Drevet af mikromiljøet, pro-inflammatoriske makrofager kan konvertere til betændelse-løse makrofager, som spiller kritiske roller i clearing af inflammatoriske celler, fjerne pro-inflammatoriske signaler og fuldføre væv reparation og sår Healing12,13.
Kronisk metabolisk stress primtal monocytter for dramatisk forbedret reaktionsevne til Chemo-attraktanter og øget monocyt rekruttering, og vi viste, at primet monocytter giver anledning til makrofager med dysregulerede aktiveringsprogrammer og polarisering stater14,15,16. Monocytter priming fremmer åreforkalkning, fedme, og muligvis andre kroniske inflammatoriske sygdomme forbundet med metaboliske lidelser såsom steatohepatitis, nyresygdomme og muligvis kræft. For at vurdere og kvantificere monokyt priming i musemodeller af menneskelige sygdomme, udviklede vi en ny teknik til at vurdere den spæde tilstand af blod monocytter ved at måle den kemo-aktiske aktivitet in vivo14,15,16, 17. Vores tilgang involverer injektion af kælder membran-afledt gel lastet med enten en chemoattraktant-vi bruger almindeligvis MCP-1-eller køretøj i venstre og højre flanke, henholdsvis af mus. Når omhyggeligt injiceres subkutant, vil kælderen membran-afledte gel danne et enkelt stik, hvorfra chemokinerne kan diffus og skabe en defineret kemo-aktisk gradient, der ikke påvirkes af den metaboliske eller inflammatoriske tilstand af de omgivende væv eller modtager musen.
Den kælder membran-afledte gel vi bruger til vores analyse er en opløst biliseret kælder membran forberedelse udvundet fra Engelbreth-Holm-sværm (EHS) mus sarkom, en tumor rig på sådanne ekstracellulære matrix (ECM) proteiner. Denne komplekse protein blanding indeholder Laminin (60%), kollagen IV (30%), bridging molekyle entactin (8%), og en række vækstfaktorer. Basement membran matrix plug assay blev oprindeligt udviklet til at undersøge angiogenese som reaktion på forskellige vækstfaktorer18,19. Men for at studere monocytter chemotaxis, er det vigtigt at bruge vækstfaktor-forarmet kælder membran-afledte gel til at minimere endotelcelle rekruttering og angiogenese. Hvad gør matrigel (omtales som Basement membran-afledte gel fremover) unikke og især nyttig er, at ved temperaturer under 10 ° c det bliver flydende, gør det muligt for kemokiner at blive opløst. Ved temperaturer over 22 °C gennemgår den membran afledte opløsning hurtigt en faseovergang og danner hurtigt en hydrogel. Stikkene kan fjernes kirurgisk, rengøres og opløses med en Bacillus-afledt neutral metalloprodrille for at give enkelt celle suspensioner, som kan analyseres på en fluorescens-aktiveret celle sortering (FACER), af RNAseq, enkelt celle-RNA og en række andre omik teknikker. Her beskriver vi brugen af enkelt-celle Western blot analyse til karakterisering af cellepopulationer rekrutteret i kælderen membran-afledte gel stik en, tre eller fem dage efter injektion.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:628px;" width="628">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">10 cm petri dish</td>
			<td style="width:103px;">griner bio-one</td>
			<td style="width:123px;">664 160</td>
			<td style="width:184px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">10x suspension buffer</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">R101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">15 cm petri dish</td>
			<td style="width:103px;">Falcon</td>
			<td style="width:123px;">353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:103px;">MP BIOMEDICALS</td>
			<td style="width:123px;">2194705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">5% washing buffer</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">R252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Antibody diluent</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">042-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Bench Top Centrifuge</td>
			<td style="width:103px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Microfuge 22R Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Bovine Serim Albumin</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Calcein AM</td>
			<td style="width:103px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">C3099</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">CD11b</td>
			<td style="width:103px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:123px;">NB110-89474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">CD45 (D4H7K) rabbit mAb</td>
			<td style="width:103px;">Cell Signal Technologies</td>
			<td style="width:123px;">727987S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">CD68/SR-D1 (FA-11)</td>
			<td style="width:103px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:123px;">NBP2-33337SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Cellometer Vision</td>
			<td style="width:103px;">Nexcelom</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Dispase</td>
			<td style="width:103px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">354235</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Dissecting sissor</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Donkey anti-Rabbit IgG secondary antibody [NL557]</td>
			<td style="width:103px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:123px;">NL004</td>
			<td>NL 557 conjugate</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:219px;">Donkey anti-Rat IgG (H+L) secondary antibody [DyLight 650]</td>
			<td style="width:103px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:123px;">NBP1-75655</td>
			<td>DyLight 650 conjugate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">F4/80 (CI-A3-1)</td>
			<td style="width:103px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:123px;">NB600-404SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Heat Block</td>
			<td style="width:103px;">effendorf</td>
			<td style="width:123px;">22331</td>
			<td>Thermomixer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Lysis/Running buffer</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">R200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Matrigel Matrix (Grwoth Factor Reduced)</td>
			<td style="width:103px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">354230</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Microarray scanner</td>
			<td style="width:103px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:123px;">ScanArray Gx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Microscope</td>
			<td style="width:103px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">Evos fl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Milo</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Single cell western</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Needle</td>
			<td style="width:103px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">305111</td>
			<td>26G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Parafilm</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Probing chamber</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">035-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Recombinant mouse CCL2/JE/MCP-1 protein</td>
			<td style="width:103px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:123px;">479-JE-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">scWEST chip</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">C300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Shaker</td>
			<td style="width:103px;">Bioexpress</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Gene mate orbital shaker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Single cell western chip canister</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">035-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Slide spinner</td>
			<td style="width:103px;">Labnet</td>
			<td style="width:123px;">C1303-T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP 166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Syringe</td>
			<td style="width:103px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">309602</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Tris-Hydrochloride</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP 153-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Tweezer</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">035-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Water bath</td>
			<td style="width:103px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of monocyte chemotactic activity in vivo and characterization of blood monocyte derived macrophages

Vævs homøostase og reparation er kritisk afhængige af rekruttering af monocytter-afledte makrofager. Både under-og over-rekruttering af mono byte-afledte makrofager kan forringe sårheling. Vi viste, at høj fedt og høj sukker kost fremme monocyt priming og dysfunktion, omdanne sunde blod monocytter til en hyper chemotaktisk fænotype klar til at differentiere i makrofager med dysregulerede aktiverings profiler og nedsat fænotypiske Plasticitet. Over rekruttering af makrofager, der stammer fra monocyte, og rekruttering af makrofager med dysregulerede aktiverings profiler menes at være en væsentlig bidragyder til udviklingen af kroniske inflammatoriske sygdomme forbundet med metaboliske lidelser, herunder åreforkalkning og fedme. Målet med denne protokol er at kvantificere den chemotaktiske aktivitet af blod monocytter som en biomarkør for monocyt priming og dysfunktion og at karakterisere makrofag fænotype blod monocytter er klar til at differentiere sig i disse musemodeller. Ved hjælp af enkelt celle Western blot analyse, viser vi, at efter 24 h 33% af celler rekrutteret i MCP-1-loaded kælder membran-afledte gel-stik injiceres i mus er monocytter og makrofager; 58% efter dag 3. På dag 5 faldt monocytter og makrofag dog markant. Endelig viser vi, at denne assays også giver mulighed for isolering af levende makrofager fra kirurgisk hentet kælder membran-afledte gel stik, som derefter kan blive udsat for efterfølgende karakterisering af enkelt celle Western blot analyse.

For at få adgang til reaktionsevne af blod monocytter til chemoattraktanter, injicerede vi køretøj-lastet og MCP-1 indlæst kælder membran-afledte løsning i venstre og højre flankerne af hver mus. Gel-stik til Basement membran blev fjernet 1, 3 og 5 dage efter injektioner, opløst og celler rekrutteret til hvert stik blev talt (figur 1a). Ved at fratrække celle tællingen i det køretøjs belastede stik (åbne bjælker) fra celletal i det indlæste MCP-1-stik (lukkede bjælker) opnåede vi antallet af celler, som specifikt blev rekrutteret som svar på MCP-1 (Δ-celle nummer, figur 1b). Vi observerede en accelereret MCP-1-specifik rekruttering og ophobning af celler i løbet af 5-dages periode, med satser stigende fra 31.000 celler/dag (dag 1) til 78.000 celler/dag (dag 3) og 136.000 celler/dag på dag 5 (figur 1b).
For at identificere de celletyper, der trådte ind i de kælder membran-afledte gel-stik, vi udsat cellerne isoleret fra hvert stik til enkelt celle Western blot analyse (scWB), sondering for CD45, CD11b og F4/80 udtryk til at identificere monocytter (CD11b+F4/80 -), makrofager (CD11b+F4/80+ plus CD11b-F4/80+) og resterende ikke-monocytiske leukocytter (CD45+CD11b-F4/80-) (figur 2). ScWB chips blev derefter probed for vinculin til at bestemme den samlede celle tal på hver gel og for at bekræfte enkelt celle belægning af mikrobrønde på scWB chip. Procentdelen af monocytter i de MCP-1-belastede gpsplugs, som er afledt af base, var lav på dag 1, 20%, toppede på dag 3 med 47%, henholdsvis før den faldt til 14% på dag 5 (figur 2D). Makrofag-numre inden for MCP-1-indlæste gel-stik til kælder membran steg støt fra 13% på dag 1, til 22% på dag 3 og 23% på dag 5. For MCP-1-belastede stik var procentdelen af monocytter plus makrofager i den isolerede cellepopulation højest på dag 3, 31% i køretøjets belastede stik (figur 3a) og 58% i MCP-1-belastede stik (figur 3b), hvilket indikerer, at efter 3 dage det store flertal af celler rekrutteret af MCP-1-afhængige chemotaxis er monocytter og makrofager. Selvom det totale antal monocytter plus makrofager var højere på dag 5 sammenlignet med dag 3 (figur 3c og D), på grund af den signifikant højere andel af monocytter og makrofager i den totale cellepopulation (figur 3a og B), celletal på dag 3 mere præcist afspejler blod monocyt chemotaxis og rekruttering. Vi injicerer derfor rutinemæssigt den kælder membran-afledte løsning tre dage før at ofre dyrene. Hvorvidt alle makrofager rekrutteret af MCP-1 er monocyte-afledte eller residente makrofager rekrutteret fra tilstødende væv bidrog ikke var bestemt.
Statistisk analyse af de viste data blev udført med analyse software (f. eks. SigmaPlot 14). ANOVA efterfulgt af Fischer LSD-testen blev anvendt til at sammenligne middelværdierne mellem forsøgsgrupperne. Alle data præsenteres som middel ± SD på mindst 3 uafhængige eksperimenter. Resultaterne blev anset for at være statistisk signifikante på P < 0,05-niveauet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59706/59706fig1v2.jpg"> Figur 1 : Kvantitation af celler rekrutteret til subkutane membran-afledte gel-stik. (A) absolutte cellenumre for køretøjer lastet (åbne stænger) og MCP-1-lastet kælder membran-afledte gel stik (lukkede stænger). B) antallet af celler, som MCP-1 har rekrutteret til gel-stik til kælder membran, beregnet som forskellen i celleantal mellem MCP-1-belastede og køretøjs belastede stik. Resultaterne vises som middelværdien ± SD (n = 4) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59706/59706fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59706/59706fig2.jpg"> Figur 2 : Analyse af cellepopulationer rekrutteret til base i kælderen membran-afledte gel stik ved enkelt celle Western blot analyse. (A + B) Der vises repræsentative eksempler for scWB-analysen af en køretøjs belastet (kontrol) og et MCP-1-Leaded stik (MCP-1) isoleret fra en mus tre dage efter injektionen. Chips mærket med antistoffer rettet mod CD45, CD11b og F4/80 efterfulgt af fluorescerende sekundære antistoffer som beskrevet i protokollen. Fluorescens intensiteten af det mærkede bånd for hver enkelt celle vises som topareal. (C + D) Cellepopulationer blev identificeret som monocytter (CD11b+F4/80-, <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59706/59706img01.jpg"> </img>), makrofager (CD11b+F4/80+ plus CD11b-F4/80+, <img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/59706/59706img02.jpg" style="font-size: 14px;"> </img>) eller som ikke-moncyclotiske leukocytter (CD45+ , <img alt="Image 3" src="/files/ftp_upload/59706/59706img03.jpg" style="font-size: 14px;">). De resterende celler var mærket "andet" (<img alt="Image 4" src="/files/ftp_upload/59706/59706img04.jpg" style="font-size: 14px;">). Resultaterne vises som middelværdien ± SD (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59706/59706fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59706/59706fig3.jpg"> Figur 3 : Indhold af monocytter og makrofag i gpsplugs i kælder membran. Kvantitativ analyse af rekrutterede monocytter og makrofag i køretøjer lastet og MCP-1-belastede stik fjernet på dag 1, 3 og 5 efter injektion. Værdier vises som procent af den samlede cellepopulation (A + B) og i absolutte cellenumre pr. stik (C + D). Resultaterne vises som middelværdien ± SD (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59706/59706fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages at JoVE.com

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Her præsenterer vi en protokol til at kvantificere den chemotaktiske aktivitet af blod monocytter i musemodeller, til at vurdere virkningerne af ernæringsmæssige, farmakologiske og genetiske interventioner på blod monocyt og til at karakterisere de blod monocytter afledte makrofager i mus modeller ved hjælp af monocyte-chemoattraktant protein-1 (MCP-1)-lastet kælder membran-afledte gel stik.

Kvantificering af Monoyte Chemotaktisk aktivitet in vivo og karakterisering af blod monocytter afledt makrofager

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

Denne metode giver os mulighed for at kvantificere den kemiske aktivitet af blodmonocyt hos levende dyr og at undersøge virkningen af dårlig kost på monocytfunktion og deres underliggende mekanismer. Monocyt-afledte makrofager kan isoleres og analyseres ved hjælp af forskellige tilgange, herunder enkelt celle, og omics teknikker, der giver et øjebliksbillede af sundheden for blod monocyt site i musemodeller. Dagens procedure vil blive udført af Dr.Young Joo Ahn en adjunkt i mit laboratorium, og Dr. Luxi Wang, en postdoc i mit laboratorium.Før proceduren påbegyndes, rengøres cellekulturhætten med desinfektionsmiddel, og vækstfaktoren reduceres med kældermembranafledt opløsning på is. Udstyr individuelle sterile en milliliter sprøjter med 26 gauge nåle og læg nålene på is. Når opløsningen er optøet, skal du tørre toppen af membranafledte opløsningshætteglas med en spritserviet, før der indlæses 500 mikroliter opløsning suppleret med eller uden kemo attractant i hver millilitersprøjte.Fjern derefter eventuelle luftbobler fra kældermembranafledte opløsningsindlæste sprøjte for at sikre en ensartet stikdannelse. Efter at have bekræftet en manglende reaktion på tå knivspids, langsomt injicere en hel mængde kælder membran-afledt opløsning uden MCP-1 tilsat på ca 100 mikro liter per sekund subkutende ind i højre flanke af bedøvet mus. Og hele 500 mikro liter kælder membran-afledt løsning suppleret med MCP-1 i venstre flanke af dyret.Hold sprøjten på plads 20 til 30 sekunder efter injektionen for at forhindre lækage af opløsningen og for at tillade en enkelt, glat gel stik til at danne, før du placerer musen på en opvarmning pad med overvågning, indtil fuld helbredelse. Tre dage efter injektionen, fjerne rygskød hår fra en plug-injiceret dyr og bruge kraftang til at gribe huden omkring den nedre brystkasse og øvre lændehvirvel. Lav en to millimeter lang snit ind i huden og skæres langs midterlinjen af bagsiden af musen fra halshvirvler ned til en centimeter over kodren vertebrale krydset.Adskære huden fra muskellaget og pin ned huden på en polystyren skum platform. Dernæst under et dissekerende mikroskop, forsigtigt forstå fibrøse kapsel, der indeholder kælderen membran-afledt gel stik og bruge fine kraftfornætte til at fjerne den fibrøse kapsel. Brug derefter en fin saks til at rengøre stikket.Overfør derefter det rensede membranafledte gelstik til et passende mærket og vejet 1,5 milliliter mikrocentrifugerør. Reweigh røret til at beregne vægten af kælderen membran-afledt gel stik. For kælder membran-afledt gel stik fordøjelsen, skal du bruge rene fine saks til at hakke kælderen membran-afledt gel stik i hver mikro centrifuge rør og tilføje 800 mikro liter fortrænge til stikkene.Vortex ved den maksimale hastighed i 10 sekunder for at forstyrre propperne og placere mikrocentrifugerørene ved 37 grader Celsius i to timer i en termoblander ved 1400 rotationer i minuttet for helt at opløse kældermembranafledte gelstik. Ved inkubationens afslutning sedimenteres stikfragmenterne ved centrifugering to gange og opstimeret pellets i 300 mikroliter PBS. Overfør 50 mikroliter af hver cellesuspension til nye mikrocentrifugerør, og cellerne i de nye rør mærkes med 0,5 mikroliter kalcin.Efter en 10 minutters inkubation ved 37 grader Celsius i en kuldioxid inkubator, tælle antallet af levende grønne fluorescerende positive og døde ikke-fluorescerende celler på en automatiseret celle tæller. For en enkelt celle Western blot analyse, tilsæt en milliliter fortyndet enkelt celle suspension til en rehydreret enkelt celle vestlige blot chip i bunden af en 10 centimeter petriskål. Efter fem til 15 minutter, undersøge chippen under brightfield mikroskopi.Ca. 15 til 20% af mikrobondene skal være besat af en enkelt celle, og mindre end to procent af brøndene skal indeholde to eller flere celler. Hvis chippen er blevet korrekt belastet, vip skålen 45 grader og vask chippen tre gange med suspensionsbuffer for at fjerne eventuelle uopfangede celler. Efter den sidste vask, omhyggeligt og indlæse chippen i elektroforese celle af en enkelt celle vestlige instrument, gel-side op, og dække hele enkelt celle vestlige blot chip med lysis kører buffer.Start cellelyse og kør instrumentet i henhold til de relevante eksperimentparametre. I slutningen af kørslen skylles chippen med to 10-minutters vask med frisk vaskepude pr. vask ved stuetemperatur. Efter den anden vask tilsættes 80 mikroliter af den primære antistofopløsning af interesse for antistofstæderne og sænk spångelsiden nedad, så antistofopløsningen væger hen over chippen.Efter to timer ved stuetemperatur vaskes chippen tre gange i vaskebuffer og en gang i vand på en shaker. Spån skal tøses ind med et passende sekundært antistof i en time ved stuetemperatur, der er beskyttet mod lys. I slutningen af inkubationen vaskes chippen tre gange med vaskebufferen, og spån på en slidespind for at fjerne eventuelle resterende vaskebuffer.For at fratage den enkelte celle vestlige blot chip, placere en 15 milliliter rør rack i en 60 grader Celsius vandbad med vandet kun en centimeter over rack. I en røghætte tilsættes 40 milliliter stripningsbuffer og 320 mikroliter beta morcepta ethanol til en beholder. Placer chippen i en 10 centimeter petriskål inde i beholderen og forsegle beholderen med Parafilm.Placer derefter beholderen inde i røret rack i vandbadet. Efter 90 minutter overføres spånen forsigtigt til en ny petriskål, og chippen vaskes kortvarigt én gang med vaskebuffer, før der tilsættes 15 milliliter frisk vaskebuffer til petriskålen i 15 minutters vask på rysteren. I dette repræsentative eksperiment blev de celler, der blev rekrutteret til hvert stik, talt med en, tre og fem dage efter injektionen.Ved at trække celletallet i de køretøjsbelastede stik fra celletallet i MCP-1-lastede stik blev antallet af celler, der specifikt blev rekrutteret som reaktion på kemo attractanten, derefter beregnet. En accelereret MCP-1 specifik rekruttering og akkumulering af celler blev observeret i løbet af de fem-dages periode, med satser stiger fra 31, 000 celler om dagen efter en dag injektion til op til 136, 000 celler om dagen, fem dage efter injektion. Single cell Western blot analyse blev derefter brugt til at identificere de forskellige celletyper rekrutteret til kælderen membran-afledte stik, i henhold til deres udtryk for specifikke immuncelle markører af interesse.For eksempel var procentdelen af monocytter i MCP-1-indlæste membranafledte gelstik lav på dag ét og toppede på dag tre, før de faldt igen på dag fem, mens antallet af makrofager steg støt i hele undersøgelsesperioden. For MCP-1-indlæste stik var procentdelen af monocytter plus makrofager i den isolerede cellepopulation højest på dag tre, hvilket indikerer, at langt de fleste celler rekrutteret af MCP-1-afhængige chemxis var monocytter og makrofager efter tre dage. Selv om det samlede antal monocytter plus makrofager typisk er højere på dag fem sammenlignet med dag tre, afspejler celletallet på dag tre mere præcist perifert blod af monocyt chemotaxis og rekruttering, og derfor anbefales dag tre til kældermembran-direkte plug-analyser.En vellykket erhvervelse af enkelte celler til downstream-analyse afhænger af nøjagtigheden af injektionen og fuldstændig fjernelse af stikkene. Flowcytometri, encellet western blotting, bulk eller enkeltcelle RNA-sekvensering og andre omik-procedurer kan anvendes til at vurdere de karakteristiske og fænotyper af de rekrutterede monocyt- og monocytafledte makrofager.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Aktivering og måling af NLRP3 Inflammasome Aktivitet hjælp af IL-1β i Human monocytafledte dendritiske celler

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Dyrkning af makrofag kolonistimulerende faktor differentierede humane monocytafledte makrofager

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

Måling granulocyt og monocyt Fagocytose og Oxidativ Burst Aktivitet i humant blod

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Karakterisering af Humane monocytafledte dendritiske celler fra Imaging flowcytometri: en sammenligning mellem to Monocyt Isolation protokoller

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Generation of Human monocytafledte dendritiske celler fra fuldblod

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate FcÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Receptor-mediated Phagocytosis

Anvendelse af en monocyt Monolayer Assay til Evaluer Fcy receptor-medieret fagocytose

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Analyse af Microglia og Monocyt-afledte Makrofager fra Centralnervesystemet ved Flowcytometri

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Kvantificering af humane monocyt Chemotaxis In Vitro og Murine lymfocyt handel In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Karakterisering af humane monocyt delmængder af fuldblod Flow flowcytometri analyse

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

In vitro stimulation og visualisering af ekstracellulær fælde frigivelse i differentierede humane monocytter-afledte makrofager

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...