Name: quantification of monocyte chemotactic activity in vivo and characterization of blood monocyte derived macrophages
Uploaded: 2019-08-12T13:30:00
Duration: 9 min 57 s
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इस परियोजना को एनआईएच (AT006885) से आर.ए.

<ol>
	<li>Moore, K. J., Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+in+the+pathogenesis+of+atherosclerosis.">Macrophages in the pathogenesis of atherosclerosis.</a> Cell. 145 (3), 341-355 (2011).</li><li>Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-mediated+inflammation+in+metabolic+disease.">Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 738-749 (2011).</li><li>McNelis, J. C., Olefsky, J. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+lesion+formation+in+CCR2-/-+mice+reveals+a+role+for+chemokines+in+the+initiation+of+atherosclerosis.">Decreased lesion formation in CCR2-/- mice reveals a role for chemokines in the initiation of atherosclerosis.</a> Nature. 394 (6696), 894-897 (1998).</li><li>Han, K. H., Tangirala, R. K., Green, S. R., Quehenberger, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+CCR2+expression+and+monocyte+chemoattractant+protein-1-mediated+chemotaxis+in+human+monocytes.+A+regulatory+role+for+plasma+LDL.">Chemokine receptor CCR2 expression and monocyte chemoattractant protein-1-mediated chemotaxis in human monocytes. A regulatory role for plasma LDL.</a> Arteriosclerosis Thrombosis Vascular Biology. 18 (12), 1983-1991 (1998).</li><li>Kanda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCP-1+contributes+to+macrophage+infiltration+into+adipose+tissue,+insulin+resistance,+and+hepatic+steatosis+in+obesity.">MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (6), 1494-1505 (2006).</li><li>Davies, M. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tube+formation:+an+in+vitro+matrigel+angiogenesis+assay.">Tube formation: an in vitro matrigel angiogenesis assay.</a> Methods in Molecular Biology. 467, 183-188 (2009).</li><li>Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+assays:+a+critical+overview.">Angiogenesis assays: a critical overview.</a> Clinical Chemistry. 49 (1), 32-40 (2003).</li><li>Kim, H. S., Ullevig, S. L., Nguyen, H. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+S-Glutathionylation+Mediates+Macrophage+Responses+to+Metabolic+Cues+from+the+Extracellular+Environment.">Protein S-Glutathionylation Mediates Macrophage Responses to Metabolic Cues from the Extracellular Environment.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 836-851 (2016).</li></ol>

कोई नहीं.

हम एक में विवो chemotaxis परख विकसित की है, तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न मैट्रिक्स और chemokines के साथ इस अद्वितीय मैट्रिक्स लोड और यह चूहों में इंजेक्ट करने की क्षमता के अद्वितीय भौतिक गुणों का उपयोग कर. परख हमें रहने वाले चूहों में मोनोसाइट्स की जवाबदेही का आकलन करने की अनुमति देता है (और मैक्रोफेज) chemokines के लिए, के रूप में MCP-1 के लिए यहाँ सचित्र, और या तो आनुवंशिक हेरफेर या औषधीय, आहार और monocyte पर अन्य पर्यावरण जोखिम के प्रभाव रसोटैक्सिस। क्योंकि chemokine ढाल हम इन चूहों में बनाने के अनिवार्य रूप से आनुवंशिक, औषधीय, आहार या पर्यावरण जोखिम से अप्रभावित है, monocyte chemotactic गतिविधि में परिवर्तन वास्तव में इन monocytes में कार्यात्मक परिवर्तन को प्रतिबिंबित और, जैसा कि हम दिखाया पहले भी दोनों प्रोटीन और प्रतिलेखन स्तर17,20पर reprogramming. हमने बताया कि चूहों में चयापचय तनाव chemoattractant के लिए monocyte प्रतिक्रिया बढ़ जाती है और यह कि इस अति-चेमोटेक्टिक गतिविधि वृद्धि हुई प्रोटीन एस-ग्लूटोथाइयोनिलन, एक प्रतिवर्ती, redox-निर्भर posttranslational के साथ संबंधित प्रोटीन संशोधन , जो ज्यादातर मामलों में एंजाइमी और प्रोटीन समारोह21,22की हानि की ओर जाता है , और कुछ मामलों में भी प्रोटीन गिरावट को बढ़ावा देताहै 16,23.
सफलतापूर्वक इस प्रक्रिया को निष्पादित करने के लिए और इस परख के साथ इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए यह महत्वपूर्ण है कि तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न समाधान की सटीक मात्रा धीरे धीरे एक विलक्षण अच्छी तरह से गठित प्लग बनाने के लिए इंजेक्शन हैं और रेशेदार कैप्सूल हटाया जाना चाहिए पूरी तरह से साफ प्लग पाने के लिए जब फसल तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग, dispase समाधान में पूरे प्लग के विघटन की सुविधा. हमारे डेटा बताते हैं कि तीन दिनों के लिए जानवरों में प्लग छोड़ने 1) संकेत तीव्रता का अनुकूलन, अर्थात्, प्रत्येक प्लग में भर्ती monocytes और मैक्रोफेज की संख्या, 2) संकेत की चयनात्मकता, अर्थात्, monocytes और मैक्रोफेज के भीतर कुल सेल आबादी और 3) संकेत की विशिष्टता, अर्थात वाहन की तुलना में MCP-1 के जवाब में monocytes और मैक्रोफेज में वृद्धि. अंत में, हम प्रदर्शित कैसे राज्य के-the-कला एकल सेल आधारित तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग परख के साथ संयोजन के रूप में दृष्टिकोण प्लग में भर्ती monocytes की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और इस तरह के संभावित phenotype का एक स्नैपशॉट प्राप्त एककोशिका व्युत्पन्न मैक्रोफेज विशिष्ट आनुवंशिक, औषधीय, आहार या पर्यावरणीय हस्तक्षेप के जवाब में किसी भी माउस मॉडल में चोट के स्थलों के लिए भर्ती किया जा रहा है।
वहाँ परख की सीमाओं के एक नंबर रहे हैं पर विचार किया जाना है. सबसे पहले, माउस हैंडलिंग, संज्ञाहरण सहित, तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न समाधान के इंजेक्शन, और शल्य विच्छेदन एकल प्लग और reproduible डेटा उत्पन्न करने के लिए अभ्यास की आवश्यकता है. दूसरा, जबकि MCP-1 भरी हुई प्लग में भर्ती अधिकांश कोशिकाओं monocytes और मैक्रोफेज हैं, एक पर्याप्त संख्या नहीं हैं. यह अन्य की व्याख्या को प्रभावित कर सकता है, गैर एकल सेल आधारित विश्लेषणात्मक इस सेल आबादी पर प्रदर्शन पर परख. अंत में, के बाद से scWB के लिए सेल lysis शर्तों हल्के हैं, प्रोटीन के प्रवास दूरी मानक WB से अलग हो सकता है और प्रोटीन आकार के साथ सहसंबंधित नहीं हो सकता है. इसलिए, दोनों सेल lysis और रन बार प्रत्येक नए प्रोटीन के लिए मान्य किया जा करने के लिए परीक्षण किया जा करने के लिए और प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया.

मोनोसाइट व्युत्पन्न मैक्रोफेज की भर्ती चयापचय विकारों से जुड़े पुराने भड़काऊ रोगों के विकास के लिए आवश्यक है, जिसमें एथेरोस्क्लेरोसिस और मोटापा1,2,3, 4. ऊतक चोट के स्थलों पर मोनोसाइट व्युत्पन्न मैक्रोफेज की संख्या के साथ-साथ उनकी प्लास्टिकता ऊतक होमोस्टेसिस और मरम्मत के लिए महत्वपूर्ण हैं। मोनोसाइट व्युत्पन्न मैक्रोफेज की कम और अधिक भर्ती दोनों घाव भरने को बाधित कर सकते हैं5. स्थानीय ऊतक सूजन ट्रिगर, उदाहरण के लिए, कम घनत्व लिपोप्रोटीन के संचय और ऑक्सीकरण द्वारा (एलडीएल) महाधमनी दीवार में या फैटी एसिड या बैक्टीरिया lipopolysaccharide आंतों के माध्यम से लीक द्वारा adipocytes के भड़काऊ सक्रियण बाधा, इस तरह के मोनोसाइट chemoattractant प्रोटीन-1 (एमसीपी-1/ MCP-1 सी-सी रसायन परिवार का एक सदस्य है और ऊतक सूजन और चोट6,7,8, की साइटों के लिए मोनोसाइट व्युत्पन्न मैक्रोफेज की भर्ती के लिए जिम्मेदार एक प्रमुख chemoattractant है, 9,10. संवहनी endothelium की भड़काऊ सक्रियण आसंजन अणुओं की अभिव्यक्ति में परिणाम इस तरह के intercellular आसंजन अणु के रूप में 1 (ICAM-1) और संवहनी सेल आसंजन अणु 1 (VCAM-1)11,12, अनुमति एमसीपी-1 द्वारा सक्रिय मोनोसाइट्स को साथ रोल करने के लिए, दृढ़ता से पालन करें और बाद में सबएंडोथेलियल अंतरिक्ष12में स्थानांतरित करें। मोनोसाइट्स में घुसपैठ मैक्रोफेज में अंतर करती है, जिसे एक प्रो इंफ्लेमेटरी फीनोटाइप में सक्रिय किया जा सकता है, जिससे तीव्र सूजन प्रक्रिया बढ़ जाती है। माइक्रोएनवायरनमेंट से प्रेरित, समर्थक भड़काऊ मैक्रोफेज सूजन को हल करने वाले मैक्रोफेज में परिवर्तित हो सकते हैं, जो सूजन कोशिकाओं के समाशोधन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, समर्थक भड़काऊ संकेतों को हटा सकते हैं और ऊतक की मरम्मत और घाव को पूरा कर सकते हैं उपचार12,13.
क्रोनिक चयापचय तनाव प्राइम्स मोनोसाइट्स के लिए नाटकीय रूप से बढ़ाया प्रतिक्रिया के लिए chemo-attractants और बढ़ी हुई monocyte भर्ती, और हमने दिखाया कि primed monocytes dyregulated सक्रियण कार्यक्रमों और ध्रुवीकरण के साथ मैक्रोफेज को जन्म देते हैं राज्यों14,15,16. Monocyte प्राइमिंग atherosclerosis को बढ़ावा देता है, मोटापा, और संभवतः अन्य पुरानी भड़काऊ ऐसे steatohepatitis के रूप में चयापचय विकारों के साथ जुड़े रोगों, गुर्दे की बीमारियों और संभवतः कैंसर. मानव रोगों के माउस मॉडल में मोनोसाइट प्राइमिंग का आकलन और परिमाणित करने के लिए, हमने विवो14,15,16में रसायन विज्ञान गतिविधि को मापने के द्वारा रक्त मोनोसाइट्स की प्राइमिंग स्थिति का आकलन करने के लिए एक नई तकनीक विकसित की , 17. हमारे दृष्टिकोण तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल या तो एक chemoattractant के साथ भरी हुई इंजेक्शन शामिल है - हम आमतौर पर MCP-1 का उपयोग करें - या वाहन में छोड़ दिया और सही पार्श्व में, क्रमशः, चूहों की. जब ध्यान से subcutaneously इंजेक्शन, तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल एक एकल प्लग, जिसमें से chemokines फैलाना और एक परिभाषित chemotactic ढाल है कि आसपास के चयापचय या भड़काऊ राज्य से प्रभावित नहीं है बना सकते हैं फार्म का निर्माण होगा ऊतक या प्राप्तकर्ता माउस.
तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल हम अपने परख के लिए उपयोग एक solubilized तहखाने झिल्ली तैयार Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) माउस सार्कोमा, इस तरह के extracellular मैट्रिक्स (ECM) प्रोटीन में समृद्ध एक ट्यूमर से निकाला है. इस जटिल प्रोटीन मिश्रण में लेमिनिन (60%), कोलेजन IV (30%), ब्रिजिंग अणु एन्ैक्टिन (8%), और कई विकास कारक होते हैं। बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स प्लग परख को मूल रूप से विभिन्न विकास कारकों18,19के प्रत्युत्तर में एंजियोजेनेसिस की जांच करने के लिए विकसित किया गया था . हालांकि, मोनोसाइट कीमोटैक्सिस का अध्ययन करने के लिए, एंडोथेलियल सेल भर्ती और एंजियोजेनेसिस को कम करने के लिए विकास कारक-विक्षत तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। क्या Matrigel बनाता है (के रूप में तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल अब से संदर्भित) अद्वितीय और विशेष रूप से उपयोगी है कि 10 डिग्री सेल्सियस से नीचे तापमान पर यह तरल पदार्थ, chemokines भंग करने के लिए अनुमति देता है. 22 डिग्री सेल्सियस से ऊपर के तापमान पर, तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न समाधान तेजी से एक चरण संक्रमण से होकर गुजरती है और तेजी से एक हाइड्रोजेल बनाती है। प्लग शल्य चिकित्सा excised किया जा सकता है, साफ और एक बेसिलस व्युत्पन्न तटस्थ धातु loprotease के साथ भंग करने के लिए एकल सेल निलंबन उपज, जो एक फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल सॉर्टर (FACS) पर विश्लेषण किया जा सकता है, आरएनएसेक द्वारा, एकल सेल आरएनए और अन्य की एक किस्म omics तकनीक. यहाँ हम तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग एक, इंजेक्शन के बाद तीन या पांच दिनों में भर्ती सेल आबादी की विशेषता के लिए एकल कोशिका पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के उपयोग का वर्णन.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:628px;" width="628">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">10 cm petri dish</td>
			<td style="width:103px;">griner bio-one</td>
			<td style="width:123px;">664 160</td>
			<td style="width:184px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">10x suspension buffer</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">R101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">15 cm petri dish</td>
			<td style="width:103px;">Falcon</td>
			<td style="width:123px;">353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:103px;">MP BIOMEDICALS</td>
			<td style="width:123px;">2194705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">5% washing buffer</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">R252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Antibody diluent</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">042-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Bench Top Centrifuge</td>
			<td style="width:103px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Microfuge 22R Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Bovine Serim Albumin</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Calcein AM</td>
			<td style="width:103px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">C3099</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">CD11b</td>
			<td style="width:103px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:123px;">NB110-89474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">CD45 (D4H7K) rabbit mAb</td>
			<td style="width:103px;">Cell Signal Technologies</td>
			<td style="width:123px;">727987S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">CD68/SR-D1 (FA-11)</td>
			<td style="width:103px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:123px;">NBP2-33337SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Cellometer Vision</td>
			<td style="width:103px;">Nexcelom</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Dispase</td>
			<td style="width:103px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">354235</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Dissecting sissor</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Donkey anti-Rabbit IgG secondary antibody [NL557]</td>
			<td style="width:103px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:123px;">NL004</td>
			<td>NL 557 conjugate</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:219px;">Donkey anti-Rat IgG (H+L) secondary antibody [DyLight 650]</td>
			<td style="width:103px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:123px;">NBP1-75655</td>
			<td>DyLight 650 conjugate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">F4/80 (CI-A3-1)</td>
			<td style="width:103px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:123px;">NB600-404SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Heat Block</td>
			<td style="width:103px;">effendorf</td>
			<td style="width:123px;">22331</td>
			<td>Thermomixer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Lysis/Running buffer</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">R200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Matrigel Matrix (Grwoth Factor Reduced)</td>
			<td style="width:103px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">354230</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Microarray scanner</td>
			<td style="width:103px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:123px;">ScanArray Gx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Microscope</td>
			<td style="width:103px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">Evos fl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Milo</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Single cell western</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Needle</td>
			<td style="width:103px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">305111</td>
			<td>26G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Parafilm</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Probing chamber</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">035-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Recombinant mouse CCL2/JE/MCP-1 protein</td>
			<td style="width:103px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:123px;">479-JE-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">scWEST chip</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">C300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Shaker</td>
			<td style="width:103px;">Bioexpress</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Gene mate orbital shaker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Single cell western chip canister</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">035-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Slide spinner</td>
			<td style="width:103px;">Labnet</td>
			<td style="width:123px;">C1303-T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP 166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Syringe</td>
			<td style="width:103px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">309602</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Tris-Hydrochloride</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP 153-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Tweezer</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">035-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Water bath</td>
			<td style="width:103px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of monocyte chemotactic activity in vivo and characterization of blood monocyte derived macrophages

ऊतक होमोस्टेसिस और मरम्मत एककोशिका व्युत्पन्न मैक्रोफेज की भर्ती पर गंभीर रूप से निर्भर हैं। मोनोसाइट व्युत्पन्न मैक्रोफेज की कम और अधिक भर्ती दोनों घाव भरने को बाधित कर सकते हैं। हमने दिखाया है कि उच्च वसा और उच्च चीनी आहार monocyte प्राइमिंग और रोग को बढ़ावा देने, एक अति chemotactic phenotype में स्वस्थ रक्त monocytes परिवर्तित करने के लिए dysregulated सक्रियण प्रोफाइल और बिगड़ा phenotypic के साथ मैक्रोफेज में अंतर करने के लिए तैयार Plasticity. मोनोसाइट व्युत्पन्न मैक्रोफेज की अधिक भर्ती और डिस्विनियमित सक्रियण प्रोफाइल के साथ मैक्रोफेज की भर्ती चयापचय विकारों से जुड़े पुरानी सूजन रोगों के विकास में एक प्रमुख योगदानकर्ता माना जाता है, atherosclerosis और मोटापा सहित. इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य monocyte प्राइमिंग और रोग के लिए एक biomarker के रूप में रक्त monocytes की chemotactic गतिविधि मात्रा निर्धारित करने के लिए और मैक्रोफेज phenotype रक्त monocytes की विशेषता के लिए इन माउस मॉडल में अंतर करने के लिए तैयार हैं. एकल कोशिका पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का उपयोग करके, हम बताते हैं कि 24 एच 33% के बाद एमसीपी-1-लोडेड तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग में भर्ती किया गया है जो चूहों में इंजेक्ट किया जाता है मोनोसाइट्स और मैक्रोफेज हैं; दिन 3 के बाद 58%. हालांकि, 5 दिन, मोनोसाइट और मैक्रोफेज संख्या में काफी कमी आई थी। अंत में, हम बताते हैं कि इस परख भी शल्य चिकित्सा से प्राप्त तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग, जो तब एकल सेल पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा बाद में विशेषता के अधीन किया जा सकता से रहते मैक्रोफेज के अलगाव के लिए अनुमति देता है.

chemoattractants के लिए रक्त monocytes की प्रतिक्रिया का उपयोग करने के लिए, हम वाहन से भरी हुई इंजेक्शन और MCP-1 भरी हुई तहखाने झिल्ली प्रत्येक माउस के बाएँ और दाएँ flanks में समाधान व्युत्पन्न. बेसमेंट झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग इंजेक्शन के बाद 1, 3 और 5 दिन हटा दिया गया, भंग और प्रत्येक प्लग में भर्ती कोशिकाओं को गिना गया (चित्र 1A)। MCP-1 लोडेड प्लग (बंद सलाखों) में सेल गिनती से वाहन से भरी हुई प्लग (खुले सलाखों) में सेल गिनती घटाकर, हम विशेष रूप से MCP-1 के जवाब में भर्ती कोशिकाओं की संख्या प्राप्त (जेड सेल संख्या, चित्र 1B). हमने 5 दिन की अवधि में एक त्वरित MCP-1-विशिष्ट भर्ती और कोशिकाओं के संचय को देखा, दर 31,000 कोशिकाओं/दिन (दिन 1) से बढ़कर 78,000 सेल/दिन (दिन 3) और दिन में 136,000 सेल/
तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग में प्रवेश किया है कि सेल प्रकार की पहचान करने के लिए, हम प्रत्येक प्लग से एकल सेल पश्चिमी धब्बा विश्लेषण (scWB) के लिए अलग कोशिकाओं के अधीन, CD45 के लिए जांच, CD11b और F4/80 अभिव्यक्ति monocytes की पहचान करने के लिए (CD11b+F4/ -), मैक्रोफेज (CD11b+F4/80+ प्लस CD11b-F4/80+ )और शेष गैर-मोनोसाइटिक ल्यूकोसाइट्स (CD45+CD11b-F4/80- )(चित्र ााा २) SWB चिप्स तो vinculin के लिए जांच की प्रत्येक जेल पर कुल सेल संख्या निर्धारित करने के लिए और sWB चिप पर microwells के एकल सेल अधिभोग की पुष्टि कर रहे थे. MCP-1-लोडेड बेसमेंट झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग के भीतर monocytes का प्रतिशत दिन 1, 20% पर कम था, 47% पर क्रमशः दिन 3 पर नुकीला, दिन में 14% करने के लिए छोड़ने से पहले 5 (चित्र 2 डी). MCP-1-लोडेड तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग के भीतर Macrophage संख्या दिन 1 में 13% से तेजी से वृद्धि हुई, दिन 3 पर 22% और दिन 5 पर 23%. MCP-1-लोडेड प्लग के लिए, अलग सेल आबादी के भीतर monocytes प्लस मैक्रोफेज का प्रतिशत दिन में सबसे अधिक था 3, वाहन लोड ेड प्लग में 31% (चित्र 3 ए) और MCP-1-लोडेड प्लग में 58% ( चित्र3B),यह दर्शाता है कि 3 दिनों के बाद MCP-1-निर्भर रसायन रोग द्वारा भर्ती कोशिकाओं के विशाल बहुमत monocytes और मैक्रोफेज हैं. यद्यपि दिन 3 की तुलना में मोनोसाइट्स प्लस मैक्रोफेज की कुल संख्या दिन 5 में अधिक थी (चित्र 3C और D), कुल कोशिका जनसंख्या में मोनोसाइट्स और मैक्रोफेज के काफी अधिक अनुपात के कारण ( चित्र3A औरबी), दिन 3 में सेल गिनती अधिक सही रक्त monocyte chemotaxis और भर्ती को दर्शाता है. इसलिए, हम नियमित रूप से जानवरों का त्याग करने से तीन दिन पहले तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न समाधान इंजेक्ट करते हैं। क्या एमसीपी-1 द्वारा भर्ती किए गए सभी मैक्रोफेज मोनोसाइट व्युत्पन्न हैं या पड़ोसी ऊतकों से भर्ती निवासी मैक्रोफेज हैं जो योगदान दिया गया था।
यहाँ दिखाए गए आंकड़ों का सांख्यिकीय विश्लेषण विश्लेषण सॉफ्टवेयर (उदा., सिग्माप्लॉट 14) के साथ किया गया था। ANOVA फिशर LSD परीक्षण के बाद प्रयोगात्मक समूहों के बीच मतलब मूल्यों की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. सभी डेटा मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं - कम से कम 3 स्वतंत्र प्रयोगों की एसडी. परिणाम ों को पी एंड एलटी; 0.05 स्तर पर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना गया था।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59706/59706fig1v2.jpg"> चित्र 1 : स्त्वकित: तलवंसी तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग में भर्ती कोशिकाओं की मात्रा. (क) वाहन से भरी हुई (खुली छड़) और एमसीपी-1-लोडेड बेसमेंट झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग (बंद बार) के लिए पूर्ण सेल नंबर। (ख) एम सी पी-1 द्वारा बेसमेंट मेम्ब्रेन व्युत्पन्न जेल प्लग में भर्ती कोशिकाओं की संख्या की गणना एमसीपी-1-लोडेड और वाहन से भरी हुई प्लग ों के बीच सेल संख्यामें तब्दील होने के रूप में की जाती है। परिणाम मतलब के रूप में दिखाए जाते हैं - एसडी (n ]4) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59706/59706fig1v2large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59706/59706fig2.jpg"> चित्र 2 : एकल कोशिका पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग में भर्ती सेल आबादी का विश्लेषण। (ए + बी) प्रतिनिधि उदाहरण एक वाहन लोड (नियंत्रण) और एक MCP-1 नेतृत्व प्लग (MCP-1) इंजेक्शन के बाद तीन दिन एक माउस से अलग के sWB विश्लेषण के लिए दिखाए जाते हैं. सीडी 45, सीडी 11बी और एफ 4/80 के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के साथ लेबल चिप्स, प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी के बाद। प्रत्येक व्यक्ति के सेल के लिए लेबल बैंड की फ्लोरोसेंट तीव्रता शिखर क्षेत्र के रूप में दिखाया गया है। (सी + डी) सेल आबादी monocytes के रूप में पहचान की गई (CD11b+F4/80-, <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59706/59706img01.jpg"> </img>, ), मैक्रोफेज (CD11b+F4/80+ प्लस CD11b-F4/80+, , <img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/59706/59706img02.jpg" style="font-size: 14px;"> </img>) या गैर-monocytic ल्यूकोसाइट्स के रूप में (CD45+ , <img alt="Image 3" src="/files/ftp_upload/59706/59706img03.jpg" style="font-size: 14px;">). शेष कक्षों को "अन्य"<img alt="Image 4" src="/files/ftp_upload/59706/59706img04.jpg" style="font-size: 14px;">() लेबल किया गया था। परिणाम माध्य के रूप में दिखाए जाते हैं - एसडी (द र् 3)। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59706/59706fig2large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59706/59706fig3.jpg"> चित्र 3 : तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग के मोनोसाइट और मैक्रोफेज सामग्री। वाहन से भरी हुई और एमसीपी-1-लोडेड प्लग में भर्ती मोनोसाइट और मैक्रोफेज सामग्री का मात्रात्मक विश्लेषण दिन 1, 3 और 5 के बाद इंजेक्शन पर हटा दिया गया। मान कुल कोशिका जनसंख्या के प्रतिशत के रूप में दिखाए जाते हैं (ए + बी) और पूर्ण कक्ष संख्याओं में प्रति प्लग (ब़् त द) . परिणाम माध्य के रूप में दिखाए जाते हैं - एसडी (द र् 3)। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59706/59706fig3large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>

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Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

यहाँ हम माउस मॉडल में रक्त monocytes की chemotactic गतिविधि की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत, रक्त मोनोसाइट पर पोषण, औषधीय और आनुवंशिक हस्तक्षेप के प्रभाव का आकलन करने के लिए और रक्त monocytes व्युत्पन्न मैक्रोफेज की विशेषता के लिए एकासाइट-केमोएक्टेंट प्रोटीन-1 (एमसीपी-1) लोडेड बेसमेंट झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग का उपयोग करने वाले माउस मॉडल।

विवो में मोनोसाइट केमोटेक्टिक गतिविधि का परिमाणीकरण और रक्त मोनोसाइट व्युत्पन्न मैक्रोफेज की विशेषता

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

यह पद्धति हमें जीवित जानवरों में रक्त मोनोसाइट की रसायनविज्ञानी गतिविधि की मात्रा निर्धारित करने और मोनोसाइट फ़ंक्शन और उनके अंतर्निहित तंत्रों पर खराब आहार के प्रभाव का अध्ययन करने की अनुमति देती है। मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज को अलग-थलग किया जा सकता है और विश्लेषण किया जा सकता है, जिसमें एकल कोशिका और ओमिक्स तकनीक शामिल हैं जो माउस मॉडल में रक्त मोनोसाइट साइट के स्वास्थ्य का स्नैपशॉट प्रदान करते हैं। आज की प्रक्रिया डॉ युवा Joo Ahn मेरी प्रयोगशाला में एक सहायक प्रोफेसर द्वारा आयोजित किया जाएगा, और डॉ Luxi वांग, मेरी प्रयोगशाला में एक postdoc ।प्रक्रिया शुरू करने से पहले, कीटाणुनाशक के साथ सेल संस्कृति हुड को साफ करें और बर्फ पर विकास कारक-कम तहखाने झिल्ली-व्युत्पन्न समाधान को पूरी तरह से पिघला दें। 26 गेज सुइयों के साथ व्यक्तिगत बाँझ एक मिलीलीटर सीरिंज से लैस करें और सुई को बर्फ पर रखें। एक बार समाधान गल जाने के बाद, हर एक मिलीलीटर सिरिंज में केमो को आकर्षित करने के साथ या बिना पूरक समाधान के 500 माइक्रो लीटर लोड करने से पहले एक शराब झाड़ू के साथ तहखाने झिल्ली-व्युत्पन्न समाधान शीशी के शीर्ष को मिटा दें।फिर एक समान प्लग गठन सुनिश्चित करने के लिए तहखाने झिल्ली-व्युत्पन्न समाधान भरी हुई सिरिंज से किसी भी हवा के बुलबुले को हटा दें। अंगुली चुटकी के लिए प्रतिक्रिया की कमी की पुष्टि करने के बाद, धीरे-धीरे एमसीपी-1 के बिना तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न समाधान की एक पूरी मात्रा इंजेक्ट करने के लिए लगभग १०० माइक्रो लीटर प्रति सेकंड में संक्षेप में एनेस्थेटाइज्ड माउस के सही पार्श्व में जोड़ा । और तहखाने झिल्ली के पूरे 500 माइक्रो लीटर-व्युत्पन्न समाधान जानवर के बाईं पार्श्व में एमसीपी-1 के साथ पूरक।समाधान के रिसाव को रोकने के लिए इंजेक्शन के बाद 20 से 30 सेकंड जगह में सिरिंज पकड़ो और पूर्ण वसूली तक निगरानी के साथ एक वार्मिंग पैड पर माउस रखने से पहले एक एकल, चिकनी जेल प्लग बनाने के लिए अनुमति देने के लिए । इंजेक्शन के तीन दिन बाद, एक प्लग-इंजेक्शन जानवर से पृष्ठीय बालों को हटा दें और निचले वक्ष और ऊपरी काठ के कशेरुका के आसपास त्वचा को समझने के लिए संदंश का उपयोग करें। त्वचा में दो मिलीमीटर लंबा चीरा बनाएं और गर्भाशय ग्रीवा कशेरुकी से माउस के पीछे के मिडलाइन के साथ कोडल कशेरुका जंक्शन के ऊपर एक सेंटीमीटर तक काटें।त्वचा को मांसपेशी परत से अलग करें और पॉलीस्टीरिन फोम प्लेटफॉर्म पर त्वचा को पिन करें। इसके बाद, एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, ध्यान से रेशेदार कैप्सूल को समझें जिसमें तहखाने झिल्ली-व्युत्पन्न जेल प्लग होता है और रेशेदार कैप्सूल को हटाने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करता है। फिर प्लग को साफ करने के लिए ठीक कैंची का उपयोग करें।फिर साफ तहखाने झिल्ली-व्युत्पन्न जेल प्लग को उचित लेबल में स्थानांतरित करें और 1.5 मिलीलीटर माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब का वजन करें। तहखाने झिल्ली-व्युत्पन्न जेल प्लग के वजन की गणना करने के लिए ट्यूब को फिर से तैयार करें। तहखाने झिल्ली-व्युत्पन्न जेल प्लग पाचन के लिए, प्रत्येक माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब में तहखाने झिल्ली-व्युत्पन्न जेल प्लग कीमा बनाने के लिए साफ ठीक कैंची का उपयोग करें और प्लग में विस्थापित के 800 माइक्रो लीटर जोड़ें।प्लग को बाधित करने के लिए 10 सेकंड के लिए अधिकतम गति पर भंवर और बेसमेंट झिल्ली-व्युत्पन्न जेल प्लग को पूरी तरह से भंग करने के लिए प्रति मिनट 1400 घूर्णन पर थर्मो मिक्सर में दो घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब रखें। इनक्यूबेशन के अंत में, दो बार अपकेंद्रित्र द्वारा प्लग के टुकड़ों को तलछट करें और पीबीएस के 300 माइक्रोलीटर में छर्रों को फिर से खर्च करें। प्रत्येक कोशिका निलंबन के 50 माइक्रोलीटर को नई माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूबों में स्थानांतरित करें और कैल्सिन के 0.5 माइक्रोलीटर के साथ नई ट्यूबों में कोशिकाओं को लेबल करें।एक कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन 10 मिनट के बाद, एक स्वचालित सेल काउंटर पर सकारात्मक और मृत गैर फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की संख्या गिनती । एक एकल सेल पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए, एक 10 सेंटीमीटर पेट्री डिश के नीचे में एक पुनर्हाइड्रेटेड एकल सेल पश्चिमी दाग चिप के लिए पतला एकल सेल निलंबन का एक मिलीलीटर जोड़ें । पांच से 15 मिनट के बाद ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी के नीचे चिप की जांच करें।लगभग 15 से 20% सूक्ष्म कुओं को एक ही कोशिका द्वारा कब्जा किया जाना चाहिए और दो प्रतिशत से कम कुओं में दो या अधिक कोशिकाएं होनी चाहिए । अगर चिप को ठीक से लोड किया गया है तो डिश को 45 डिग्री झुकाएं और किसी भी अनकैप्चर्ड सेल्स को हटाने के लिए चिप को तीन बार सस्पेंशन बफर से धोएं। आखिरी वॉश के बाद, सावधानी से और चिप को एक सेल वेस्टर्न इंस्ट्रूमेंट, जेल-साइड अप के इलेक्ट्रोफोरेसिस सेल में लोड करें, और लाइसिस रनिंग बफर के साथ पूरे सिंगल सेल वेस्टर्न ब्लॉट चिप को कवर करें।सेल लाइसिस शुरू करें और उपयुक्त प्रयोग मापदंडों के अनुसार उपकरण चलाएं। रन के अंत में, कमरे के तापमान पर प्रति धोने ताजा धोने बफर के साथ दो 10 मिनट के वॉश के साथ चिप कुल्ला । दूसरे धोने के बाद, एंटीबॉडी जांच कक्ष में ब्याज के प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 80 माइक्रोलीटर जोड़ें और चिप जेल-साइड को कम करें ताकि चिप में एंटीबॉडी समाधान बाती हो।कमरे के तापमान पर दो घंटे के बाद, चिप को धोने में तीन बार बफर और एक बार पानी में एक शेखर पर धोएं। प्रकाश से संरक्षित कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए एक उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ चिप को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के अंत में, चिप को धोने के साथ तीन बार धोने के बफर को धोएं और किसी भी शेष वाशिंग बफर को हटाने के लिए एक स्लाइड स्पिनर पर चिप को स्पिन करें।एकल सेल पश्चिमी दाग चिप पट्टी करने के लिए, एक 60 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में एक 15 मिलीलीटर ट्यूब रैक रैक के ऊपर सिर्फ एक सेंटीमीटर पानी के साथ जगह है। एक धूम हुड में, एक कनस्तर में बफर स्ट्रिपिंग बफर के 40 मिलीलीटर और बीटा मोर्सेप्टा इथेनॉल के 320 माइक्रोलीटर जोड़ें। कनस्तर के अंदर 10 सेंटीमीटर पेट्री डिश में चिप रखें और पैराफिल्म के साथ कनस्तर को सील करें।इसके बाद कनस्तर को पानी के बाथ में ट्यूब रैक के अंदर रखें। 90 मिनट के बाद, चिप को एक नई पेट्री डिश में सावधानी से स्थानांतरित करें और शेकर पर 15 मिनट धोने के लिए पेट्री डिश में 15 मिलीलीटर ताजा वाशिंग बफर जोड़ने से पहले चिप को वॉश बफर के साथ एक बार धोएं। इस प्रतिनिधि प्रयोग में, प्रत्येक प्लग में भर्ती कोशिकाओं को इंजेक्शन के बाद एक, तीन और पांच दिनों में गिना गया था।एमसीपी-1 लोडेड प्लग में सेल काउंट से वाहन-लोडेड प्लग में सेल काउंट घटाकर, विशेष रूप से कीमो आकर्षित करने के जवाब में भर्ती की गई कोशिकाओं की संख्या की गणना की गई। एक त्वरित MCP-1 विशिष्ट भर्ती और कोशिकाओं के संचय पांच दिन की अवधि में मनाया गया था, दरों के साथ प्रति दिन 31, 000 कोशिकाओं से बढ़ रही है इंजेक्शन के एक दिन के बाद १३६, 000 कोशिकाओं को प्रति दिन, इंजेक्शन के पांच दिन बाद । एकल सेल पश्चिमी दाग विश्लेषण तो ब्याज की विशिष्ट प्रतिरक्षा सेल मार्कर की उनकी अभिव्यक्ति के अनुसार, तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न प्लग के लिए भर्ती विभिन्न सेल प्रकार की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।उदाहरण के लिए, एमसीपी-1 लोडेड बेसमेंट झिल्ली-व्युत्पन्न जेल प्लग के भीतर मोनोसाइट्स का प्रतिशत एक दिन में कम था और पांच दिन में फिर से छोड़ने से पहले तीन दिन में नुकीला था, जबकि मैक्रोफेज संख्या पूरे अध्ययन अवधि में तेजी से बढ़ी । एमसीपी-1 लोडेड प्लग के लिए, अलग सेल आबादी के भीतर मोनोसाइट्स प्लस मैक्रोफेज का प्रतिशत तीन दिन में सबसे अधिक था, यह दर्शाता है कि तीन दिनों के बाद, एमसीपी-1 निर्भर कीमोटैक्सिस द्वारा भर्ती की गई अधिकांश कोशिकाएं मोनोसाइट्स और मैक्रोफेज थीं । हालांकि मोनोसाइट्स प्लस मैक्रोफेज की कुल संख्या आमतौर पर तीन दिन की तुलना में पांच दिन में अधिक होती है, तीन दिन में सेल गिनती अधिक सटीक रूप से मोनोसाइट केमोटैक्सिस और भर्ती के परिधीय रक्त को दर्शाती है, और इसलिए तीन दिन तहखाने झिल्ली-प्रत्यक्ष प्लग विश्लेषण के लिए अनुशंसित है।डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए एकल कोशिकाओं का सफल अधिग्रहण इंजेक्शन की सटीकता और प्लग को पूरी तरह से हटाने पर निर्भर करता है। फ्लो साइटोमेट्री, सिंगल सेल वेस्टर्न ब्लॉटिंग, बल्क, या सिंगल सेल आरएनए सीक्वेंसिंग और अन्य ओमिक्स प्रक्रियाओं का उपयोग भर्ती मोनोसाइट और मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज की विशेषता और फेनोटाइप का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

सक्रियण और मानव monocyte व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं में आईएल 1β का प्रयोग NLRP3 inflammasome गतिविधि की माप

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक कारक विभेदित मानव monocyte व्युत्पन्न मैक्रोफेज की संस्कृति

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

मानव रक्त में मापने कणांकुर और Monocyte phagocytosis और ऑक्सीडेटिव फट गतिविधि

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

इमेजिंग से फ्लो द्वारा मानव monocyte व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं की विशेषता: दो Monocyte अलगाव प्रोटोकॉल के बीच एक तुलना

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

पूरे रक्त से मानव monocyte व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं की पीढ़ी

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate FcÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Receptor-mediated Phagocytosis

मूल्यांकन करने के लिए एक Monocyte Monolayer परख का उपयोग Fcγ रिसेप्टर की मध्यस्थता Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

फ्लो साइटोमैट्री द्वारा सेंट्रल नर्वस सिस्टम से माइक्रोग्लिया और मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज का विश्लेषण

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

बढ़ाता मानव Monocyte Chemotaxis इन विट्रो और Murine लिम्फोसाइट ्े में Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

पूरे रक्त प्रवाह Cytometry विश्लेषण द्वारा मानव Monocyte सबसेट का लक्षण वर्णन

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

विट्रो उत्तेजना और विक्षेत मानव मोनोसाइट व्युत्पन्न मैक्रोफेज में extracellular ट्रैप रिलीज के दृश्य

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...