Name: quantification of monocyte chemotactic activity in vivo and characterization of blood monocyte derived macrophages
Uploaded: 2019-08-12T13:30:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages at JoVE.com

Questo progetto è stato sostenuto da sovvenzioni a R.A. dal NIH (AT006885).

Tutti i metodi descritti in questo protocollo sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Wake Forest School of Medicine.
1. Preparazione della soluzione derivata dalla membrana del basamento con carico MCP-1
 NOT:</</c0> Questa è una procedura sterile.
<ol><li>Cappa di coltura cellulare pulita con disinfettante prima di preparare la soluzione derivata dalla membrana seminterrato (ad esempio, Matrigel).</li>
	<li>Preparare la siringa sterile da 1 mL imballata individualmente e pulire la parte superiore della fiala derivata dalla membrana seminterrato con un tampone di alcool prima di caricarla nella siringa.</li>
	<li>Scongelare completamente la soluzione derivata dalla membrana del seminterrato ridotta completamente dal suolo sul ghiaccio. ATTENZIONE: Se la matrice della membrana del seminterrato viene scongelata a temperatura ambiente (RT), assicurarsi che una piccola particella di ghiaccio rimanga per evitare che la soluzione si geli.</li>
	<li>Una volta scongelato, aprire la fiala e mescolare MCP-1 o 1xPBS con 0.1% BSA nella cappa di coltura cellulare.</li>
	<li>Preparare una siringa sterile da 1 mL con un ago da 26 G e raffreddare sul ghiaccio.</li>
	<li>Preparare una soluzione stock di MCP-1 sciogliendo MCP-1 a una concentrazione finale di 50 g/mL in 1 x PBS con 0,1% BSA.</li>
	<li>Diluire MCP-1 in 5 mL fredda terra membrana-derivata soluzione ad una concentrazione finale di 500 ng/mL. Preparare una quantità uguale di soluzione derivata dalla membrana del seminterrato solo con il veicolo (1x PBS contiene 0,1% BSA).</li>
	<li>Caricare 500 l di soluzione derivata dalla membrana del seminterrato (con o senza MCP-1) nella siringa fredda da 1 mL.</li>
	<li>Rimuovere tutte le bolle d'aria dalla siringa derivata dalla membrana del seminterrato prima di effettuare l'iniezione per garantire una formazione uniforme della spina.</li>
</ol>2. Iniezione di soluzione derivata da membrana sotterranea
<ol><li>Spruzzare il 70% di etanolo intorno all'area di procedura prima e durante le iniezioni per disinfettare l'ambiente.</li>
	<li>Per indurre l'anestesia, posizionare il topo in una camera di anestesia e impostare il misuratore di flusso O2 a 1 litro/min, quindi regolare il vaporizzatore al 2% isoflurane.</li>
	<li>Monitorare la profondità dell'anestesia monitorando la frequenza respiratoria (tasso/min), il riflesso corneale e il movimento dei baffi.</li>
	<li>Durante l'intera procedura, mantenere l'anestesia utilizzando un cono naso.</li>
	<li>Durante la procedura continuare a monitorare la frequenza respiratoria (tasso/min), riflesso corneale e movimento dei baffi per verificare la profondità dell'anestesia.</li>
	<li>Dopo aver confermato la mancanza di risposta al pizzico di punta, iniettare lentamente (circa 100 l/s) la soluzione derivata dalla membrana del seminterrato sottocutaneamente a destra (senza MCP-1) e a sinistra (con MCP-1) fianco del mouse, rispettivamente. Se l'iniezione è troppo lenta, i tappi di gel derivati dalla membrana del seminterrato possono diventare di forma irregolare, o addirittura frammentati, e difficili da rimuovere.</li>
	<li>Tenere la siringa per 20-30 s dopo l'iniezione per evitare la perdita della soluzione e per consentire la formazione di un singolo gel-plug liscio.</li>
	<li>Dopo l'iniezione, posizionando il mouse sulla piastra di riscaldamento con il monitoraggio fino al recupero.</li>
	<li>Riportare il mouse alla gabbia originale una volta che il mouse è completamente recuperato.</li>
</ol>3. Raccogliere le spine Gel derivate dalla membrana del seminterrato
<ol><li>Pesare due tubi di microcentrismo da 1,5 mL separati per ogni topo ed etichettarli.</li>
	<li>Tre giorni dopo l'iniezione della soluzione derivata dalla membrana del seminterrato, eutanasia il topo nella camera anestetica utilizzando 3% isoflurane seguita da lussazione cervicale.</li>
	<li>Rimuovere la pelliccia dorsale del mouse con tagliacapelli o applicare la crema per la rimozione dei capelli con bastoncini con punta di cotone per 5 min e poi pulire.</li>
	<li>Tenere la pelle del topo utilizzando pinze intorno alla vertebra lombare inferiore toracica e superiore e fare un'incisione lunga 2 mm nella pelle.</li>
	<li>Tagliare la linea mediana della parte posteriore del topo da un'incisione fatta fino alle vertebre cervicali e fino a 1 cm sopra la giunzione delle vertebre caudale (giunzione della coda) utilizzando forbici chirurgiche.</li>
	<li>Separare la pelle dallo strato muscolare e pin-down la pelle su una piattaforma di schiuma di polistirolo.</li>
	<li>Tenere con attenzione la capsula fibrosa che contiene il tappo di gel derivato dalla membrana seminterrato utilizzando pinze sottili e rimuovere la capsula fibrosa utilizzando forbici fini per pulire la spina.</li>
	<li>Rimuovere la spina di gel derivata dalla membrana del seminterrato pulita e trasferire a 1,5 mL di microcentrifuga (vedi 3.1).</li>
	<li>Pesare il tubo di microcentrifuga con la spina di gel derivata dalla membrana del seminterrato pulita e calcolare il peso del tappo di gel derivato dalla membrana del seminterrato.</li>
</ol>4. Digerire le spine Gel derivate dalla membrana del seminterrato
<ol><li>Dispase scongelato (10 mL) sul ghiaccio.</li>
	<li>Tritare la spina gel derivata dalla membrana del seminterrato nel tubo di microcentrifuga utilizzando forbici pulite e fini.</li>
	<li>Aggiungere 800 l di dispasi in ogni tubo di microcentrifuga contenente spina di gel derivata dalla membrana sotterranea.</li>
	<li>Vortex con velocità massima per 10 s per interrompere la spina.</li>
	<li>Incubare i tubi di microcentrifuga per 2 h a 37 gradi centigradi a 1.400 giri/min in un termomixer per sciogliere completamente la spina di gel derivata dalla membrana del seminterrato.</li>
	<li>Dopo 2 h, centrifugare a 400 x g per 10 min a RT. Rimuovere con attenzione e scartare il supernatale.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 1 mL di 1x PBS invertendo o toccando.</li>
	<li>Ripetere la centrifuga a 200 x g per 10 min a RT. Rimuovere con attenzione e scartare il supernatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 300 gradi L di PBS.</li>
	<li>Prendere 50 -L di sospensione cellulare in un tubo di microcentrifuga separato.</li>
	<li>Aggiungete alla sospensione cellulare 0,5 l di calceina AM (1 M). NOT:</</c2> Calcein AM è un coloranti di vitalità delle cellule fluorescenti verdi che si accumula solo nelle cellule viventi.</li>
	<li>Incubare le cellule in un'incubatrice di CO2 a 37 gradi centigradi per 10 min.</li>
	<li>Contare le cellule fluorescenti verdi (vive) e non fluorescenti (morte) utilizzando un contatore cellulare automatizzato.</li>
</ol>5. Determinazione della composizione cellulare nella sospensione cellulare utilizzando l'analisi Blot occidentale a cella singola (scWB)
<ol><li>Reidratare il chip scWB prima dell'uso in 15 mL di 1x tampone di sospensione in una piastra Petri per almeno 10 min a RT.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL della sospensione a singola cella diluita (10,000-100.000 cellule/mL) al chip reidratato. Impostare la superficie sul fondo di un piatto Petri di 10 cm. Assicurarsi che la superficie sia impostata su piatta.</li>
	<li>Coprire il piatto Petri con un coperchio per evitare l'essiccazione e lasciare che le cellule si accerchiano per 5-15 min per gradiente.</li>
	<li>Posizionare il chip al microscopio a campo luminoso e ispezionare i pozzetti con ingrandimento 10x. NOT:</</c0> Circa il 15-20% dei micropozzi devono essere occupati da una singola cellula, meno del 2% dei pozzi dovrebbe contenere 2 o più cellule</li>
	<li>Inclinare di 45 gradi la teglia Petri di 10 cm contenente il chip.</li>
	<li>Lavare il chip con il buffer di sospensione 1x per rimuovere le celle non catturate dalla superficie del chip con un leggero tubo dall'alto verso il basso del chip. Ripetere 3 volte.</li>
	<li>Preparare lo strumento occidentale a cella singola.</li>
	<li>Impostare il tempo di lisi, il tempo di elettroforesi e il tempo di cattura UV. Per analizzare i macrofagi reclutati recuperati dalla spina di gel derivata dalla membrana del seminterrato, utilizzare le seguenti impostazioni: tempo di lisi: 0 s; tempo di elettroforesi: 160 s; Tempo di cattura UV 240 s.</li>
	<li>Caricare con attenzione il chip nella cella di elettroforesi dello strumento occidentale a cella singola, rivolto verso il lato gel. Prestare attenzione a non danneggiare il lato gel del chip.</li>
	<li>Versare il buffer di lisi/corsa nella camera e coprire completamente l'intero chip occidentale a cella singola. Iniziare la lisi della cellula.</li>
	<li>Eseguire lo strumento scWB utilizzando l'impostazione elencata nella 5.8.</li>
	<li>Una volta completata la corsa, trasferire il chip in una parabola Petri da 10 cm e lavare il chip due volte con 1x buffer di lavaggio per 10 min a RT.</li>
	<li>Preparare le diluizioni dell'anticorpo primario (anti-vinculina: 1:10; anti-CD45: 1:15, anti-CD11b: 1:20, anti-F4/80: 1:10) in un volume totale di 80 -L di diluente (mix 8 - L of anticorpo 1 più 8 : L di anticorpo 2 più 64 L diluente).</li>
	<li>Aggiungere 80 l della soluzione anticorpale primaria alla camera di sonda anticorpale e abbassare il lato gel del chip verso il basso in modo che la soluzione anticorpale si blocca attraverso il chip.</li>
	<li>Incubare con la soluzione anticorpale primaria per 2 h a RT.</li>
	<li>Lavare il chip tre volte per 10 min in 1x tampone di lavaggio sullo shaker.</li>
	<li>Lavare il chip una volta per 10 min in acqua sullo shaker per dissalare il gel.</li>
	<li>Preparare una diluizione di 1:20 di anticorpi secondari in un volume totale di 80 -L (mix 2 - L di anticorpo secondario più 78 L di diluente).</li>
	<li>Incubare il chip con anticorpo secondario per 1 h a RT protetto dalla luce.</li>
	<li>Lavare il chip tre volte per 10 min con 1x tampone di lavaggio sullo shaker.</li>
	<li>Girare il chip utilizzando un filatore scorrevole per rimuovere il buffer di lavaggio rimanente.</li>
	<li>Eseguire la scansione del chip su uno scanner microarray a doppio laser a risoluzione di 5 m nel canale spettrale del fluoroforo accoppiato agli anticorpi secondari.</li>
	<li>Analizzare i dati utilizzando un software specifico di scWB.</li>
</ol>6. Spogliare il chip scWB
<ol><li>Conservare il chip scansionato nel buffer di lavaggio fino a quando non è pronto a spogliarsi.</li>
	<li>Mettere il bagno d'acqua in un cappuccio fume.</li>
	<li>Mettere un rack di tube da 50 mL nel bagno d'acqua con l'acqua appena 1 cm sopra il rack e impostare la temperatura dell'acqua a 60 gradi centigradi.</li>
	<li>Preparare il buffer di stripping. Per 1 L di soluzione di stripping buffer, sciogliere 9,85 g di Tris-HCl (pH 6,8) e 20 g di SDS in 900 mL di acqua distillata e regolare il pH. Quindi riempire con acqua distillata a 1L. Aggiungere lo 0,8% (v/v) di z-mercaptoetanolo (z-ME; 14,3 M) immediatamente prima di ogni utilizzo.</li>
	<li>Dopo la scansione iniziale, mettere il chip in un piatto Petri 10 cm prima di spogliarsi.</li>
	<li>Per ogni chip, prendere 40 mL di buffer di stripping e aggiungere 320 l di z-ME. AVVISO: il sito è tossico e pericoloso per l'uomo e l'ambiente. La seguente procedura deve essere eseguita in una cappa di fumi.</li>
	<li>Posizionare il chip nel contenitore e sigillare il contenitore con parafilm per evitare perdite d'acqua nel contenitore.</li>
	<li>Posizionare il contenitore all'interno del rack del tubo nel bagno d'acqua preriscaldato.</li>
	<li>Incubare per 90 min.</li>
	<li>Rimuovere con cura il chip dal contenitore e mettere in un piatto Petri fresco.</li>
	<li>Lavare brevemente il chip una volta con 1x tampone di lavaggio. Quindi aggiungere 15 mL di 1x detersivo tampone al piatto Petri.</li>
	<li>Lavare il chip per 15 min su uno shaker. Ripetere il passaggio di lavaggio quattro volte. NOT:</</c1> Il chip è pronto per il prossimo anticorpo primario (vedere i passaggi da 5.12 - 5.21).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Moore, K. J., Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+in+the+pathogenesis+of+atherosclerosis.">Macrophages in the pathogenesis of atherosclerosis.</a> Cell. 145 (3), 341-355 (2011).</li><li>Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-mediated+inflammation+in+metabolic+disease.">Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 738-749 (2011).</li><li>McNelis, J. C., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages,+immunity,+and+metabolic+disease.">Macrophages, immunity, and metabolic disease.</a> Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).</li><li>Akiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genistein,+a+specific+inhibitor+of+tyrosine-specific+protein+kinases.">Genistein, a specific inhibitor of tyrosine-specific protein kinases.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (12), 5592-5595 (1987).</li><li>Nahrendorf, M., Pittet, M. J., Swirski, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes:+protagonists+of+infarct+inflammation+and+repair+after+myocardial+infarction.">Monocytes: protagonists of infarct inflammation and repair after myocardial infarction.</a> Circulation. 121 (22), 2437-2445 (2010).</li><li>Gosling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCP-1+deficiency+reduces+susceptibility+to+atherosclerosis+in+mice+that+overexpress+human+apolipoprotein+B.">MCP-1 deficiency reduces susceptibility to atherosclerosis in mice that overexpress human apolipoprotein B.</a> Journal of Clinical Investigation. 103 (6), 773-778 (1999).</li><li>Fantuzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+CCR2+expression+and+functional+response+to+monocyte+chemotactic+protein+(MCP-1)+during+the+differentiation+of+human+monocytes:+role+of+secreted+MCP-1+in+the+regulation+of+the+chemotactic+response.">Loss of CCR2 expression and functional response to monocyte chemotactic protein (MCP-1) during the differentiation of human monocytes: role of secreted MCP-1 in the regulation of the chemotactic response.</a> Blood. 94 (3), 875-883 (1999).</li><li>Boring, L., Gosling, J., Cleary, M., Charo, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+lesion+formation+in+CCR2-/-+mice+reveals+a+role+for+chemokines+in+the+initiation+of+atherosclerosis.">Decreased lesion formation in CCR2-/- mice reveals a role for chemokines in the initiation of atherosclerosis.</a> Nature. 394 (6696), 894-897 (1998).</li><li>Han, K. H., Tangirala, R. K., Green, S. R., Quehenberger, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+CCR2+expression+and+monocyte+chemoattractant+protein-1-mediated+chemotaxis+in+human+monocytes.+A+regulatory+role+for+plasma+LDL.">Chemokine receptor CCR2 expression and monocyte chemoattractant protein-1-mediated chemotaxis in human monocytes. A regulatory role for plasma LDL.</a> Arteriosclerosis Thrombosis Vascular Biology. 18 (12), 1983-1991 (1998).</li><li>Kanda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCP-1+contributes+to+macrophage+infiltration+into+adipose+tissue,+insulin+resistance,+and+hepatic+steatosis+in+obesity.">MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (6), 1494-1505 (2006).</li><li>Davies, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+the+adhesion+molecules+ICAM-1,+VCAM-1,+PECAM,+and+E-selectin+in+human+atherosclerosis.">The expression of the adhesion molecules ICAM-1, VCAM-1, PECAM, and E-selectin in human atherosclerosis.</a> Journal of Pathology. 171, 223-229 (1993).</li><li>Anderson, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cholesterol-lowering+and+antioxidant+therapy+on+endothelium-dependent+coronary+vasomotion+(see+comments).">The effect of cholesterol-lowering and antioxidant therapy on endothelium-dependent coronary vasomotion (see comments).</a> New England Journal of Medicine. 332 (8), 488-493 (1995).</li><li>Herold, S., Mayer, K., Lohmeyer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+lung+injury:+how+macrophages+orchestrate+resolution+of+inflammation+and+tissue+repair.">Acute lung injury: how macrophages orchestrate resolution of inflammation and tissue repair.</a> Frontiers in Immunology. 2, (2011).</li><li>Qiao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol+Oxidative+Stress+Induced+by+Metabolic+Disorders+Amplifies+Macrophage+Chemotactic+Responses+and+Accelerates+Atherogenesis+and+Kidney+Injury+in+LDL+Receptor-Deficient+Mice.">Thiol Oxidative Stress Induced by Metabolic Disorders Amplifies Macrophage Chemotactic Responses and Accelerates Atherogenesis and Kidney Injury in LDL Receptor-Deficient Mice.</a> Arteriosclerosis Thrombosis Vascular Biology. 29, 1779-1786 (2009).</li><li>Ullevig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+Oxidase+4+Mediates+Monocyte+Priming+and+Accelerated+Chemotaxis+Induced+by+Metabolic+Stress.">NADPH Oxidase 4 Mediates Monocyte Priming and Accelerated Chemotaxis Induced by Metabolic Stress.</a> Arteriosclerosis Thrombosis Vascular Biology. 32 (2), 415-426 (2012).</li><li>Kim, H. S., Ullevig, S. L., Zamora, D., Lee, C. F., Asmis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+MAPK+phosphatase+1+controls+monocyte+migration+and+macrophage+recruitment.">Redox regulation of MAPK phosphatase 1 controls monocyte migration and macrophage recruitment.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 109 (41), E2803-E2812 (2012).</li><li>Kim, H. S., Tavakoli, S., Piefer, L. A., Nguyen, H. N., Asmis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytic+MKP-1+is+a+Sensor+of+the+Metabolic+Environment+and+Regulates+Function+and+Phenotypic+Fate+of+Monocyte-Derived+Macrophages+in+Atherosclerosis.">Monocytic MKP-1 is a Sensor of the Metabolic Environment and Regulates Function and Phenotypic Fate of Monocyte-Derived Macrophages in Atherosclerosis.</a> Scientific Reports. 6, 34223 (2016).</li><li>Ponce, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tube+formation:+an+in+vitro+matrigel+angiogenesis+assay.">Tube formation: an in vitro matrigel angiogenesis assay.</a> Methods in Molecular Biology. 467, 183-188 (2009).</li><li>Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+assays:+a+critical+overview.">Angiogenesis assays: a critical overview.</a> Clinical Chemistry. 49 (1), 32-40 (2003).</li><li>Kim, H. S., Ullevig, S. L., Nguyen, H. N., Vanegas, D., Asmis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+14-3-3zeta+controls+monocyte+migration.">Redox regulation of 14-3-3zeta controls monocyte migration.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (7), 1514-1521 (2014).</li><li>Short, J. D., Downs, K., Tavakoli, S., Asmis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Thiol+Redox+Signaling+in+Monocytes+and+Macrophages.">Protein Thiol Redox Signaling in Monocytes and Macrophages.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 816-835 (2016).</li><li>Tavakoli, S., Asmis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+and+thiol+redox+signaling+in+the+macrophage+biology+of+atherosclerosis.">Reactive oxygen species and thiol redox signaling in the macrophage biology of atherosclerosis.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 17 (12), 1785-1795 (2012).</li><li>Ullevig, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+S-Glutathionylation+Mediates+Macrophage+Responses+to+Metabolic+Cues+from+the+Extracellular+Environment.">Protein S-Glutathionylation Mediates Macrophage Responses to Metabolic Cues from the Extracellular Environment.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 836-851 (2016).</li></ol>

Abbiamo sviluppato un saggio chemiotassico in vivo, sfruttando le proprietà fisiche uniche della matrice derivata dalla membrana del seminterrato e la capacità di caricare questa matrice unica con chemiochini e iniettarla nei topi. Il test ci permette di valutare nei topi viventi la reattività dei monociti (e dei macrofagi) alle chemiochini, come illustrato qui per MCP-1, e gli effetti della manipolazione genetica o delle esposizioni farmacologiche, alimentari e di altro tipo sul monocito Chemiotassi. Poiché il gradiente di chemiochina che creiamo in questi topi non è essenzialmente influenzato dall'esposizione genetica, farmacologica, alimentare o ambientale, i cambiamenti nell'attività chemiotattica monocite riflettono effettivamente i cambiamenti funzionali in questi monociti e, come abbiamo dimostrato in precedenza, anche la riprogrammazione sia a livello proteico che trascrizionale17,20. Abbiamo riferito che lo stress metabolico nei topi aumenta la reattività monocitica al chemiodontico e che questa attività iper-chemiotassica è correlata con l'aumento della proteina S-glutathionylation, un reversibile, redox-dipendente post-traduzionale modificazione delle proteine, che nella maggior parte dei casi porta alla perdita di energia enzimatica e proteica21,22, e in alcuni casi anche promuove la degradazione delle proteine16,23.
Per eseguire con successo questa procedura e per ottenere risultati ottimali con questo saggio è fondamentale che i volumi precisi di soluzione derivata dalla membrana seminterrato vengano iniettati lentamente per creare un singolare spina ben formata e capsule fibrose devono essere rimosse completamente per ottenere tappi puliti durante il raccolto scalzo membrana-derivato tappi tappi gel, facilita la dissoluzione dell'intero plug nella soluzione dispasi. I nostri dati mostrano che lasciare la spina negli animali per tre giorni ottimizza 1) l'intensità del segnale, cioè il numero di monociti e macrofagi reclutati in ogni spina, 2) la selettività del segnale, vale a dire il contenuto di monociti e macrofagi all'interno del popolazioni cellulari totali e 3) la specificità del segnale, vale a dire l'aumento dei monociti e dei macrofagi in risposta all'MCP-1 rispetto al veicolo. Infine, dimostriamo come approcci a cellule singole all'avanguardia in combinazione con l'analisi della spina in gel derivata dalla membrana del seminterrato possono essere utilizzati per caratterizzare i monociti reclutati nei tappi e ottenere così un'istantanea del potenziale fenotipo di i macrofagi di origine monocite vengono reclutati in siti di lesioni in qualsiasi modello murino in risposta a specifici interventi genetici, farmacologici, dietetici o ambientali.
Ci sono una serie di limitazioni del saggio da considerare. In primo luogo, la movimentazione del mouse, tra cui l'anestesia, l'iniezione di soluzione derivata dalla membrana seminterrato e la dissezione chirurgica richiede pratica per generare singoli tappi e dati riproducibili. In secondo luogo, mentre la maggior parte delle cellule reclutate nei tappi caricati MCP-1 sono monociti e macrofagi, un numero sostanziale non lo sono. Questo può influenzare l'interpretazione di altri saggi analitici non basati su singole cellule eseguiti su questa popolazione cellulare. Infine, poiché le condizioni di lisi cellulare per scWB sono lievi, le distanze di migrazione delle proteine possono differire dalla STRUTTURA DI confronto standard e non possono essere correlate alle dimensioni delle proteine. Pertanto, sia la lisi cellulare che i tempi di esecuzione devono essere convalidati per ogni nuova proteina da testare e per ogni anticorpo primario utilizzato.

Il reclutamento di macrofagi di origine monocite è essenziale per lo sviluppo di malattie infiammatorie croniche associate a disturbi metabolici, tra cui aterosclerosi e obesità1,2,3, 4. Il numero di macrofagi derivati da monociti nei siti di lesioni ai tessuti e la loro plasticità sono fondamentali per l'omeostasi dei tessuti e la riparazione. Sia il sotto- che l'esapico dei macrofagi derivati da monociti possono compromettere la guarigione delle ferite5. Innescando l'infiammazione dei tessuti locali, ad esempio, dall'accumulo e dall'ossidazione della lipoproteina a bassa densità (LDL) nella parete aortica o dall'attivazione infiammatoria di adipociti da acidi grassi o lipopolissaccofaride batterica che fuoriescono attraverso il barriera, porta al rilascio di mediatori infiammatori, comprese le chemiochine come la proteina chemiosante monocito-1 (MCP-1/CCL2). MCP-1 è un membro della famiglia chemiochina C-C e un chemioattraente chiave responsabile del reclutamento di macrofagi di origine monocitica in siti di infiammazione tissutale e lesioni6,7,8, 9,10. L'attivazione infiammatoria dell'endotelio vascolare determina l'espressione di adere molecole come la molecola di adesione intercellulare 1 (ICAM-1) e la molecola di adesione cellulare vascolare 1 (VCAM-1)11,12, monociti circolanti attivati da MCP-1 per rotolare, aderire fermamente e successivamente trasmigrare nello spazio subendoteliale12. Infiltrarsi monociti si differenziano in macrofagi, che possono essere attivati in un fenotipo infiammatorio, guidando il processo infiammatorio acuto. Guidati dal microambiente, i macrofagi pro-infiammatori possono convertirsi in macrofagi che risolvono l'infiammazione, che svolgono un ruolo critico nella cancellazione delle cellule infiammatorie, rimuovendo i segnali pro-infiammatori e completando la riparazione e la ferita dei tessuti guarigione12,13.
Primi monociti di stress metabolico cronico monociti per una reattività drammaticamente migliorata agli attrattivi di chemio e aumento del reclutamento di monociti, e abbiamo dimostrato che i monociti innescati danno origine a macrofagi con programmi di attivazione disregolati e polarizzazione Stati14,15,16. Monocyte priming promuove l'aterosclerosi, l'obesità, e possibilmente altre malattie infiammatorie croniche associate a disturbi metabolici come steatoepatite, malattie renali e possibilmente cancro. Per valutare e quantificare l'innesco monocito nei modelli murini delle malattie umane, abbiamo sviluppato una nuova tecnica per valutare lo stato di innesco dei monociti del sangue misurando l'attività chemiotattica in vivo14,15,16, 17. Il nostro approccio prevede l'iniezione di gel derivato dalla membrana del seminterrato caricato con un chemioattraente - usiamo comunemente MCP-1 - o veicolo nel fianco sinistro e destro, rispettivamente, di topi. Quando iniettato con cura sottocutaneamente, il gel derivato dalla membrana del seminterrato formerà un singolo tappo, da cui le chemiochine possono diffondersi e creare un gradiente chemiotattico definito che non è influenzato dallo stato metabolico o infiammatorio dell'ambiente circostante tessuto o il mouse destinatario.
Il gel di base derivato dalla membrana che usiamo per il nostro saggio è una preparazione solubile della membrana del seminterrato estratta dal sarcoma murino Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), un tumore ricco di tali proteine a matrice extracellulare (ECM). Questa complessa miscela proteica contiene laminoina (60%), collagene IV (30%), la molecola di ponte entactin (8%) e una serie di fattori di crescita. Il test della spina a matrice a membrana seminterrato è stato originariamente sviluppato per studiare l'angiogenesi in risposta a vari fattori di crescita18,19. Tuttavia, al fine di studiare la chemiotassidi monocite, è importante utilizzare il gel di matrice derivata dalla membrana del seminterrato impoverito dal fattore di crescita per ridurre al minimo il reclutamento di cellule endoteliali e l'angiogenesi. Ciò che rende Matrigel (noto come gel derivato dalla membrana seminterrato d'ora in poi) unico e particolarmente utile è che a temperature inferiori ai 10 gradi si liquefa, permettendo lo scioglimento delle chemiochine. A temperature superiori ai 22 gradi centigradi, la soluzione derivata dalla membrana del seminterrato subisce rapidamente una transizione di fase e forma rapidamente un idrogel. Le spine possono essere ascise chirurgicamente, pulite e dissolte con una metalloproteasi neutra derivata da bacillo per produrre sospensioni a cella singola, che possono essere analizzate su una selezionatrice cellulare attivata a fluorescenza (FACS), da RNAseq, RNA a celle singole e una varietà di altri tecniche omiche. Qui descriviamo l'uso dell'analisi delle macchie occidentali unicellulari per la caratterizzazione delle popolazioni cellulari reclutate nei tappi di gel derivati dalla membrana seminterrato uno, tre o cinque giorni dopo l'iniezione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:628px;" width="628">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">10 cm petri dish</td>
			<td style="width:103px;">griner bio-one</td>
			<td style="width:123px;">664 160</td>
			<td style="width:184px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">10x suspension buffer</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">R101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">15 cm petri dish</td>
			<td style="width:103px;">Falcon</td>
			<td style="width:123px;">353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:103px;">MP BIOMEDICALS</td>
			<td style="width:123px;">2194705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">5% washing buffer</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">R252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Antibody diluent</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">042-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Bench Top Centrifuge</td>
			<td style="width:103px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Microfuge 22R Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Bovine Serim Albumin</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Calcein AM</td>
			<td style="width:103px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">C3099</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">CD11b</td>
			<td style="width:103px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:123px;">NB110-89474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">CD45 (D4H7K) rabbit mAb</td>
			<td style="width:103px;">Cell Signal Technologies</td>
			<td style="width:123px;">727987S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">CD68/SR-D1 (FA-11)</td>
			<td style="width:103px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:123px;">NBP2-33337SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Cellometer Vision</td>
			<td style="width:103px;">Nexcelom</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Dispase</td>
			<td style="width:103px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">354235</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Dissecting sissor</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Donkey anti-Rabbit IgG secondary antibody [NL557]</td>
			<td style="width:103px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:123px;">NL004</td>
			<td>NL 557 conjugate</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:219px;">Donkey anti-Rat IgG (H+L) secondary antibody [DyLight 650]</td>
			<td style="width:103px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:123px;">NBP1-75655</td>
			<td>DyLight 650 conjugate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">F4/80 (CI-A3-1)</td>
			<td style="width:103px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:123px;">NB600-404SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Heat Block</td>
			<td style="width:103px;">effendorf</td>
			<td style="width:123px;">22331</td>
			<td>Thermomixer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Lysis/Running buffer</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">R200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Matrigel Matrix (Grwoth Factor Reduced)</td>
			<td style="width:103px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">354230</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Microarray scanner</td>
			<td style="width:103px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:123px;">ScanArray Gx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Microscope</td>
			<td style="width:103px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">Evos fl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Milo</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Single cell western</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Needle</td>
			<td style="width:103px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">305111</td>
			<td>26G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Parafilm</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Probing chamber</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">035-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Recombinant mouse CCL2/JE/MCP-1 protein</td>
			<td style="width:103px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:123px;">479-JE-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">scWEST chip</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">C300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Shaker</td>
			<td style="width:103px;">Bioexpress</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Gene mate orbital shaker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Single cell western chip canister</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">035-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Slide spinner</td>
			<td style="width:103px;">Labnet</td>
			<td style="width:123px;">C1303-T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP 166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Syringe</td>
			<td style="width:103px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">309602</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Tris-Hydrochloride</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP 153-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Tweezer</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">035-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Water bath</td>
			<td style="width:103px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of monocyte chemotactic activity in vivo and characterization of blood monocyte derived macrophages

L'omeostasi dei tessuti e la riparazione dipendono in modo critico dall'assunzione di macrofagi derivati da monociti. Sia il sotto- che l'esapico dei macrofagi derivati da monociti possono compromettere la guarigione delle ferite. Abbiamo dimostrato che le diete ad alto contenuto di grassi e ad alto contenuto di zucchero promuovono l'innesco e la disfunzione monociti, convertendo monociti del sangue sani in un fenotipo iperchimico pronto a differenziarsi in macrofagi con profili di attivazione disregolati e fenotipici alterati plasticità. Si ritiene che l'eccessivo reclutamento di macrofagi derivati da monociti e il reclutamento di macrofagi con profili di attivazione disregolati siano un importante contributore allo sviluppo di malattie infiammatorie croniche associate a disturbi metabolici, tra cui l'aterosclerosi e l'obesità. L'obiettivo di questo protocollo è quantificare l'attività chemiotattica dei monociti del sangue come biomarcatore per l'innesco e la disfunzione monociti e caratterizzare i monociti del sangue del fenomeno dei macrofagi sono pronti a differenziarsi in questi modelli murini. Utilizzando l'analisi a macchia occidentale a singola cellula, mostriamo che dopo 24 h 33% delle cellule reclutate in fedi di gel derivate dalla membrana seminterrato MCP-1 caricate nei topi sono monociti e macrofagi; 58% dopo il giorno 3. Tuttavia, il giorno 5, i numeri di monociti e macrofago sono diminuiti significativamente. Infine, mostriamo che questi saggi consentono anche l'isolamento dei macrofagi vivi dai tappi di gel derivati dalla membrana sotterranea, che possono quindi essere sottoposti a conseguente caratterizzazione mediante l'analisi di macchie occidentali a singola cellula.

Per accedere alla reattività dei monociti del sangue ai chemoattraenti, abbiamo iniettato una soluzione cuordistica carica di veicoli e MCP-1 ha caricato una soluzione cuorduello sui fianchi sinistro e destro di ogni topo. I tappi di gel derivati dalla membrana del seminterrato sono stati rimossi 1, 3 e 5 giorni dopo le iniezioni, disciolti e le cellule reclutate in ogni spina sono state contate (Figura1A). Sottraendo il numero di celle nella spina caricata dal veicolo (barre aperte) dal numero di celle nella spina caricata MCP-1 (barre chiuse), abbiamo ottenuto il numero di celle specificamente reclutate in risposta a MCP-1 (numero di cella, Figura 1B). Abbiamo osservato un reclutamento accelerato MCP-1-specifico e accumulo di cellule nel periodo di 5 giorni, con tassi che aumentano da 31.000 cellule / giorno (giorno 1) a 78.000 cellule / giorno (giorno 3) e 136.000 cellule al giorno 5 (Figura 1B).
Per identificare i tipi di cellule che sono entrati nei tappi di gel derivati dalla membrana seminterrato, abbiamo sottoposto le cellule isolate da ogni spina all'analisi della macchia occidentale a singola cella (scWB), alla sonda per l'espressione CD45, CD11b e F4/80 per identificare i monociti (CD11b -), macrofagi (CD11b,F4/80, più CD11b-F4/80)e rimanenti leucociti non monocitici (CD45,CD11b-F4/80-) (Figura 2). I chip scWB sono stati poi sondati per la vinculina per determinare il numero totale di cellule su ogni gel e per confermare l'occupazione singola delle cellule dei micropozzi sul chip scWB. La percentuale di monociti all'interno dei tappi di gel derivati dalla membrana del seminterrato MCP-1 era bassa al giorno 1, 20%, ha raggiunto il picco al terzo giorno rispettivamente al 47%, prima di scendere al 14% al giorno 5 (Figura 2D). I numeri di macrofago all'interno dei tappi di gel derivati dalla membrana del seminterrato MCP-1 sono aumentati costantemente dal 13% al giorno 1, al 22% il giorno 3 e al 23% il giorno 5. Per le spine MCP-1 caricate, la percentuale di monociti più macrofagi all'interno della popolazione di cellule isolate era più alta al giorno 3, il 31% nei tappi caricati dal veicolo (Figura 3A) e il 58% nelle spine MCP-1 caricate (Figura 3B), indicando che dopo 3 giorni la stragrande maggioranza delle cellule reclutate dalla chemiotassi dipendente da MCP-1 sono monociti e macrofagi. Anche se il numero totale di monociti più macrofagi era più alto al giorno 5 rispetto al giorno 3 (Figura 3C e D), a causa della percentuale significativamente più elevata di monociti e macrofagi nella popolazione cellulare totale (Figura3A e B), il conteggio cellulare al giorno 3 riflette in modo più accurato il monocito del sangue chemiotassi e il reclutamento. Pertanto, iniettiamo regolarmente la soluzione derivata dalla membrana seminterrato tre giorni prima di sacrificare gli animali. Non è stato determinato se tutti i macrofagi reclutati da MCP-1 da MCP-1 siano monociti o mafigi residenti reclutati dai tessuti vicini.
L'analisi statistica dei dati qui mostrati è stata condotta con un software di analisi (ad esempio, SigmaPlot 14). ANOVA seguito dal test Fischer LSD è stato utilizzato per confrontare i valori medi tra gruppi sperimentali. Tutti i dati sono presentati come media: SD di almeno 3 esperimenti indipendenti. I risultati sono stati considerati statisticamente significativi a livello p < 0,05.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59706/59706fig1v2.jpg"> Figura 1 : Quantitazione delle cellule reclutate in tappi di gel derivati dalla membrana sotterranea sottocutanei. (A) Numeri di cellule assoluti per i veicoli caricati (barre aperte) e tappi di gel derivati dalla membrana del seminterrato MCP-1 (barre chiuse). (B) Il numero di celle reclutate in tappi di gel derivati dalla membrana sotterranea da MCP-1, calcolati come differenza nei numeri di cella tra i tappi caricati da MCP-1 e quelli caricati dal veicolo. I risultati sono mostrati come media : SD (n. 4) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59706/59706fig1v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59706/59706fig2.jpg"> Figura 2 : Analisi delle popolazioni cellulari reclutate in tappi di gel derivati dalla membrana sotterranea mediante analisi di macchie occidentali a singola cellula. ( A- B) Sono riportati esempi rappresentativi per l'analisi scWB di un veicolo caricato (Control) e di una spina MCP-1 con piombo (MCP-1) isolata da un mouse tre giorni dopo l'iniezione. Chip etichettati con anticorpi diretti contro CD45, CD11b e F4/80 seguiti da anticorpi secondari fluorescenti come descritto nel Protocollo. L'intensità di fluorescenza della banda etichettata per ogni singola cellula viene visualizzata come area di picco. (C-D) Le popolazioni cellulari sono state identificate come monociti (CD11b-F4/80- <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59706/59706img01.jpg"> </img>, ), macrofagi (CD11b,F4/80, più CD11b-F4/80, <img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/59706/59706img02.jpg" style="font-size: 14px;"> </img>) o come leucociti non monocitici (CD45) , <img alt="Image 3" src="/files/ftp_upload/59706/59706img03.jpg" style="font-size: 14px;">). Le celle rimanenti sono state<img alt="Image 4" src="/files/ftp_upload/59706/59706img04.jpg" style="font-size: 14px;">etichettate come "altre" ( ). I risultati sono indicati come media : SD (n e 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59706/59706fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59706/59706fig3.jpg"> Figura 3 : Contenuto monocito e macrofago di spine in gel derivate dalla membrana sotterranea. Analisi quantitativa del contenuto di monocyte e macrofago reclutato in spine caricate da veicoli e MCP-1 rimosse al giorno 1, 3 e 5 post-iniezione. I valori vengono visualizzati come percentuale della popolazione totale di celle (Ae B) e in numeri di cella assoluti per spina ( Ce D). I risultati sono indicati come media : SD (n e 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59706/59706fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages at JoVE.com

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Qui presentiamo un protocollo per quantificare l'attività chemiotattica dei monociti del sangue nei modelli murini, per valutare gli effetti degli interventi nutrizionali, farmacologici e genetici sul monocito del sangue e per caratterizzare i monociti del sangue derivati dai macrofagi in modelli murini che utilizzano tappi di gel derivati dalla membrana del basato monocite-chemoattractant-1 (MCP-1).

Quantificazione dell'attività chemiotatica monocite in vivo e caratterizzazione dei macrofagi derivati monociti del sangue

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

Questa metodologia ci consente di quantificare l'attività chemiotattica del monocita di sangue negli animali vivi e di studiare l'effetto di diete povere sulla funzione dei monociti e sui loro meccanismi sottostanti. I macrofagi derivati dai monociti possono essere isolati e analizzati utilizzando vari approcci, tra cui tecniche a singola cellula e omica che forniscono un'istantanea dello stato del sito di monociti nel sangue nei modelli di topo. La procedura di oggi sarà condotta dal dottor Young Joo Ahn, un professore assistente nel mio laboratorio, e dal dottor Luxi Wang, un postdoc nel mio laboratorio.Prima di iniziare la procedura, pulire il cappuccio di coltura cellulare con disinfettante e scongelare completamente la soluzione derivata dalla membrana basale ridotta dal fattore di crescita sul ghiaccio. Equipaggiare singole siringhe sterili da un millilitro con aghi calibro 26 e posizionare gli aghi sul ghiaccio. Una volta scongelata la soluzione, pulire la parte superiore della fiala di soluzione derivata dalla membrana del seminterrato con un tampone alcolico prima di caricare 500 micro litri di soluzione integrati con o senza attrattore di chemio in ogni siringa millilitro.Quindi rimuovere eventuali bolle d'aria dalla siringa caricata in soluzione derivata dalla membrana del seminterrato per garantire una formazione uniforme della spina. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piedino, iniettare lentamente un intero volume di soluzione derivata dalla membrana basale senza MCP-1 aggiunto a circa 100 micro litri al secondo per via sottocutanea nel fianco destro del mouse anestetizzato. E tutti i 500 micro litri di soluzione derivata dalla membrana basale integrati con MCP-1 nel fianco sinistro dell'animale.Tenere la siringa in posizione da 20 a 30 secondi dopo l'iniezione per evitare perdite della soluzione e consentire la forma di un'unica spina di gel liscia prima di posizionare il mouse su una pastiglia riscaldante con monitoraggio fino al pieno recupero. Tre giorni dopo l'iniezione, rimuovere i capelli dorsali da un animale iniettato a spina e utilizzare le forcep per afferrare la pelle intorno alla vertebra toracica inferiore e lombare superiore. Fai un'incisione lunga due millimetri nella pelle e taglia lungo la linea mediana della parte posteriore del topo dalle vertebre cervicali fino a un centimetro sopra la giunzione vertebrale della coccola.Separare la pelle dallo strato muscolare e fissare la pelle su una piattaforma di schiuma di polistirolo. Successivamente, al microscopio sezionato, afferrare attentamente la capsula fibrosa che contiene il tappo di gel derivato dalla membrana basale e utilizzare forcep fini per rimuovere la capsula fibrosa. Quindi utilizzare forbici fini per pulire la spina.Quindi trasferire il tappo di gel derivato dalla membrana del seminterrato pulito in un tubo di micro centrifuga da 1,5 millilitri opportunamente etichettato e pesato. Riascolta il tubo per calcolare il peso della spina di gel derivata dalla membrana del seminterrato. Per la digestione del tappo di gel derivato dalla membrana basale, utilizzare forbici fini pulite per tritare il tappo di gel derivato dalla membrana del seminterrato in ogni tubo di micro centrifuga e aggiungere 800 micro litri di sfollati alle spine.Vortice alla velocità massima per 10 secondi per interrompere le spine e posizionare i tubi di micro centrifuga a 37 gradi Celsius per due ore in un termo miscelatore a 1400 rotazioni al minuto per sciogliere completamente i tappi di gel derivati dalla membrana del seminterrato. Al termine dell'incubazione, sedimentare i frammenti del tappo per centrifugazione due volte e rimospendare i pellet in 300 microlitri di PBS. Trasferire 50 microlitri di ogni sospensione cellulare in nuovi tubi di microfuga ed etichettare le celle nei nuovi tubi con 0,5 microlitri di calcina.Dopo un'incubazione di 10 minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica, contare il numero di fluorescenti verdi vivi positive e cellule non fluorescenti morte su un contatore di celle automatizzato. Per un'analisi western blot a singola cella, aggiungere un millilitro di sospensione diluita a singola cella a un chip western blot a singola cella reidratato nella parte inferiore di una piastra di petri di 10 centimetri. Dopo cinque o 15 minuti, esaminare il chip sotto microscopia a campo brillante.Circa il 15-20% dei micro pozzi dovrebbe essere occupato da una singola cellula e meno del due per cento dei pozzi dovrebbe contenere due o più celle. Se il chip è stato caricato correttamente, inclinare il piatto di 45 gradi e lavare il chip tre volte con tampone di sospensione per rimuovere eventuali celle non capturate. Dopo l'ultimo lavaggio, accuratamente e caricare il chip nella cella di elettroforesi di uno strumento occidentale a singola cella, lato gel verso l'alto, e coprire l'intero chip western blot a singola cella con tampone di funzionamento di lysis.Avviare lalisi cellulare ed eseguire lo strumento secondo i parametri di esperimento appropriati. Alla fine della corsa, sciacquare il chip con due lavaggi di 10 minuti con tampone di lavaggio fresco per lavaggio a temperatura ambiente. Dopo il secondo lavaggio, aggiungere 80 microlitri della soluzione anticorpale primaria di interesse per la camera di sondaggio anticorpale e abbassare il lato gel del chip verso il basso in modo che la soluzione anticorpale assorba attraverso il chip.Dopo due ore a temperatura ambiente, lavare il truciolo tre volte nel tampone di lavaggio e una volta in acqua su uno shaker. Incubare il truciolo con un anticorpo secondario appropriato per un'ora a temperatura ambiente protetta dalla luce. Alla fine dell'incubazione, lavare il chip tre volte con il tampone di lavaggio e ruotare il chip su uno spinner di scorrimento per rimuovere l'eventuali tamponi di lavaggio rimanenti.Per rimuovere il chip western blot a cella singola, posizionare un rack di tubi da 15 millilitri in un bagno d'acqua di 60 gradi Celsius con l'acqua a solo un centimetro sopra il rack. In una cappa aspirante aggiungere 40 millilitri di tampone di stripping e 320 microlitri di etanolo beta morcepta a un contenitore. Posizionare il chip in una piastra di petri di 10 centimetri all'interno del contenitore e sigillare il contenitore con Parafilm.Quindi posizionare il contenitore all'interno del portatubi nel bagno d'acqua. Dopo 90 minuti, trasferire accuratamente il chip in una nuova piastra di Petri e lavare brevemente il chip una volta con tampone di lavaggio prima di aggiungere 15 millilitri di tampone di lavaggio fresco alla piastra di Petri per un lavaggio di 15 minuti sullo shaker. In questo esperimento rappresentativo, le cellule reclutate in ogni spina sono state conteggiate a uno, tre e cinque giorni dopo l'iniezione.Sottraendo il numero di celle nelle spine caricate dal veicolo dal numero di celle nelle spine caricate MCP-1, è stato quindi calcolato il numero di celle specificamente reclutate in risposta all'attrattore di chemio. Nel periodo di cinque giorni è stato osservato un reclutamento e un accumulo specifici di cellule MCP-1 accelerati, con tassi che aumentano da 31.000 cellule al giorno dopo un giorno di iniezione fino a 136.000 cellule al giorno, cinque giorni dopo l'iniezione. L'analisi western blot a singola cellula è stata quindi utilizzata per identificare i diversi tipi di cellule reclutate nei tappi derivati dalla membrana basale, in base alla loro espressione di specifici marcatori di cellule immunitarie di interesse.Ad esempio, la percentuale di monociti all'interno dei tappi di gel derivati dalla membrana basale caricati MCP-1 era bassa al primo giorno e ha raggiunto il picco al terzo giorno prima di scendere di nuovo al quinto giorno, mentre il numero di macrofagi è aumentato costantemente durante il periodo di studio. Per le spine caricate MCP-1, la percentuale di monociti più macrofagi all'interno della popolazione cellulare isolata era più alta al terzo giorno, indicando che dopo tre giorni, la stragrande maggioranza delle cellule reclutate dalla chemiotassi dipendente mcp-1 erano monociti e macrofagi. Anche se il numero totale di monociti più macrofagi è tipicamente più alto al quinto giorno rispetto al terzo giorno, il numero di cellule al terzo giorno riflette più accuratamente il sangue periferico di chemiotassi monocite e reclutamento, e quindi il terzo giorno è raccomandato per le analisi della spina diretta della membrana basale.Il successo dell'acquisizione di singole celle per l'analisi a valle dipende dall'accuratezza dell'iniezione e dalla rimozione completa delle spine. Citometria a flusso, blotting occidentale a singola cellula, sequenziamento dell'RNA alla rinfusa o a singola cella e altre procedure omiche possono essere utilizzate per valutare le caratteristiche e i fenotipi dei macrofagi reclutati monociti e derivati dai monociti.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

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Attivazione e misurazione dei NLRP3 inflammasome all&#39;attività utilizzando IL-1β in cellule dendritiche umane derivate da monociti

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

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