Name: quantification of monocyte chemotactic activity in vivo and characterization of blood monocyte derived macrophages
Uploaded: 2019-08-12T13:30:00
Duration: 9 min 57 s
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Este projeto foi apoiado por subsídios para a HNI (AT006885).

Todos os métodos descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais na escola de medicina Wake Forest.
1. preparação do fator de crescimento MCP-1-Loaded-solução derivada de membrana basal reduzida
Nota: É um procedimento estéril.
<ol><li>Limpe a capa da cultura de pilha com desinfetante antes de preparar a solução derivada da membrana do porão (por exemplo, Matrigel).</li>
	<li>Prepare a seringa estéril individualmente embalada de 1 mL e limpe a parte superior do tubo de ensaio derivado da solução da membrana do porão com um cotonete do álcool antes de carregá-lo na seringa.</li>
	<li>Descongelar completamente o fator de crescimento-redução da solução de membrana basal derivada no gelo. Atenção: Se a matriz da membrana do porão for descongelada à temperatura ambiente (RT), assegure-se de que uma pequena partícula de gelo permaneça para evitar que a solução se Gelling.</li>
	<li>Uma vez descongelado, abra o frasco e misture MCP-1 ou 1xPBS com 0,1% BSA na capa de cultura celular.</li>
	<li>Prepare um 1 mL da seringa estéril com uma agulha de 26 G e fixe no gelo.</li>
	<li>Prepare uma solução de estoque de MCP-1 dissolvendo MCP-1 para uma concentração final de 50 μg/mL em 1X PBS com 0,1% de BSA.</li>
	<li>Diluir MCP-1 em 5 mL de solução de membrana do porão frio-derivado a uma concentração final de 500 ng/mL. Prepare uma quantidade igual da solução membrana-derivada do porão com veículo somente (1X PBS contenha 0,1% BSA).</li>
	<li>Carregar 500 μL de solução de membrana basal derivada (com ou sem MCP-1) na seringa fria de 1 mL.</li>
	<li>Remova todas as bolhas de ar da seringa de solução carregada de membrana basal antes de fazer a injeção para garantir uma formação de plugue uniforme.</li>
</ol>2. injeção de membrana basal-solução derivada
<ol><li>Pulverize 70% etanol em torno da área de procedimento antes e durante as injeções para desinfectar o ambiente.</li>
	<li>Para induzir a anestesia, coloque o mouse em uma câmara de anestesia e ajuste o medidor de vazão O2 para 1 litro/min e ajuste o vaporizador para isoflurano a 2%.</li>
	<li>Monitore a profundidade da anestesia monitorando a frequência respiratória (taxa/min), reflexo corneano e movimento de bigodes.</li>
	<li>Durante todo o procedimento, manter a anestesia usando um cone de nariz.</li>
	<li>Durante o procedimento, manter o monitoramento da frequência respiratória (taxa/min), reflexo corneano e movimento de bigodes para verificar a profundidade da anestesia.</li>
	<li>Depois de confirmar a falta de resposta à pinça do dedo do pé, injete lentamente (aproximadamente 100 μl/s) a solução derivada da membrana do porão por via subcutânea no flanco direito (no MCP-1) e esquerdo (com MCP-1) do rato, respectivamente. Se a injecção for demasiado lenta, as fichas de gel derivadas da membrana basal podem tornar-se irregularmente moldadas, ou mesmo fragmentadas, e difíceis de remover.</li>
	<li>Segure a seringa por 20-30 s após a injeção para evitar o vazamento da solução e para permitir que um único gel-plug liso para formar.</li>
	<li>Após a injeção, colocando o mouse sobre a almofada de aquecimento com monitoramento até a recuperação.</li>
	<li>Retorne o mouse para a gaiola original uma vez que o mouse está totalmente recuperado.</li>
</ol>3. colher o porão membrana-derivado gel plugs
<ol><li>Pesar dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mL separados para cada rato e rotulá-los.</li>
	<li>Três dias após a injeção da solução membrana-derivada do porão, eutanizar o rato na câmara anestésica usando o isoflurano de 3% seguido pela deslocação cervical.</li>
	<li>Retire a pele dorsal do rato usando cortadores de cabelo ou aplique o creme do removedor do cabelo com as varas Cotton-derrubadas por 5 minutos e limpe-a então fora.</li>
	<li>Segure a pele do mouse usando fórceps em torno da vértebra lombar torácica inferior e superior e fazer uma incisão de 2 mm de comprimento na pele.</li>
	<li>Corte a linha média da parte traseira do rato de uma incisão feita até vértebras cervicais e para baixo a 1 cm acima da junção caudal da vértebra (junção da cauda) usando a tesoura cirúrgica.</li>
	<li>Separe a pele da camada muscular e pin-down da pele em uma plataforma de espuma de poliestireno.</li>
	<li>Segure cuidadosamente a cápsula fibrosa que contém o plugue de gel derivado da membrana basal usando fórceps fino e retire a cápsula fibrosa usando tesouras finas para limpar o plugue.</li>
	<li>Retire a ficha de gel derivada da membrana basal limpa e transfira para 1,5 mL de microcentrífuga (ver 3,1).</li>
	<li>Pesar o tubo de microcentrífuga com o porão limpo membrana-derivado gel plug e calcular o peso do porão membrana-derivado gel plug.</li>
</ol>4. digerir o porão membrana-derivado gel plugs
<ol><li>Thaw Dispase (10 mL) no gelo.</li>
	<li>Mince a membrana do porão-derivado gel plug no tubo de microcentrífuga usando limpa tesoura fina.</li>
	<li>Adicione 800 μL de Dispase em cada tubo do microcentrifugador que contem a plugue membrana-derivada do gel do porão.</li>
	<li>Vortex com velocidade máxima de 10 s para interromper o plugue.</li>
	<li>Incubar os tubos do microcentrifugador para 2 h em 37 ° c em 1.400 rpm em um no para dissolver completamente o plugue membrana-derivado do gel do porão.</li>
	<li>Após 2 h, centrifugue a 400 x g durante 10 min em RT. Retire e elimine cuidadosamente o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuscitar o pellet em 1 mL de 1X PBS invertendo ou tocando.</li>
	<li>Repita a centrifugação em 200 x g por 10 min em RT. Retire e elimine cuidadosamente o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuscitem o pellet em 300 μL de PBS.</li>
	<li>Tome 50 μL de suspensão celular em um tubo de microcentrífuga separado.</li>
	<li>Adicionar 0,5 μL de calceina AM (1 M) à suspensão celular. Nota: Calcein AM é um corante verde da viabilidade da pilha fluorescente que se acumula somente em pilhas vivas.</li>
	<li>Incubar as células em uma incubadora de CO2 a 37 ° c por 10 min.</li>
	<li>Contagem de células fluorescentes verdes (ao vivo) e não-fluorescentes (mortas) usando um contador de células automatizado.</li>
</ol>5. determinando a composição da pilha na suspensão da pilha usando a análise ocidental do borrão da único-pilha (scWB)
<ol><li>Rehidrate o chip scWB antes de usar em 15 mL de tampão de suspensão 1x em uma placa de Petri por pelo menos 10 min em RT.</li>
	<li>Adicione 1 mL da suspensão de célula única diluída (10000-100000 células/mL) ao chip rehidratado. Ajuste a superfície na parte inferior de um prato de Petri de 10 cm. Assegure-se de que a superfície esteja ajustada horizontalmente.</li>
	<li>Cubra o prato de Petri com uma tampa para evitar a secagem e deixe as células se contentarem por 5-15 min por gradiente.</li>
	<li>Coloc a microplaqueta um microscópio do brilhante-campo e inspecione os poços na ampliação 10x. Nota: Aproximadamente 15-20% dos micropoços devem ser ocupados por uma única célula, menos de 2% dos poços devem conter 2 ou mais células</li>
	<li>Incline o prato de Petri de 10 cm contendo o chip em 45 graus.</li>
	<li>Lave o chip com o tampão de suspensão 1x para remover células não capturadas da superfície do chip por pipetagem suave de cima para baixo do chip. Repita 3 vezes.</li>
	<li>Prepare o instrumento ocidental da única pilha.</li>
	<li>Ajuste o tempo da lise, o tempo da electroforese, e o tempo UV da captação. Para analisar os macrófagos recrutados recuperados do plugue de gel derivado da membrana basal, use as seguintes configurações: tempo de Lise: 0 s; tempo da electroforese: 160 s; Tempo de captura UV 240 s.</li>
	<li>Carregue com cuidado a microplaqueta na pilha da electroforese do instrumento ocidental da única pilha, revestimento do gel-lado. Tenha cuidado para não danificar o lado do gel do chip.</li>
	<li>Despeje a Lise/buffer de execução na câmara e cobrir completamente toda a célula única chip ocidental. Comece a lise celular.</li>
	<li>Execute o instrumento scWB usando a configuração listada em 5,8.</li>
	<li>Uma vez que a corrida estiver concluída, transfira o chip para um prato de Petri de 10 cm e lave o chip duas vezes com 1x tampão de lavagem por 10 min em RT.</li>
	<li>Prepare diluições de anticorpos primários (anti-vinculin: 1:10; anti-CD45:1:15, anti-CD11b: 1:20, anti-F4/80:1:10) num volume total de 80 μL de diluente de anticorpos (misturar 8 μL de anticorpo 1 mais 8 μL de anticorpo 2 mais 64 μL de diluente).</li>
	<li>Adicione 80 μL da solução preliminar do anticorpo à câmara de sondagem do anticorpo e abaixe o gel-lado da microplaqueta para baixo de modo que a solução do anticorpo Wicks através da microplaqueta.</li>
	<li>Incubar com a solução de anticorpo primário para 2 h em RT.</li>
	<li>Lave o chip três vezes por 10 min em 1x tampão de lavagem na coqueteleira.</li>
	<li>Lave o chip uma vez por 10 min na água na coqueteleira para desalt o gel.</li>
	<li>Prepare uma diluição 1:20 do anticorpo secundário num volume total de 80 μL (misturar 2 μL de anticorpo secundário mais 78 μL de diluente).</li>
	<li>Incubar a microplaqueta com o anticorpo secundário para 1 h no RT protegido da luz.</li>
	<li>Lave o chip três vezes por 10 min com 1x tampão de lavagem na coqueteleira.</li>
	<li>Gire o chip usando um Spinner deslizante para remover qualquer buffer de lavagem restante.</li>
	<li>Escaneie a microplaqueta em um varredor do microarray do duplo-laser na definição de 5 μm no canal espectral do fluoróforo acoplado aos anticorpos secundários.</li>
	<li>Analise dados usando o software scWB-specific.</li>
</ol>6. descascando o chip scWB
<ol><li>Armazene o chip digitalizado no tampão de lavagem até que esteja pronto para descascar.</li>
	<li>Coloc o banho de água em uma capa das emanações.</li>
	<li>Coloque um rack de tubo de 50 mL no banho de água com a água a apenas 1 cm acima do rack e defina a temperatura da água em 60 ° c.</li>
	<li>Prepare o tampão de decapagem. Para 1 L de solução tampão de decapagem, dissolver 9,85 g de Tris-HCl (pH 6,8) e 20 g de SDS em 900 mL de água destilada e ajustar o pH. Em seguida, encha com água destilada para 1L. Adicionar 0,8% (v/v) de β-mercaptoetanol (β-ME; 14,3 M) imediatamente antes de cada utilização.</li>
	<li>Após a digitalização inicial, coloque o chip em um prato de Petri de 10 cm antes de descascar.</li>
	<li>Para cada chip, tome 40 mL de tampão de decapagem e adicione 320 μL de β-ME. Atenção: β-me é tóxico e perigoso para o ser humano e ambiente. O procedimento a seguir deve ser feito em uma capa de fumaça.</li>
	<li>Coloque o chip na caixa e sele a vasilha com parafilm para evitar que a água vaze na vasilha.</li>
	<li>Coloque a vasilha dentro da cremalheira do tubo no banho de água pré-aquecido.</li>
	<li>Incubar por 90 min.</li>
	<li>Retire cuidadosamente o chip da caixa e coloque-o num prato de Petri fresco.</li>
	<li>Lave brevemente o chip uma vez com 1x tampão de lavagem. Em seguida, adicione 15 mL de 1x tampão de lavagem para o prato de Petri.</li>
	<li>Lave o chip por 15 min em uma coqueteleira. Repita o passo de lavagem quatro vezes. Nota: Chip está pronto para o próximo anticorpo primário (ver passos 5,12-5,21).</li>
</ol>

<ol>
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Desenvolvemos um ensaio de quimiotaxia in vivo, fazendo uso das propriedades físicas únicas da matriz derivada da membrana basal e da capacidade de carregar esta matriz única com quimiocinas e injetá-la em camundongos. O ensaio permite avaliar em camundongos vivos a responsividade dos monócitos (e macrófagos) às quimiocinas, como ilustrado aqui para o MCP-1, e os efeitos da manipulação genética ou da exposição farmacológica, dietética e outras exposições ambientais sobre monócitos Chemotaxis. Como o gradiente de quimiocina que criamos nesses camundongos é essencialmente afetado pela exposição genética, farmacológica, dietética ou ambiental, as alterações na atividade quimiotática de monócitos refletem, na verdade, mudanças funcionais nesses monócitos e, como mostramos anteriormente, também a reprogramação tanto na proteína quanto no nível transcricional17,20. Nós relatado que o stress metabólico nos ratos aumenta a compreensibilidade do monocyte ao chemoattractant e que esta atividade Hyper-chemotactic se correlaciona com a proteína S-glutathionylation aumentada, um redox-dependente pós-translational reversível a modificação protéica, que na maioria dos casos leva à perda da função enzimática e protéica21,22, e em algumas situações até promove a degradação protéica16,17.
Para executar com sucesso este procedimento e para obter resultados óptimos com este ensaio é crítico que os volumes exatos de solução membrana-derivada do porão estão injetados lentamente para criar um plugue bem formado singular e as cápsulas fibrosas devem ser removidas completamente para começ plugues limpos quando os plugues de gel membrana-derivados do porão da colheita, facilitam a dissolução do plugue inteiro na solução do Dispase. Nossos dados mostram que deixar a ficha nos animais por três dias otimiza 1) a intensidade do sinal, ou seja, o número de monócitos e macrófagos recrutados em cada plugue, 2) a seletividade do sinal, ou seja, o conteúdo de monócitos e macrófagos dentro do populações de células totais e 3) a especificidade do sinal, ou seja, o aumento de monócitos e macrófagos em resposta ao MCP-1 em comparação com o veículo. Finalmente, Nós demonstramos como as únicas abordagens baseadas em células de última geração em conjunto com o ensaio de plugue de gel derivado da membrana basal podem ser usadas para caracterizar os monócitos recrutados nos plugues e, assim, obter um instantâneo do fenótipo potencial de os macrófagos derivados de monócitos sendo recrutados para sítios de lesão em qualquer modelo de camundongo em resposta a intervenções genéticas, farmacológicas, dietéticas ou ambientais específicas.
Há uma série de limitações do ensaio a ser considerado. Primeiramente, a manipulação do rato, incluindo a anestesia, a injeção da solução membrana-derivada do porão, e a dissecção cirúrgica exigem a prática gerar únicos plugues e dados reprodutíveis. Em segundo lugar, enquanto a maioria das células recrutadas para o MCP-1 carregado plugues são monócitos e macrófagos, um número substancial não são. Isso pode afetar a interpretação de outros ensaios analíticos baseados em células não-únicas realizados nesta população celular. Finalmente, desde que as condições da lise da pilha para scWB são suaves, as distâncias da migração das proteínas podem diferir do WB padrão e não podem correlacionar com tamanho da proteína. Conseqüentemente, o lysis da pilha e os tempos de funcionamento têm que ser validados para que cada proteína nova seja testada e cada anticorpo preliminar usado.

O recrutamento de macrófagos derivados de monócitos é essencial para o desenvolvimento de doenças inflamatórias crônicas associadas a distúrbios metabólicos, incluindo a aterosclerose e a obesidade1,2,3, a 4. O número de macrófagos derivados de monócitos em sítios de lesão tecidual, bem como sua plasticidade, são críticos para a homeostase tecidual e reparo. Tanto o recrutamento e excesso de macrófagos derivados de monócitos pode prejudicar a cicatrização de feridas5. Desencadeando a inflamação tecidual local, por exemplo, pela acumulação e oxidação da lipoproteína de baixa densidade (LDL) na parede aórtica ou ativação inflamatória de adipócitos por ácidos graxos ou lipopolissacarídeos bacterianos vazando através do intestino barreira, conduz à liberação de mediadores inflamatórios, incluindo quimiocinas tais como a proteína-1 do chemoattractant do monocyte (MCP-1/CCL2). O MCP-1 é um membro da família c-c quimiocina e um quimioatractivo chave responsável pelo recrutamento de macrófagos derivados de monócitos para sítios de inflamação e lesão tecidual6,7,8, 9,10. A ativação inflamatória do endotélio vascular resulta na expressão de moléculas de aderências como molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1) e molécula de adesão de células vasculares 1 (VCAM-1)11,12, permitindo monócitos circulantes ativados pelo MCP-1 para rolar ao longo, aderir firmemente e posteriormente transmigrar para o espaço subendotelial12. Os monócitos infiltrantes se diferenciam em macrófagos, que podem ser ativados em um fenótipo pró-inflamatório, conduzindo o processo inflamatório agudo. Impulsionada pelo microambiente, os macrófagos pró-inflamatórios podem se converter em macrófagos que resolvam a inflamação, que desempenham papéis críticos no esclarecimento de células inflamatórias, removendo sinais pró-inflamatórios e completando o reparo tecidual e a ferida cura12,13.
O stress metabólico crônico primos monócitos para a resposta dramàtica aumentada aos Chemo-attractants e o recrutamento aumentado do monocyte, e nós mostramos que os monócitos aprontados dão a ascensão aos macrófagos com programas e polarização dysregulamentada da ativação Estados14,15,16. A escorva do monocyte promove a aterosclerose, a obesidade, e possivelmente outras doenças inflamatórios crônicas associadas com as desordens metabólicas tais como o Steatohepatitis, as doenças renais e possivelmente o cancro. Para avaliar e quantificar a escorva de monócitos em modelos de camundongo de doenças humanas, desenvolvemos uma nova técnica para avaliar o estado de escorva de monócitos sanguíneos medindo a atividade quimiotática in vivo14,15,16, a 17. Nossa aproximação envolve a injeção do gel membrana-derivado do porão carregado com o um chemoattractant-nós usamos geralmente o MCP-1-ou o veículo no flanco esquerdo e direito, respectivamente, dos ratos. Quando cuidadosamente injetado por via subcutânea, o gel derivado da membrana basal irá formar um único plugue, a partir do qual as quimiocinas podem difundir e criar um gradiente quimiotático definido que não é afetado pelo Estado metabólico ou inflamatório do entorno tecido ou o rato destinatário.
O gel derivado da membrana basal que utilizamos para o nosso ensaio é uma preparação de membrana basal solubilizada extraída do sarcoma de rato Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), um tumor rico em proteínas de matriz extracelular (ECM). Esta mistura complexa de proteínas contém laminina (60%), colágeno IV (30%), a molécula de ponte entactina (8%), e uma série de fatores de crescimento. O ensaio do plugue da matriz da membrana do porão foi desenvolvido originalmente para investigar a angiogênese em resposta a vários fatores de crescimento18,19. Entretanto, a fim estudar o chemotaxis do monocyte, é importante usar o gel membrana-derivado do porão do fator de crescimento-esgotado para minimizar o recrutamento e a angiogênese endothelial da pilha. O que torna o Matrigel (referido como gel derivado da membrana do porão doravante) único e particularmente útil é que a temperaturas inferiores a 10 ° c liquefaz, permitindo que as quimiocinas sejam dissolvidas. Em temperaturas acima de 22 ° c, a solução derivada da membrana basal passa rapidamente por uma transição de fase e forma rapidamente um hidrogel. As fichas podem ser excisadas cirurgicamente, limpas e dissolvidas com um metaloprotease neutro derivado de bacilo para produzir suspensões de células únicas, que podem ser analisadas em um classificador de células ativados por fluorescência (FACS), por RNAseq, RNA de célula única e uma variedade de outros técnicas de Ômicas. Aqui nós descrevemos o uso da análise ocidental do borrão da único-pilha para a caracterização das populações da pilha recrutadas nos plugues membrana-derivados do gel do porão um, três ou cinco dias após a injeção.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:628px;" width="628">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">10 cm petri dish</td>
			<td style="width:103px;">griner bio-one</td>
			<td style="width:123px;">664 160</td>
			<td style="width:184px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">10x suspension buffer</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">R101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">15 cm petri dish</td>
			<td style="width:103px;">Falcon</td>
			<td style="width:123px;">353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:103px;">MP BIOMEDICALS</td>
			<td style="width:123px;">2194705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">5% washing buffer</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">R252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Antibody diluent</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">042-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Bench Top Centrifuge</td>
			<td style="width:103px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Microfuge 22R Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Bovine Serim Albumin</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Calcein AM</td>
			<td style="width:103px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">C3099</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">CD11b</td>
			<td style="width:103px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:123px;">NB110-89474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">CD45 (D4H7K) rabbit mAb</td>
			<td style="width:103px;">Cell Signal Technologies</td>
			<td style="width:123px;">727987S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">CD68/SR-D1 (FA-11)</td>
			<td style="width:103px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:123px;">NBP2-33337SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Cellometer Vision</td>
			<td style="width:103px;">Nexcelom</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Dispase</td>
			<td style="width:103px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">354235</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Dissecting sissor</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Donkey anti-Rabbit IgG secondary antibody [NL557]</td>
			<td style="width:103px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:123px;">NL004</td>
			<td>NL 557 conjugate</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:219px;">Donkey anti-Rat IgG (H+L) secondary antibody [DyLight 650]</td>
			<td style="width:103px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:123px;">NBP1-75655</td>
			<td>DyLight 650 conjugate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">F4/80 (CI-A3-1)</td>
			<td style="width:103px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:123px;">NB600-404SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Heat Block</td>
			<td style="width:103px;">effendorf</td>
			<td style="width:123px;">22331</td>
			<td>Thermomixer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Lysis/Running buffer</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">R200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Matrigel Matrix (Grwoth Factor Reduced)</td>
			<td style="width:103px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">354230</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Microarray scanner</td>
			<td style="width:103px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:123px;">ScanArray Gx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Microscope</td>
			<td style="width:103px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">Evos fl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Milo</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Single cell western</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Needle</td>
			<td style="width:103px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">305111</td>
			<td>26G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Parafilm</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Probing chamber</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">035-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Recombinant mouse CCL2/JE/MCP-1 protein</td>
			<td style="width:103px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:123px;">479-JE-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">scWEST chip</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">C300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Shaker</td>
			<td style="width:103px;">Bioexpress</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Gene mate orbital shaker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Single cell western chip canister</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">035-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Slide spinner</td>
			<td style="width:103px;">Labnet</td>
			<td style="width:123px;">C1303-T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP 166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Syringe</td>
			<td style="width:103px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">309602</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Tris-Hydrochloride</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP 153-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Tweezer</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">035-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Water bath</td>
			<td style="width:103px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of monocyte chemotactic activity in vivo and characterization of blood monocyte derived macrophages

A homeostase tecidual e a reparação são criticamente dependentes do recrutamento de macrófagos derivados de monócitos. O recrutamento de macrófagos derivados de monócitos pode prejudicar a cicatrização de feridas. Nós mostramos que as dietas elevadas gordas e elevadas do açúcar promovem o priming e a deficiência orgânica do monocyte, convertendo monócitos saudáveis do sangue em um phenotype Quimiotáticos Hyper preparado para diferenciar-se nos macrófagos com perfis disregulados da ativação e o fenotípico prejudicado Plasticidade. Acredita-se que o excesso de recrutamento de macrófagos derivados de monócitos e o recrutamento de macrófagos com perfis de ativação disregulados sejam um dos principais contribuintes para o desenvolvimento de doenças inflamatórias crônicas associadas a distúrbios metabólicos, incluindo aterosclerose e obesidade. O objetivo deste protocolo é quantificar a atividade quimiotática de monócitos sanguíneos como um biomarcador para a escorva e disfunção de monócitos e para caracterizar os monócitos de sangue do fenótipo de macrófago estão prestes a se diferenciar nesses modelos de camundongo. Usando a análise ocidental do borrão da única pilha, nós mostramos que após 24 h 33% das pilhas recrutadas em plugues de gel membrana-derivados do porão MCP-1-Loaded injetados em ratos são monócitos e macrófagos; 58% após o dia 3. No entanto, no 5º dia, os números de monócitos e macrófago foram significativamente reduzidos. Finalmente, nós mostramos que estes ensaios igualmente permitem a isolação de macrófagos vivos dos plugues membrana-derivados cirurgicamente recuperados do gel do porão, que podem então ser sujeitados à caracterização subseqüente pela única análise ocidental do borrão da pilha.

Para acessar a responsividade dos monócitos sanguíneos aos quimioatrativos, injetamos uma solução de membrana-derivada do porão carregada de veículo e MCP-1 nos flancos esquerdos e direito de cada mouse. Os plugues de gel derivados da membrana basal foram removidos 1, 3 e 5 dias após as injeções, dissolvidos e as células recrutadas em cada plugue foram contabilizadas (Figura 1a). Ao subtrair a contagem de células no plugue carregado pelo veículo (barras abertas) da contagem de células no plugue carregado MCP-1 (barras fechadas), obteve-se o número de células especificamente recrutadas em resposta ao MCP-1 (Δ Cell Number, Figura 1b). Observamos um recrutamento e acúmulo acelerado de células MCP-1-específicos ao longo do período de 5 dias, com taxas crescentes de 31.000 células/dia (dia 1) a 78.000 células/dia (dia 3) e 136.000 células/dia no dia 5 (Figura 1b).
Para identificar os tipos de células que entraram nas fichas de gel derivadas da membrana basal, sujeitamos as células isoladas de cada ficha a uma única célula de análise Western blot (scWB), sondagem para a expressão CD45, CD11b e F4/80 para identificar monócitos (CD11b+F4/80 -), macrófagos (CD11b+F4/80+ Plus CD11b-F4/80+) e remanescentes de leucócitos não monocíticos (CD45+CD11b-F4/80-) (Figura 2). Os chips scWB foram então sondar para vinculação para determinar o número total de células em cada gel e para confirmar a ocupação única célula dos micropoços no chip scWB. A porcentagem de monócitos dentro dos plugues de gel derivados da membrana basal do porão MCP-1 foi baixa no dia 1, 20%, atingiu o pico no dia 3 em 47%, respectivamente, antes de cair para 14% no dia 5 (Figura 2D). Os números de macrófago dentro dos plugues de gel derivados da membrana do porão MCP-1-carregados aumentaram firmemente de 13% no dia 1, a 22% no dia 3 e 23% no dia 5. Para os plugues MCP-1-carregados, a porcentagem de monócitos mais macrófagos dentro da população de células isoladas foi maior no dia 3, 31% em fichas carregadas de veículos (Figura 3a) e 58% em fichas de MCP-1-Loaded (Figura 3B), indicando que após 3 dias a grande maioria das células recrutadas por quimiotaxia dependente de MCP-1 são monócitos e macrófagos. Embora o número total de monócitos mais macrófagos tenha sido maior no 5º dia em relação ao 3º dia (Figura 3C e D), devido à proporção significativamente maior de monócitos e macrófagos na população celular total (Figura 3a e B), a contagem de células no dia 3 reflete mais precisamente a quimiotaxia e o recrutamento de monócitos sanguíneos. Nós, conseqüentemente, injetamos rotineiramente a solução membrana-derivada do porão três dias antes de sacrificar os animais. Se todos os macrófagos recrutados pelo MCP-1 são macrófagos derivados de monócitos ou residentes recrutados de tecidos vizinhos contribuídos não foram determinados.
A análise estatística dos dados aqui apresentados foi realizada com o software de análise (por exemplo, SigmaPlot 14). A ANOVA seguida pelo teste de Fischer LSD foi utilizada para comparar os valores médios entre os grupos experimentais. Todos os dados são apresentados como média ± DP de pelo menos 3 experimentos independentes. Os resultados foram considerados estatisticamente significantes no nível de P < 0, 5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59706/59706fig1v2.jpg"> Figura 1 : Quantitation das pilhas recrutadas em plugues membrana-derivados subcutaneous do gel do porão. (A) números de células absolutas para fichas de gel derivadas de membrana do porão (barras fechadas) carregadas por veículos (barras abertas) e MCP-1. (B) o número de células recrutadas em fichas de gel derivadas de membrana basal por MCP-1 calculada como a diferença nos números de células entre as fichas MCP-1-Loaded e veículo-carregadas. Os resultados são mostrados como média ± DP (n = 4) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59706/59706fig1v2large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59706/59706fig2.jpg"> Figura 2 : A análise de populações da pilha recrutou em plugues membrana-derivados do gel do porão pela única análise ocidental do borrão da pilha. (A + B) Os exemplos representativos são mostrados para a análise de scWB de um veículo-carregado (controle) e de um plugue MCP-1-leaded (MCP-1) isolado de um rato três dias após a injeção. Chips rotulados com anticorpos direcionados contra CD45, CD11b e F4/80 seguidos de anticorpos secundários fluorescentes, conforme descrito no protocolo. A intensidade de fluorescência da banda rotulada para cada célula individual é mostrada como área de pico. (C + D) As populações de células foram identificadas como monócitos (CD11b+F4/80 <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59706/59706img01.jpg"> </img>-,), macrófagos (CD11b+F4/80+ Plus CD11b-F4/80 <img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/59706/59706img02.jpg" style="font-size: 14px;"> </img>+,) ou como leucócitos não monocíticos (CD45+ , <img alt="Image 3" src="/files/ftp_upload/59706/59706img03.jpg" style="font-size: 14px;">). As células restantes foram rotuladas como "Other<img alt="Image 4" src="/files/ftp_upload/59706/59706img04.jpg" style="font-size: 14px;">" (). Os resultados são mostrados como média ± DP (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59706/59706fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59706/59706fig3.jpg"> Figura 3 : Teor de monócitos e macrófago de tampões de gel derivados da membrana basal. Análise quantitativa do conteúdo de monócitos e macrófago recrutados em fichas carregadas de veículos e MCP-1, removidas no dia 1, 3 e 5 pós-injeção. Os valores são mostrados como porcentagem da população total de células (a + B) e em números de células absolutas por plugue (C + D). Os resultados são mostrados como média ± DP (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59706/59706fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Aqui nós apresentamos um protocolo para quantificar a atividade Quimiotáticos de monócitos do sangue em modelos do rato, para avaliar os efeitos de intervenções nutritivas, farmacológicas e genéticas no monocyte do sangue e para caracterizar os macrófagos derivados do sangue dos monócitos em modelos de mouse usando o monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-carregado porão membrana-derivado gel plugs.

Quantificação da atividade quimiotática de monócitos in vivo e caracterização de macrófagos derivados de monócitos sanguíneos

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

Essa metodologia nos permite quantificar a atividade quimotactic do monócito sanguíneo em animais vivos e estudar o efeito de más dietas sobre a função monócito e seus mecanismos subjacentes. Macrófagos derivados de monócitos podem ser isolados e analisados usando várias abordagens, incluindo técnicas de célula única e omics que fornecem um instantâneo da saúde do local do monócito sanguíneo em modelos de camundongos. O procedimento de hoje será conduzido pelo Dr. Young Joo Ahn, professor assistente do meu laboratório, e pelo Dr. Luxi Wang, um pós-doutor no meu laboratório.Antes de iniciar o procedimento, limpe a capa da cultura celular com desinfetante e descongele completamente a solução derivada da membrana do porão reduzida no gelo. Equipar seringas estéreis individuais de um mililitro com agulhas de calibre 26 e coloque as agulhas no gelo. Uma vez descongelado a solução, limpe a parte superior do frasco de solução derivada da membrana do porão com um cotonete de álcool antes de carregar 500 micro litros de solução complementada com ou sem quimio attractante em cada seringa mililitro.Em seguida, remova quaisquer bolhas de ar da solução derivada da membrana do porão de seringa carregada para garantir uma formação uniforme de plugue. Depois de confirmar a falta de resposta ao aperto do dedo do pé, injete lentamente um volume inteiro de solução derivada da membrana do porão sem o MCP-1 adicionado a aproximadamente 100 micro litros por segundo subcutâneamente no flanco direito do mouse anestesiado. E todos os 500 micro litros de solução derivada da membrana do porão complementadas com MCP-1 no flanco esquerdo do animal.Mantenha a seringa no lugar de 20 a 30 segundos após a injeção para evitar o vazamento da solução e para permitir que um único plugue de gel liso se forme antes de colocar o mouse em uma almofada de aquecimento com monitoramento até a recuperação completa. Três dias após a injeção, remova os cabelos dorsais de um animal injetado por plugue e use fórceps para agarrar a pele ao redor da vértebra torácica inferior e lombar superior. Faça uma incisão de dois milímetros de comprimento na pele e corte ao longo da linha média da parte de trás do rato a partir das vértebras cervicais até um centímetro acima da junção vertebral do coddle.Separe a pele da camada muscular e fixe a pele em uma plataforma de espuma de poliestireno. Em seguida, sob um microscópio dissecando, segure cuidadosamente a cápsula fibrosa que contém o plugue de gel derivado da membrana do porão e use fórceps finos para remover a cápsula fibrosa. Em seguida, use uma tesoura fina para limpar o plugue.Em seguida, transfira o plug de gel derivado da membrana do porão limpo em um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro. Reweigh o tubo para calcular o peso do plugue de gel derivado da membrana do porão. Para a digestão do plugue de gel derivado da membrana do porão, use uma tesoura fina limpa para picar o plug de gel derivado da membrana do porão em cada tubo de micro centrífuga e adicionar 800 micro litros de deslocamento aos plugues.Vórtice na velocidade máxima por 10 segundos para interromper os plugues e colocar os tubos de micro centrífugas a 37 graus Celsius por duas horas em um mixer termo a 1400 rotações por minuto para dissolver completamente os plugues de gel derivados da membrana do porão. No final da incubação, sedimente os fragmentos do plugue por centrifugação duas vezes e resuspenja as pelotas em 300 microliters de PBS. Transfira 50 microliters de cada suspensão celular para novos tubos de micro centrífugas e rotule as células nos novos tubos com 0,5 microliters de calcina.Após uma incubação de 10 minutos a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono, conte o número de fluorescentes verdes vivos positivos e não-fluorescentes mortos em um contador celular automatizado. Para uma única análise de manchas ocidentais, adicione um mililitro de suspensão celular única diluída a um chip de mancha ocidental de célula única rehidratado no fundo de uma placa de petri de 10 centímetros. Depois de cinco a 15 minutos, examine o chip sob microscopia de campo brilhante.Aproximadamente 15 a 20% dos micro poços devem ser ocupados por uma única célula e menos de dois por cento dos poços devem conter duas ou mais células. Se o chip estiver devidamente carregado, incline o prato 45 graus e lave o chip três vezes com tampão de suspensão para remover quaisquer células não tampadas. Após a última lavagem, cuidadosamente e carregue o chip na célula de eletroforese de um único instrumento ocidental celular, gel-side para cima, e cubra todo o chip de mancha ocidental de célula única com tampão de lise em execução.Inicie a lise celular e execute o instrumento de acordo com os parâmetros de experimento apropriados. No final da corrida, enxágue o chip com duas lavagens de 10 minutos com tampão de lavagem fresco por lavagem à temperatura ambiente. Após a segunda lavagem, adicione 80 microliters da solução primária de anticorpos de interesse à câmara de sondagem de anticorpos e baixe o chip do lado do gel para baixo para que a solução de anticorpos se espalhe pelo chip.Depois de duas horas em temperatura ambiente, lave o chip três vezes no tampão de lavagem e uma vez na água em um shaker. Incubar o chip com um anticorpo secundário apropriado por uma hora à temperatura ambiente protegido da luz. No final da incubação, lave o chip três vezes com tampão de lavagem e gire o chip em um girador de slides para remover qualquer tampão de lavagem restante.Para retirar o chip de mancha ocidental de uma única célula, coloque um rack de tubo de 15 mililitros em um banho de água de 60 graus Celsius com a água apenas um centímetro acima do rack. Em um capô de fumaça, adicione 40 mililitros de tampão de descascamento e 320 microlitros de etanol beta morcepta a um recipiente. Coloque o chip em uma placa de petri de 10 centímetros dentro do recipiente e sele o recipiente com Parafilm.Em seguida, coloque o recipiente dentro do rack de tubo no banho de água. Após 90 minutos, transfira cuidadosamente o chip para uma nova placa de petri e lave brevemente o chip uma vez com tampão de lavagem antes de adicionar 15 mililitros de tampão de lavagem fresco à placa de petri para uma lavagem de 15 minutos no shaker. Neste experimento representativo, as células recrutadas em cada plugue foram contadas em um, três e cinco dias após a injeção.Ao subtrair a contagem de células nos plugues carregados pelo veículo da contagem de células nos plugues carregados mcp-1, o número de células especificamente recrutadas em resposta ao atrativo de quimioterapia foi então calculado. Observou-se um recrutamento e acúmulo específico de células do MCP-1 acelerados durante o período de cinco dias, com taxas aumentando de 31.000 células por dia após um dia de injeção para até 136.000 células por dia, cinco dias após a injeção. A análise de manchas ocidentais de células únicas foi então usada para identificar os diferentes tipos de células recrutadas para os plugues derivados da membrana do porão, de acordo com sua expressão de marcadores de células imunes específicas de interesse.Por exemplo, a porcentagem de monócitos dentro dos plugues de gel derivados de membrana do porão mcp-1 foi baixa no primeiro dia e atingiu o pico no terceiro dia antes de cair novamente no quinto dia, enquanto o número de macrófagos aumentou constantemente ao longo do período de estudo. Para os plugues carregados mcp-1, a porcentagem de monócitos mais macrófagos dentro da população celular isolada foi maior no terceiro dia, indicando que após três dias, a grande maioria das células recrutadas por quimifitos dependentes do PCM-1 eram monocitos e macrófagos. Embora o número total de monócitos mais macrófagos seja tipicamente maior no quinto dia em comparação com o terceiro dia, a contagem de células no terceiro dia reflete com mais precisão o sangue periférico de quimiotaxis monócitos e recrutamento, e, portanto, o terceiro dia é recomendado para análises de plugue direto de membrana do porão.A aquisição bem sucedida de células únicas para análise a jusante depende da precisão da injeção e da remoção completa dos plugues. Citometria de fluxo, manchas ocidentais de célula única, sequenciamento de RNA em massa ou célula única e outros procedimentos de omics podem ser usados para avaliar a característica e fenótipos dos macrófagos recrutados derivados de monócitos e monocitos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Ativação e Mensuração de NLRP3 inflammasome Atividade Usando IL-1β em células dendríticas humanas Monocyte derivados

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Imunologia e Infecção

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Cultura de macrófagos macrófagos Colony estimulante fator diferenciado Humano monócitos derivados

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

Medição de granulócitos e monócitos fagocitose e oxidativo Atividade Burst no Sangue

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Caracterização de derivados de monócitos células dendríticas humanas por imagem Citometria de Fluxo: Uma Comparação entre dois protocolos de isolamento de monócitos

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Geração de células dendríticas derivadas de monócitos humanos a partir de sangue inteiro

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate FcÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Receptor-mediated Phagocytosis

Uso de um monócito monocamada Ensaio para Avaliar a fagocitose mediada pelo receptor Fcy

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Análise de Microglia e Macropagos derivados de Monócitos do Sistema Nervoso Central por Citometria de Fluxo

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Quantificar o humano Monocyte Chemotaxis In Vitro e linfócitos murino tráfico Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Caracterização de subconjuntos de monócitos humanos por sangue total Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Estimulação e visualização in vitro da liberação extracelular da armadilha em macrófagos humanos monocyte-derivados diferenciados

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...