Name: quantification of monocyte chemotactic activity in vivo and characterization of blood monocyte derived macrophages
Uploaded: 2019-08-12T13:30:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages at JoVE.com

Detta projekt stöddes av bidrag till ra från NIH (AT006885).

Alla de metoder som beskrivs i detta protokoll har godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén vid Wake Forest School of Medicine.
1. beredning av MCP-1-Loaded tillväxtfaktor-reducerad basalmembran-derived lösning
Anmärkning: Detta är en steril procedur.
<ol><li>Rengör cell odlings huven med desinfektionsmedel innan du förbereder basalmembranet härledd lösning (t. ex. Matrigel).</li>
	<li>Bered en individuellt packad steril 1 mL spruta och torka av flaskan med en spritsudd i basalmembranet med en sprittork innan du fyller på den i sprutan.</li>
	<li>Helt Tina tillväxtfaktorn-reducerad basalmembran-derived lösning på is. Försiktighet: Om basalmembranet matrisen tinats vid rumstemperatur (RT), se till att en liten ispartikel återstår att förhindra att lösningen från Gelling.</li>
	<li>När tinat, öppna flaskan och blanda MCP-1 eller 1xPBS med 0,1% BSA i cell Culture Hood.</li>
	<li>Bered en 1 mL av den sterila sprutan med en 26 G nål och kyl på isen.</li>
	<li>Bered en stamlösning av MCP-1 genom att lösa upp MCP-1 till en slutlig koncentration på 50 μg/mL i 1x PBS med 0,1% BSA.</li>
	<li>Späd ut MCP-1 i 5 mL kall basalmembran-derived lösning till en slutlig koncentration på 500 ng/mL. Förbered en lika mängd basalmembran-derived lösning med fordonet endast (1x PBS innehåller 0,1% BSA).</li>
	<li>Ladda 500 μL av basalmembran-derived lösning (med eller utan MCP-1) i den kalla 1 mL sprutan.</li>
	<li>Ta bort alla luftbubblor från basalmembranet-härledd lösning-laddad spruta innan du gör injektionen för att säkerställa en enhetlig plugg formation.</li>
</ol>2. injektion av basalmembran-derived lösning
<ol><li>Spraya 70% etanol runt procedur området före och under injektionerna för att desinficera miljön.</li>
	<li>För att inducera anestesi, Placera musen i en anestesi kammare och ställa in O2 flödesmätaren till 1 liter/min sedan justera spridare till 2% isofluran.</li>
	<li>Övervaka djupet av anestesi genom att övervaka andningsfrekvensen (hastighet/min), hornhinnan reflex och förflyttning av polisongar.</li>
	<li>Under hela proceduren, underhålla anestesi med hjälp av en näsa kon.</li>
	<li>Under förfarandet hålla övervakning av andningsfrekvens (hastighet/min), hornhinnan reflex och förflyttning av morrhår att kontrollera djupet av anestesi.</li>
	<li>Efter att ha bekräftat brist på svar på tå nypa, injicera långsamt (ca 100 μL/s) den basalmembran-härledda lösningen subkutant till höger (ingen MCP-1) och vänster (med MCP-1) flank av musen, respektive. Om injektionen är för långsam, kan basalmembran-härledda gel pluggar bli oregelbundet formad, eller till och med fragmenterad, och svår att ta bort.</li>
	<li>Håll sprutan för 20-30 s efter injektionen för att förhindra läckage av lösningen och för att möjliggöra en enda smidig gel-plugg till formen.</li>
	<li>Efter injektion, Placera musen på uppvärmningen pad med övervakning tills återhämtning.</li>
	<li>Returnera musen till den ursprungliga buren när musen är helt återhämtat.</li>
</ol>3. skörda basalmembran-härledda gel pluggar
<ol><li>Väg två separata 1,5 mL microcentrifugerör för varje mus och märk dem.</li>
	<li>Tre dagar efter injektion av basalmembranet-derived lösning, euthanize musen i bedövnings kammaren med 3% isofluran följt av cervikal dislokation.</li>
	<li>Ta bort musens rygg päls med hårklippningsmaskiner eller applicera hårborttagnings kräm med bomullstippade pinnar i 5 min och torka sedan av.</li>
	<li>Håll mus huden med pinkoppar runt nedre bröstkorg och övre ländryggen och gör en 2 mm lång snitt i huden.</li>
	<li>Skär mittlinjen på bak med musen från ett snitt som gjorts upp till livmoderhals Kotor och ner till 1 cm ovanför caudal Kota korsning (svans korsning) med hjälp av kirurgisk sax.</li>
	<li>Separera huden från muskellagret och PIN-Down huden på en polystyren skum plattform.</li>
	<li>Håll försiktigt den fibrösa kapseln som innehåller den basalmembran-härledda gel plugg med fin tång och ta bort den fibrösa kapseln med fin sax för att rengöra pluggen.</li>
	<li>Ta bort den rengjorda basalmembranet-derived gel plugg och överföring till 1,5 mL microcentrifug (se 3,1).</li>
	<li>Väg mikrocentrifug röret med rengöras basalmembran-derived gel plugg och beräkna vikten av basalmembran-derived gel plugg.</li>
</ol>4. smälta den källare membran-härledda gel pluggar
<ol><li>Tina dispas (10 ml) på isen.</li>
	<li>Finhacka basalmembran-derived gel plugg i mikrocentrifug röret med rena fina saxar.</li>
	<li>Tillsätt 800 μl av dispas i varje microcentrifug tub som innehåller ett membran-härledd gel plugg.</li>
	<li>Vortex med maximal hastighet för 10 s för att störa pluggen.</li>
	<li>Inkubera mikrocentrifugrör för 2 h vid 37 ° c vid 1 400 rpm i en termomixer för att helt lösa upp den basalmembran-härledda gel pluggen.</li>
	<li>Efter 2 h, Centrifugera vid 400 x g i 10 minuter vid RT. Ta försiktigt bort och Kassera supernatanten.</li>
	<li>Omsuspendera pelleten i 1 mL 1x PBS genom att invertera eller knacka.</li>
	<li>Upprepa centrifugeringen vid 200 x g i 10 minuter vid RT. Ta försiktigt bort och Kassera supernatanten.</li>
	<li>Omsuspendera pelleten i 300 μL PBS.</li>
	<li>Ta 50 μL cellsuspension i ett separat microcentrifugerör.</li>
	<li>Tillsätt 0,5 μL av calcein AM (1 M) till cellsuspensionen. Anmärkning: Calcein AM är en grön fluorescerande cell livskraftig färg som endast ackumuleras i levande celler.</li>
	<li>Inkubera cellerna i en CO2 inkubator vid 37 ° c i 10 min.</li>
	<li>Räkna gröna fluorescerande (levande) och icke-fluorescerande (döda) celler med hjälp av en automatiserad cell räknare.</li>
</ol>5. bestämning av cell sammansättning i cellsuspensionen med encellig Western blot (scWB) analys
<ol><li>Rehydrera scWB-kretsen före användning i 15 mL 1x suspension buffert i en petriskål i minst 10 min vid RT.</li>
	<li>Tillsätt 1 mL av den utspädda encellig suspensionen (10000-100000 celler/mL) till det rehydrerade chipet. Ställ in ytan på botten av en 10 cm petriskål. Se till att ytan är fast inställd.</li>
	<li>Täck petriskål med ett lock för att förhindra torkning och låt cellerna nöja sig med 5-15 min med lutning.</li>
	<li>Placera chip under ett ljust fält Mikroskop och inspektera brunnarna vid 10X förstoring. Anmärkning: Cirka 15-20% mikrobrunnar bör upptas av en enda cell, mindre än 2% av brunnarna bör innehålla 2 eller flera celler</li>
	<li>Luta 10 cm petriskål som innehåller chip med 45 grader.</li>
	<li>Tvätta chip med 1x suspension buffert för att ta bort ofångade celler från ytan av chip genom att försiktigt Pipettera från toppen till botten av chip. Upprepa 3 gånger.</li>
	<li>Förbered Single cell Western instrument.</li>
	<li>Ställ in lysis tid, elektrofores tid, och UV fånga tid. För att analysera rekryterade makrofager återhämtade från basalmembran-derived gel plugg, Använd följande inställningar: lysis tid: 0 s; elektrofores tid: 160 s; UV-infångnings tid 240 s.</li>
	<li>Försiktigt in chip i elektrofores cellen av Single cell Western instrument, gel-sidan vänd. Var försiktig så att du inte skadar gelsidan på chippet.</li>
	<li>Häll Lys/Running buffert i kammaren och helt täcka hela Single cell Western chip. Starta cellen lysis.</li>
	<li>Kör scWB instrument med den inställning som anges i 5,8.</li>
	<li>När körningen är klar, överföra chip till en 10 cm petriskål och tvätta chippet två gånger med 1x tvättbuffert för 10 min vid RT.</li>
	<li>Förbered spädningar av primär antikropp (anti-vinculin: 1:10; anti-CD45:1:15, anti-CD11b: 1:20, anti-F4/80:1:10) i en total volym av 80 μL antikropps spädningsmedel (blanda 8 μL antikropp 1 plus 8 μL antikropp 2 Plus 64 μL spädningsvätska).</li>
	<li>Tillsätt 80 μl av den primära antikroppslösningen till antikropps sondering-kammaren och sänk ned spångelsidan så att antikroppslösningen vekar över spånan.</li>
	<li>Inkubera med den primära antikroppslösningen för 2 timmar vid RT.</li>
	<li>Tvätta chippet tre gånger i 10 minuter i 1x tvättbuffert på skakapparaten.</li>
	<li>Tvätta chip en gång för 10 min i vattnet på shaker att avsalta gelen.</li>
	<li>Bered en 1:20 utspädning av sekundär antikropp i en total volym av 80 μL (blanda 2 μL sekundär antikropp plus 78 μL spädningsvätska).</li>
	<li>Inkubera chip med sekundär antikropp för 1 h vid RT skyddas från ljus.</li>
	<li>Tvätta chippet tre gånger i 10 minuter med 1x tvättbuffert på skakapparaten.</li>
	<li>Snurra chip med hjälp av en Slide spinner för att ta bort eventuella kvarvarande tvättbuffert.</li>
	<li>Skanna chip på en dual-laser microarray Scanner vid 5 μm upplösning vid spektralkanalen av fluorophore kopplad till sekundära antikroppar.</li>
	<li>Analysera data med scWB-specifik programvara.</li>
</ol>6. strippa scWB chip
<ol><li>Förvara den skannade kretsen i tvättbufferten tills den är klar att tömma.</li>
	<li>Placera vattenbadet i ett draghuv.</li>
	<li>Placera en 50 mL rör rack i vattenbadet med vattnet bara 1 cm ovanför racket och Ställ in vattentemperaturen vid 60 ° c.</li>
	<li>Förbered strippningsbufferten. Lös upp 9,85 g av Tris-HCl (pH 6,8) och 20 g SDS i 900 mL destillerat vatten för 1 liter avstridningsbuffert och justera pH-värdet. Fyll sedan med destillerat vatten till 1L. Tillsätt 0,8% (v/v) β-merkaptoetanol (β-ME; 14,3 M) omedelbart före varje användning.</li>
	<li>Efter den första genomsökningen, placera chip i en 10 cm petriskål innan strippning.</li>
	<li>För varje chip, ta 40 mL strippningsbuffert och tillsätt 320 μl β-ME. Varning: β-me är giftigt och farligt för människa och miljö. Följande procedur ska utföras i ett draghuv.</li>
	<li>Placera chipet i behållaren och försegla kapseln med parafilm för att förhindra att vatten läcker in i behållaren.</li>
	<li>Placera behållaren inuti röret rack i förvärmda vattenbad.</li>
	<li>Inkubera i 90 min.</li>
	<li>Ta försiktigt bort chipet från behållaren och placera i en färsk petriskål.</li>
	<li>Tvätta kort chippet en gång med 1x tvättbuffert. Tillsätt sedan 15 mL 1x tvättbuffert till petriskål.</li>
	<li>Tvätta chippet i 15 minuter på en shaker. Upprepa tvättsteget fyra gånger. Anmärkning: Chip är redo för nästa primära antikropp (se steg 5,12-5,21).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Moore, K. J., Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+in+the+pathogenesis+of+atherosclerosis.">Macrophages in the pathogenesis of atherosclerosis.</a> Cell. 145 (3), 341-355 (2011).</li><li>Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-mediated+inflammation+in+metabolic+disease.">Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 738-749 (2011).</li><li>McNelis, J. C., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages,+immunity,+and+metabolic+disease.">Macrophages, immunity, and metabolic disease.</a> Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).</li><li>Akiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genistein,+a+specific+inhibitor+of+tyrosine-specific+protein+kinases.">Genistein, a specific inhibitor of tyrosine-specific protein kinases.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (12), 5592-5595 (1987).</li><li>Nahrendorf, M., Pittet, M. J., Swirski, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes:+protagonists+of+infarct+inflammation+and+repair+after+myocardial+infarction.">Monocytes: protagonists of infarct inflammation and repair after myocardial infarction.</a> Circulation. 121 (22), 2437-2445 (2010).</li><li>Gosling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCP-1+deficiency+reduces+susceptibility+to+atherosclerosis+in+mice+that+overexpress+human+apolipoprotein+B.">MCP-1 deficiency reduces susceptibility to atherosclerosis in mice that overexpress human apolipoprotein B.</a> Journal of Clinical Investigation. 103 (6), 773-778 (1999).</li><li>Fantuzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+CCR2+expression+and+functional+response+to+monocyte+chemotactic+protein+(MCP-1)+during+the+differentiation+of+human+monocytes:+role+of+secreted+MCP-1+in+the+regulation+of+the+chemotactic+response.">Loss of CCR2 expression and functional response to monocyte chemotactic protein (MCP-1) during the differentiation of human monocytes: role of secreted MCP-1 in the regulation of the chemotactic response.</a> Blood. 94 (3), 875-883 (1999).</li><li>Boring, L., Gosling, J., Cleary, M., Charo, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+lesion+formation+in+CCR2-/-+mice+reveals+a+role+for+chemokines+in+the+initiation+of+atherosclerosis.">Decreased lesion formation in CCR2-/- mice reveals a role for chemokines in the initiation of atherosclerosis.</a> Nature. 394 (6696), 894-897 (1998).</li><li>Han, K. H., Tangirala, R. K., Green, S. R., Quehenberger, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+CCR2+expression+and+monocyte+chemoattractant+protein-1-mediated+chemotaxis+in+human+monocytes.+A+regulatory+role+for+plasma+LDL.">Chemokine receptor CCR2 expression and monocyte chemoattractant protein-1-mediated chemotaxis in human monocytes. A regulatory role for plasma LDL.</a> Arteriosclerosis Thrombosis Vascular Biology. 18 (12), 1983-1991 (1998).</li><li>Kanda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCP-1+contributes+to+macrophage+infiltration+into+adipose+tissue,+insulin+resistance,+and+hepatic+steatosis+in+obesity.">MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (6), 1494-1505 (2006).</li><li>Davies, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+the+adhesion+molecules+ICAM-1,+VCAM-1,+PECAM,+and+E-selectin+in+human+atherosclerosis.">The expression of the adhesion molecules ICAM-1, VCAM-1, PECAM, and E-selectin in human atherosclerosis.</a> Journal of Pathology. 171, 223-229 (1993).</li><li>Anderson, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cholesterol-lowering+and+antioxidant+therapy+on+endothelium-dependent+coronary+vasomotion+(see+comments).">The effect of cholesterol-lowering and antioxidant therapy on endothelium-dependent coronary vasomotion (see comments).</a> New England Journal of Medicine. 332 (8), 488-493 (1995).</li><li>Herold, S., Mayer, K., Lohmeyer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+lung+injury:+how+macrophages+orchestrate+resolution+of+inflammation+and+tissue+repair.">Acute lung injury: how macrophages orchestrate resolution of inflammation and tissue repair.</a> Frontiers in Immunology. 2, (2011).</li><li>Qiao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol+Oxidative+Stress+Induced+by+Metabolic+Disorders+Amplifies+Macrophage+Chemotactic+Responses+and+Accelerates+Atherogenesis+and+Kidney+Injury+in+LDL+Receptor-Deficient+Mice.">Thiol Oxidative Stress Induced by Metabolic Disorders Amplifies Macrophage Chemotactic Responses and Accelerates Atherogenesis and Kidney Injury in LDL Receptor-Deficient Mice.</a> Arteriosclerosis Thrombosis Vascular Biology. 29, 1779-1786 (2009).</li><li>Ullevig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+Oxidase+4+Mediates+Monocyte+Priming+and+Accelerated+Chemotaxis+Induced+by+Metabolic+Stress.">NADPH Oxidase 4 Mediates Monocyte Priming and Accelerated Chemotaxis Induced by Metabolic Stress.</a> Arteriosclerosis Thrombosis Vascular Biology. 32 (2), 415-426 (2012).</li><li>Kim, H. S., Ullevig, S. L., Zamora, D., Lee, C. F., Asmis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+MAPK+phosphatase+1+controls+monocyte+migration+and+macrophage+recruitment.">Redox regulation of MAPK phosphatase 1 controls monocyte migration and macrophage recruitment.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 109 (41), E2803-E2812 (2012).</li><li>Kim, H. S., Tavakoli, S., Piefer, L. A., Nguyen, H. N., Asmis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytic+MKP-1+is+a+Sensor+of+the+Metabolic+Environment+and+Regulates+Function+and+Phenotypic+Fate+of+Monocyte-Derived+Macrophages+in+Atherosclerosis.">Monocytic MKP-1 is a Sensor of the Metabolic Environment and Regulates Function and Phenotypic Fate of Monocyte-Derived Macrophages in Atherosclerosis.</a> Scientific Reports. 6, 34223 (2016).</li><li>Ponce, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tube+formation:+an+in+vitro+matrigel+angiogenesis+assay.">Tube formation: an in vitro matrigel angiogenesis assay.</a> Methods in Molecular Biology. 467, 183-188 (2009).</li><li>Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+assays:+a+critical+overview.">Angiogenesis assays: a critical overview.</a> Clinical Chemistry. 49 (1), 32-40 (2003).</li><li>Kim, H. S., Ullevig, S. L., Nguyen, H. N., Vanegas, D., Asmis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+14-3-3zeta+controls+monocyte+migration.">Redox regulation of 14-3-3zeta controls monocyte migration.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (7), 1514-1521 (2014).</li><li>Short, J. D., Downs, K., Tavakoli, S., Asmis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Thiol+Redox+Signaling+in+Monocytes+and+Macrophages.">Protein Thiol Redox Signaling in Monocytes and Macrophages.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 816-835 (2016).</li><li>Tavakoli, S., Asmis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+and+thiol+redox+signaling+in+the+macrophage+biology+of+atherosclerosis.">Reactive oxygen species and thiol redox signaling in the macrophage biology of atherosclerosis.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 17 (12), 1785-1795 (2012).</li><li>Ullevig, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+S-Glutathionylation+Mediates+Macrophage+Responses+to+Metabolic+Cues+from+the+Extracellular+Environment.">Protein S-Glutathionylation Mediates Macrophage Responses to Metabolic Cues from the Extracellular Environment.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 836-851 (2016).</li></ol>

Vi utvecklade en in vivo chemotaxis assay, att använda sig av de unika fysikaliska egenskaperna hos basalmembran-derived Matrix och förmågan att ladda denna unika matris med chemokines och injicera den i möss. Analysen gör att vi kan bedöma i levande möss reaktionsförmågan hos monocyter (och makrofager) till chemokiner, som illustreras här för MCP-1, och effekterna av antingen genetisk manipulation eller farmakologiska, kosten och andra miljöexponeringar på monocyt Chemotaxisna. Eftersom Chemokine lutning vi skapar i dessa möss är i huvudsak opåverkad av genetiska, farmakologiska, kosten eller miljöexponering, förändringar i monocyt kemotaktisk aktivitet återspeglar faktiskt funktionella förändringar i dessa monocyter och, som vi visade tidigare även omprogrammering på både protein-och transkriptionell nivå17,20. Vi rapporterade att metabolisk stress hos möss ökar monocyt lyhördhet för Chemoattractant och att denna Hyper-chemotactic aktivitet korrelerar med ökad protein S-glutathionylation, en reversibel, redox-beroende posttranslationella proteinmodifiering, som i de flesta fall leder till förlust av enzymatisk och proteinfunktion21,22, och i vissa fall även främjar proteinnedbrytning16,23.
För att framgångsrikt utföra denna procedur och för att få optimala resultat med denna analys är det viktigt att korrekta volymer av basalmembran-derived lösning injiceras långsamt för att skapa en ovanlig välformade plugg och fibrösa kapslar bör tas bort helt för att få rena pluggar när skörden basalmembran-härledda gel pluggar, underlättar upplösningen av hela pluggen i dispas lösning. Våra data visar att lämna kontakten i djuren i tre dagar optimerar 1) signalintensiteten, dvs antalet monocyter och makrofager rekryteras till varje plugg, 2) selektivitet av signalen, dvs innehållet i monocyter och makrofager inom totala cellpopulationer och 3) signalens specificitet, d.v.s. ökningen av monocyter och makrofager som svar på MCP-1 jämfört med vehikel. Slutligen, vi visar hur State-of-the-art Single cell-baserade metoder i samband med basalmembran-derived gel plug assay kan användas för att karakterisera monocyter rekryteras i pluggarna och därmed få en ögonblicksbild av den potentiella fenotyp av de monocyte-härledda makrofager rekryteras till platser för skada i en viss musmodell som svar på specifika genetiska, farmakologiska, Dietary eller miljö interventioner.
Det finns ett antal begränsningar i analysen som skall övervägas. Första, mushantering, inklusive anestesi, injektion av basalmembran-derived lösning, och kirurgisk dissektion kräver övning för att generera enda pluggar och reproducerbara data. Andra, medan de flesta celler rekryteras till MCP-1 laddade pluggar är monocyter och makrofager, ett stort antal är inte. Detta kan påverka tolkningen av andra, icke-enkelcellsbaserade analytiska analyser som utförs på denna cellpopulation. Slutligen, eftersom cell Lys villkor för scWB är milda, migration avstånd av proteiner kan skilja sig från standard WB och får inte korrelera med protein storlek. Därför måste både cell lysis och körtider valideras för varje nytt protein som ska testas och varje primär antikropp som används.

Rekrytering av monocyte-härledda makrofager är avgörande för utvecklingen av kroniska inflammatoriska sjukdomar i samband med metabola sjukdomar, inklusive åderförkalkning och fetma1,2,3, 4. Antalet monocyte-härledda makrofager på platser av vävnadsskada samt deras plasticitet är avgörande för vävnaden homeostas och reparation. Både under-och över-rekrytering av monocyte-härledda makrofager kan försämra sårläkning5. Utlösa lokal vävnad inflammation, till exempel, genom ackumulering och oxidation av Low-density lipoprotein (LDL) i aorta väggen eller inflammatorisk aktivering av adipocyter av fettsyror eller bakteriell lipopolysackarid läcker genom tarmen barriär, leder till frisättning av inflammatoriska mediatorer, inklusive chemokiner såsom monocyt Chemoattractant protein-1 (MCP-1/CCL2). MCP-1 är medlem i c-c Chemokine familjen och en viktig Chemoattractant ansvarig för rekrytering av monocyte-härledda makrofager till områden av vävnad inflammation och skada6,7,8, 9,10. Inflammatorisk aktivering av vaskulär endotelet resulterar i uttrycket av adhesionsmolekyler som intercellulära adhesionsmolekylen 1 (ICAM-1) och vaskulär celladhesionmolekyl 1 (VCAM-1)11,12, vilket gör cirkulerande monocyter aktiveras av MCP-1 för att rulla längs, stadigt följa och därefter transmigrera till subendothelial rymden12. Infiltrerande monocyter differentiera till makrofager, som kan aktiveras i en proinflammatorisk fenotyp, drivande den akuta inflammatoriska processen. Driven av mikromiljön, pro-inflammatoriska makrofager kan omvandla till inflammation-lösa makrofager, som spelar kritiska roller i clearing av inflammatoriska celler, ta bort pro-inflammatoriska signaler och slutföra vävnad reparation och sår Healing12,13.
Kronisk metabolisk stress primtal monocyter för dramatiskt ökad lyhördhet för chemo-attractants och ökad monocyt rekrytering, och vi visade att primas monocyter ger upphov till makrofager med dysreglerade aktiveringsprogram och polarisering staterna14,15,16. Monocyte priming främjar åderförkalkning, fetma, och möjligen andra kroniska inflammatoriska sjukdomar i samband med metabola sjukdomar som steatohepatit, njursjukdomar och möjligen cancer. För att bedöma och kvantifiera monocyt priming i musmodeller av mänskliga sjukdomar, vi utvecklat en ny teknik för att bedöma priming tillstånd av blod monocyter genom att mäta den chemotaktiska aktiviteten in vivo14,15,16, 17. Vårt tillvägagångssätt innebär injektion av basalmembran-derived gel laddad med antingen en Chemoattractant-vi vanligtvis använder MCP-1-eller fordon i vänster och höger flank, respektive, av möss. När försiktigt injiceras subkutant, kommer basalmembran-derived gel bildar en enda plugg, från vilken chemokines kan diffusa och skapa en definierad kemotaktisk lutning som inte påverkas av det metabola eller inflammatoriska tillståndet i den omgivande eller mottagar musen.
Den källare membran-härledda gel vi använder för vår analys är en solubilized källare membran beredning utvinns ur Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mus sarkom, en tumör rik på sådana extracellulära matrix (ECM) proteiner. Denna komplexa proteinblandning innehåller laminin (60%), kollagen IV (30%), bryggmolekylen entactin (8%), och ett antal tillväxtfaktorer. Basalmembranet Matrix plug assay utvecklades ursprungligen för att undersöka angiogenes som svar på olika tillväxtfaktorer18,19. Men för att studera monocyt chemotaxis, är det viktigt att använda tillväxtfaktor-utarmat basalmembran-derived gel för att minimera endotelceller cell rekrytering och angiogenes. Vad gör Matrigel (kallas basalmembran-derived gel hädanefter) unik och särskilt användbar är att vid temperaturer under 10 ° c det likställer, vilket gör det möjligt för chemokiner att upplösas. Vid temperaturer över 22 ° c genomgår basalmembranet-derived lösning snabbt en fasövergång och bildar snabbt en hydrogel. Pluggarna kan kirurgiskt exciseras, rengöras och lösas med en Bacillus-derived neutral metalloprotease att ge enda cellsuspensioner, som kan analyseras på en Fluorescence-aktiverad cell sorterare (FACS), genom RNAseq, Single-cell RNA och en mängd andra omics tekniker. Här beskriver vi användningen av Single-cell Western blot analys för karakterisering av cellpopulationer rekryteras i källaren membran-härledda gel pluggar en, tre eller fem dagar efter injektion.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:628px;" width="628">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">10 cm petri dish</td>
			<td style="width:103px;">griner bio-one</td>
			<td style="width:123px;">664 160</td>
			<td style="width:184px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">10x suspension buffer</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">R101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">15 cm petri dish</td>
			<td style="width:103px;">Falcon</td>
			<td style="width:123px;">353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:103px;">MP BIOMEDICALS</td>
			<td style="width:123px;">2194705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">5% washing buffer</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">R252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Antibody diluent</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">042-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Bench Top Centrifuge</td>
			<td style="width:103px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Microfuge 22R Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Bovine Serim Albumin</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Calcein AM</td>
			<td style="width:103px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">C3099</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">CD11b</td>
			<td style="width:103px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:123px;">NB110-89474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">CD45 (D4H7K) rabbit mAb</td>
			<td style="width:103px;">Cell Signal Technologies</td>
			<td style="width:123px;">727987S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">CD68/SR-D1 (FA-11)</td>
			<td style="width:103px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:123px;">NBP2-33337SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Cellometer Vision</td>
			<td style="width:103px;">Nexcelom</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Dispase</td>
			<td style="width:103px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">354235</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Dissecting sissor</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Donkey anti-Rabbit IgG secondary antibody [NL557]</td>
			<td style="width:103px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:123px;">NL004</td>
			<td>NL 557 conjugate</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:219px;">Donkey anti-Rat IgG (H+L) secondary antibody [DyLight 650]</td>
			<td style="width:103px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:123px;">NBP1-75655</td>
			<td>DyLight 650 conjugate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">F4/80 (CI-A3-1)</td>
			<td style="width:103px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:123px;">NB600-404SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Heat Block</td>
			<td style="width:103px;">effendorf</td>
			<td style="width:123px;">22331</td>
			<td>Thermomixer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Lysis/Running buffer</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">R200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Matrigel Matrix (Grwoth Factor Reduced)</td>
			<td style="width:103px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">354230</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Microarray scanner</td>
			<td style="width:103px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:123px;">ScanArray Gx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Microscope</td>
			<td style="width:103px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">Evos fl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Milo</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Single cell western</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Needle</td>
			<td style="width:103px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">305111</td>
			<td>26G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Parafilm</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Probing chamber</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">035-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Recombinant mouse CCL2/JE/MCP-1 protein</td>
			<td style="width:103px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:123px;">479-JE-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">scWEST chip</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">C300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Shaker</td>
			<td style="width:103px;">Bioexpress</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Gene mate orbital shaker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Single cell western chip canister</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">035-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Slide spinner</td>
			<td style="width:103px;">Labnet</td>
			<td style="width:123px;">C1303-T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP 166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Syringe</td>
			<td style="width:103px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">309602</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Tris-Hydrochloride</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP 153-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Tweezer</td>
			<td style="width:103px;">proteinsimple</td>
			<td style="width:123px;">035-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Water bath</td>
			<td style="width:103px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of monocyte chemotactic activity in vivo and characterization of blood monocyte derived macrophages

Vävnad homeostas och reparation är kritiskt beroende av rekrytering av monocyte-derived makrofager. Både under-och över-rekrytering av monocyte-härledda makrofager kan försämra sårläkning. Vi visade att hög fetthalt och hög socker diet främja monocyt priming och dysfunktion, omvandla friska blod monocyter till en Hyper kemotaktisk fenotyp redo att differentiera till makrofager med dysreglerade aktiverings profiler och nedsatt fenotypisk Plasticitet. Över-rekrytering av monocyte-härledda makrofager och rekrytering av makrofager med dysreglerade aktiverings profiler tros vara en viktig bidragande orsak till utvecklingen av kroniska inflammatoriska sjukdomar i samband med metabola sjukdomar, inklusive åderförkalkning och fetma. Målet med detta protokoll är att kvantifiera den chemotaktiska aktiviteten av blod monocyter som en biomarkör för monocyt priming och dysfunktion och att karakterisera den makrofagfenotyp blod monocyter är redo att differentiera till i dessa musmodeller. Använda Single cell Western blot analys, visar vi att efter 24 h 33% av celler rekryteras till MCP-1-Loaded källare membran-härledda gel pluggar injiceras i möss är monocyter och makrofager; 58% efter dag 3. Emellertid, på dag 5, monocyt och makrofag nummer minskade signifikant. Slutligen visar vi att detta analyser också möjliggör isolering av levande makrofager från kirurgiskt hämtade basalmembran-härledda gel pluggar, som sedan kan utsättas för efterföljande karakterisering av Single cell Western blot analys.

För att få tillgång till reaktionsförmåga blod monocyter till chemoattractants, vi injicerade fordonsbelastade och MCP-1 lastas basalmembran-derived lösning i vänster och höger flanker av varje mus. Basalmembran-härledda gel pluggar togs bort 1, 3 och 5 dagar efter injektioner, upplöst och celler rekryterades till varje plugg räknades (figur 1a). Genom att subtrahera antalet celler i den fordonsbelastade pluggen (öppna staplar) från cell räkningen i den laddade MCP-1-pluggen (stängda staplar), erhöll vi antalet blodkroppar som rekryterades specifikt som svar på MCP-1 (Δ-cellnummer, figur 1b). Vi observerade en accelererad MCP-1-specifik rekrytering och ackumulering av celler under 5-dagarsperioden, med priser som ökar från 31 000 celler/dag (dag 1) till 78 000 celler/dag (dag 3) och 136 000 celler/dag dag 5 (figur 1b).
För att identifiera de celltyper som trädde i källaren membran-härledda gel pluggar, utsattes vi cellerna isolerade från varje plugg till Single cell Western blot analys (scWB), sondera för CD45, CD11b och F4/80 uttryck för att identifiera monocyter (CD11b+F4/80 -), makrofager (CD11b+F4/80+ plus CD11b-F4/80+) och kvarvarande icke-monocytiska leukocyter (CD45+CD11b-F4/80-) (figur 2). Den scwb chips var sedan sonderade för vinculin att bestämma den totala cell nummer på varje gel och för att bekräfta Single cell beläggning av mikrobrunnar på scwb chip. Andelen monocyter inom MCP-1-Loaded källare membran-härledda gel pluggar var låg på dag 1, 20%, nådde dag 3 på 47%, respektive innan de sjönk till 14% vid dag 5 (figur 2D). Makrofag nummer inom MCP-1-Loaded basalmembran-härledda gel pluggar ökat stadigt från 13% vid dag 1, till 22% på dag 3 och 23% på dag 5. För MCP-1-laddade pluggar var andelen monocyter plus makrofager inom den isolerade cellpopulationen störst vid dag 3, 31% i fordonsbelastade pluggar (figur 3a) och 58% i MCP-1-laddade pluggar (figur 3b), vilket indikerar att efter 3 dagar de allra flesta celler som rekryteras av MCP-1-beroende chemotaxis är monocyter och makrofager. Även om det totala antalet monocyter plus makrofager var högre vid dag 5 jämfört med dag 3 (figur 3c och D), på grund av den betydligt högre andelen monocyter och makrofager i den totala cellpopulationen (figur 3a och B), cellen räkna på dag 3 mer exakt återspeglar blod monocyt chemotaxis och rekrytering. Vi, därför, injicera rutinmässigt basalmembranet-derived lösning tre dagar före offra djuren. Om alla makrofager som rekryterats av MCP-1 är monocyte-härledda eller bosatta makrofager som rekryterades från angränsande vävnader, fastställdes inte.
Statistisk analys av de data som visas här utfördes med analysprogramvara (t. ex. SigmaPlot 14). ANOVA följt av Fischer LSD-testet användes för att jämföra medelvärdena mellan experimentella grupper. Alla data presenteras som medelvärdet ± SD på minst 3 oberoende experiment. Resultaten ansågs vara statistiskt signifikanta vid P < 0,05-nivå.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59706/59706fig1v2.jpg"> Figur 1 : Kvantifiering av celler rekryteras till subkutana basalmembran-härledda gel pluggar. (A) absoluta cell nummer för fordonsbelastade (öppna staplar) och MCP-1-lastade membran-härledda gel kontakter (slutna stänger). (B) antalet celler som rekryterats till membran-härledda gel kontakter med MCP-1 beräknat som skillnaden i cell nummer mellan MCP-1-lastade och fordonsladdade pluggar. Resultaten visas som medelvärdet ± SD (n = 4) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59706/59706fig1v2large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59706/59706fig2.jpg"> Figur 2 : Analys av cellpopulationer rekryteras till basalmembran-derived gel pluggar av Single cell Western blot analys. (a + B) Representativa exempel visas för scWB-analysen av ett fordonsbelastat (kontroll) och en MCP-1-blyad kontakt (MCP-1) som isolerats från en mus tre dagar efter injektionen. Chips märkta med antikroppar riktade mot CD45, CD11b och F4/80 följt av fluorescerande sekundära antikroppar enligt beskrivningen i protokollet. Fluorescensintensiteten för det märkta bandet för varje enskild cell visas som toppområde. (C + D) Cell populationer identifierades som monocyter (CD11b+F4/80-, <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59706/59706img01.jpg"> </img>), makrofager (CD11b+F4/80+ plus CD11b-F4/80+, <img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/59706/59706img02.jpg" style="font-size: 14px;"> </img>) eller som icke-monocytiska leukocyter (CD45+ , <img alt="Image 3" src="/files/ftp_upload/59706/59706img03.jpg" style="font-size: 14px;">). De återstående cellerna var märkta "other" (<img alt="Image 4" src="/files/ftp_upload/59706/59706img04.jpg" style="font-size: 14px;">). Resultaten visas som medelvärde ± SD (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59706/59706fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59706/59706fig3.jpg"> Figur 3 : Monocyt och makrofaginnehåll i basalmembran-härledda gel pluggar. Kvantitativ analys av rekryterad monocyt och makrofag-halt i fordonsbelastade och MCP-1-laddade pluggar avlägsnades vid dag 1, 3 och 5 efter injektionen. Värdena visas som procent av den totala cellpopulationen (A + B) och i absoluta cell tal per plugg (C + D). Resultaten visas som medelvärde ± SD (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59706/59706fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages at JoVE.com

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Här presenterar vi ett protokoll för att kvantifiera den chemotaktiska aktiviteten av blod monocyter i musmodeller, att bedöma effekterna av näringsmässiga, farmakologiska och genetiska interventioner på blod monocyt och att karakterisera blod monocyter härledda makrofager i musmodeller med monocyte-Chemoattractant protein-1 (MCP-1)-Loaded basalmembran-derived gel pluggar.

Kvantifiering av Monocytisk Chemotaktisk aktivitet in vivo och karakterisering av Blodmonocyte härledda makrofager

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

Denna metodik gör det möjligt för oss att kvantifiera den chemotactic aktiviteten av blodmonocyte i levande djur och att studera effekten av dålig kost på monocytfunktion och deras underliggande mekanismer. Monocyte-härledda makrofager kan isoleras och analyseras med hjälp av olika metoder, inklusive single cell, och omics tekniker som ger en ögonblicksbild av hälsan hos blodmonocyten plats i musmodeller. Dagens förfarande kommer att genomföras av Dr.Young Joo Ahn en biträdande professor i mitt labb, och Dr Luxi Wang, en postdoc i mitt labb.Innan du påbörjar proceduren rengör cellkulturens huva med desinfektionsmedel och helt tina den tillväxtfaktorreducerade källarmembran-härledda lösningen på is. Utrusta individuella sterila en millilitersprutor med 26 gauge nålar och placera nålarna på is. När lösningen har tinat, torka toppen av källaren membran-härledda lösning injektionsflaska med en alkohol svabb innan du laddar 500 mikro liter lösning kompletteras med eller utan cellgifter locka i varje en milliliter spruta.Ta sedan bort eventuella luftbubblor från källaren membran-härledda lösningen laddad spruta för att säkerställa en enhetlig pluggbildning. Efter att ha bekräftat en brist på svar på tå nypa, injicera långsamt en hel volym av källaren membran-härledda lösning utan MCP-1 läggas till cirka 100 mikro liter per sekund subkutant i den högra flanken av den sövda musen. Och hela 500 mikro liter källaren membran-härledda lösning kompletteras med MCP-1 i den vänstra flanken av djuret.Håll sprutan på plats 20 till 30 sekunder efter injektionen för att förhindra läckage av lösningen och för att en enda, jämn gelplugg ska kunna bildas innan musen placeras på en värmande pad med övervakning tills fullständig återhämtning. Tre dagar efter injektionen, ta bort rygghår från en plug-injiceras djur och använda forceps att greppa huden runt nedre bröst och övre ländkotan. Gör en två millimeter långt snitt i huden och skär längs mittlinjen på musens baksida från halskokoorna ner till en centimeter ovanför coddle vertebral korsningen.Separera huden från muskellagret och nåla fast huden på en polystyrenskumplattform. Nästa, under en dissekera mikroskop, noggrant greppa fibrösa kapseln som innehåller källaren membran-härledda gel plugg och använda fina tlysningar för att ta bort den fibrösa kapseln. Använd sedan fin sax för att rengöra kontakten.Överför sedan den rengjorda källarmembran-härledda gelpluggen till ett lämpligt märkt och vägde 1,5 milliliter mikrocentrifugrör. Reweigh röret för att beräkna vikten av källaren membran-härledda gel plugg. För källare membran-härledda gel plug matsmältningen, använd rena fina saxar för att finhacka källaren membran-härledda gel plugg i varje mikro centrifugrör och lägga till 800 mikro liter tränga till pluggarna.Vortexa vid maxhastigheten i 10 sekunder för att störa pluggarna och placera mikrocentrifugrören på 37 grader Celsius i två timmar i en termosblandare vid 1400 rotationer per minut för att helt lösa upp de källarmembranhärledda gelpluggarna. Vid inkuberingens sedimenterar pluggfragmenten genom centrifugeringen två gånger och återanvänder pelletsen i 300 mikroliter pbs. Överför 50 mikroliter av varje cellupphängning till nya mikrocentrifugrör och märk cellerna i de nya rören med 0,5 mikroliter kalcinet.Efter en 10 minuters inkubation vid 37 grader Celsius i en koldioxidinkubator, räkna antalet levande gröna fluorescerande positiva och döda icke-fluorescerande celler på en automatiserad cellräknare. För en enda cell Western blot analys, tillsätt en milliliter av utspädd enda cell suspension till en rehydrerad enda cell Western blot chip i botten av en 10 centimeter petriskål. Efter fem till 15 minuter, undersöka chip under Brightfield mikroskopi.Cirka 15 till 20% av mikro brunnarna bör upptas av en enda cell och färre än två procent av brunnarna bör innehålla två eller flera celler. Om chippet har laddats ordentligt, luta skålen 45 grader och tvätta chipet tre gånger med upphängningsbuffert för att avlägsna eventuella ej inkapturerade celler. Efter den sista tvätten, försiktigt och ladda chip i elektroforescellen i en enda cell Västra instrument, gel-sida upp, och täcka hela enda cellen Western blot chip med lys rinnande buffert.Initiera celllysen och kör instrumentet enligt lämpliga experimentparametrar. Vid slutet av körningen sköljer du chipet med två 10-minuterstvättar med färsk tvättbuffert per tvätt i rumstemperatur. Efter den andra tvätten, tillsätt 80 mikroliter av den primära antikroppslösningen av intresse för antikroppssondkammaren och sänk ner chipgel-sidan så att antikroppslösningen vekar över chipet.Efter två timmar i rumstemperatur, tvätta flisen tre gånger i tvättbuffert och en gång i vatten på en shaker. Inkubera chipet med en lämplig sekundär antikropp under en timme vid rumstemperatur skyddad från ljus. Vid slutet av inkubationen tvättar du chipet tre gånger med tvättbuffert och snurrar chipet på en glidspinnare för att avlägsna eventuell återstående tvättbuffert.Att strippa den enda cellen Western blot chip, placera en 15 milliliter rör rack i en 60 grader Celsius vattenbad med vattnet bara en centimeter ovanför racket. I en rökhuva, tillsätt 40 milliliter strippning buffert och 320 mikroliter beta morcepta etanol till en behållare. Placera chipet i en 10 centimeters petriskål inuti behållaren och försegla behållaren med Parafilm.Placera sedan behållaren inne i rörstället i vattenbadet. Efter 90 minuter, försiktigt överföra chipet till en ny petriskål och kort tvätta chip en gång med tvätt buffert innan du lägger 15 milliliter färsk tvätt buffert till petriskålen för en 15 minuters tvätt på shaker. I detta representativa experiment räknades de celler som rekryterades till varje plugg till en, tre och fem dagar efter injektionen.Genom att subtrahera cellantalet i de fordonsladdade pluggarna från cellantalet i MCP-1-lastade pluggarna beräknades sedan antalet celler som rekryterats specifikt som svar på cellgiftsmedlet. En accelererad MCP-1 specifik rekrytering och ackumulering av celler observerades under femdagarsperioden, med priser ökar från 31, 000 celler per dag efter en dag av injektion till upp till 136, 000 celler per dag, fem dagar efter injektion. Single cell Western blot analys användes sedan för att identifiera de olika celltyper rekryteras till källaren membran-härledda pluggar, enligt deras uttryck för specifika immun cell markörer av intresse.Till exempel var andelen monocyter inom MCP-1 lastade källaren membran-härledda gel pluggar låg på dag ett och nådde en topp på dag tre innan de sjunker igen på dag fem, medan makrofag siffrorna ökat stadigt under hela studieperioden. För MCP-1 laddade pluggar, andelen monocyter plus makrofager inom den isolerade cellen befolkningen var högst på dag tre, vilket tyder på att efter tre dagar, de allra flesta celler rekryteras av MCP-1 beroende chemotaxis var monocyter och makrofager. Även om det totala antalet monocyter plus makrofager är vanligtvis högre på dag fem jämfört med dag tre, cellen räkna på dag tre mer exakt återspeglar perifert blod av monocyt chemotaxis och rekrytering, och därför dag tre rekommenderas för källare membran-direkt plug analyser.Framgångsrikt förvärv av enstaka celler för nedströmsanalys beror på injektionens riktighet och det fullständiga avlägsnandet av pluggarna. Flödescytometri, encellig Western blotting, bulk eller encellig RNA-sekvensering och andra omikprocedurer kan användas för att bedöma de karakteristiska och fenotyper hos de rekryterade monocyt- och monocythärledda makrofagerna.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Aktivering och Mätning av NLRP3 inflamma aktivitet med användning av IL-1β i human monocyt-härledda dendritiska celler

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Kultur av makrofag kolonistimulerande faktor Differentierad Human Monocyte-härledda makrofager

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

Mätning Granulocyt och monocyt Fagocytos och Oxidativ Burst Aktivitet i humant blod

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Karakterisering av mänskliga monocythärledda dendritiska celler från Imaging Flow Cytometry: en jämförelse mellan två monocyt Isoleringsprotokoll

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Generation av mänskliga monocythärledda dendritiska celler från helblod

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate FcÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Receptor-mediated Phagocytosis

Användning av en monocyt Monolayer analys för att utvärdera Fcy-receptor-medierad fagocytos

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Analys av Microglia och monocyt-härledda makrofager från det centrala nervsystemet genom flödescytometri

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Kvantifiera mänskliga monocyt Chemotaxis In Vitro och murina lymfocyter Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Karakterisering av mänskliga monocyt delmängder av helblod Flow flödescytometri analys

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

In vitro-stimulering och visualisering av extracellulär fälla release i differentierade humana Monocyte-derived makrofager

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...