Name: generation of tumor organoids from genetically engineered mouse models of prostate cancer
Uploaded: 2019-06-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer at JoVE.com

يود المؤلفون أن يشكروا مختبر كالفين كو في جامعة ستانفورد على توفير خلايا HEK293 التي تم نقلها بشكل لا يُنقل بعد ة إما مع HA-mouse Noggin-Fc أو HA-mouse Rspo1-Fc. كما نود أن نشكر الدكتور دين تانغ على السماح لنا بالوصول إلى مجهر تشريح الفلورسنت في مختبره. وقد تم دعم هذا العمل من قبل CA179907 إلى D.W.G. من المعهد الوطني للسرطان. تم دعم الموارد المشتركة في مركز روزويل بارك الشامل للسرطان من قبل المعاهد الوطنية لدعم مركز السرطان الصحي CA016056.

تم تنفيذ الإجراءات الحيوانية الموصوفة هنا بموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في قسم الموارد الحيوانية المختبرية، مركز روزويل بارك الشامل للسرطان، بوفالو، نيويورك.
ملاحظة: الفئران الذكور التي سيتم تشريحها لعزل البروستاتا أو أورام البروستا?...

<ol>
	<li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altering+the+genome+by+homologous+recombination.">Altering the genome by homologous recombination.</a> Science. 244 (4910), 1288-1292 (1989).</li><li>Furth, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+control+of+gene+expression+in+transgenic+mice+by+a+tetracycline-responsive+promoter.">Temporal control of gene expression in transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (20), 9302-9306 (1994).</li><li>Aranda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+directionality+in+the+Cre-LoxP+site-specific+recombination+pathway.">Altered directionality in the Cre-LoxP site-specific recombination pathway.</a> Journal of Molecular Biology. 311 (3), 453-459 (2001).</li><li>Schwenk, F., Kuhn, R., Angrand, P. O., Rajewsky, K., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+and+spatially+regulated+somatic+mutagenesis+in+mice.">Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice.</a> Nucleic Acids Research. 26 (6), 1427-1432 (1998).</li><li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+mice.">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).</li><li>Goodrich, M. M., Talhouk, R., Zhang, X., Goodrich, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+approach+for+controlling+the+timing+and+order+of+engineered+mutations+in+mice.">An approach for controlling the timing and order of engineered mutations in mice.</a> Genesis. 56 (8), 23242 (2018).</li><li>Brocard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporally+controlled+site-specific+somatic+mutagenesis+in+the+mouse.">Spatio-temporally controlled site-specific somatic mutagenesis in the mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14559-14563 (1997).</li><li>Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+mouse+cancer+models:+a+maze+of+opportunities+and+challenges.">Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges.</a> Cell. 163 (1), 39-53 (2015).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2019.">Cancer statistics, 2019.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. , (2019).</li><li>Bluemn, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+Receptor+Pathway-Independent+Prostate+Cancer+Is+Sustained+through+FGF+Signaling.">Androgen Receptor Pathway-Independent Prostate Cancer Is Sustained through FGF Signaling.</a> Cancer Cell. 32 (4), 474-489 (2017).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+of+p53+and+Rb+deficiency+in+a+conditional+mouse+model+for+metastatic+prostate+cancer.">Synergy of p53 and Rb deficiency in a conditional mouse model for metastatic prostate cancer.</a> Cancer Research. 66 (16), 7889-7898 (2006).</li><li>Ku, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rb1+and+Trp53+cooperate+to+suppress+prostate+cancer+lineage+plasticity,+metastasis,+and+antiandrogen+resistance.">Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance.</a> Science. 355 (6320), 78-83 (2017).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions.">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+cancer+models+in+tumor+biology.">Spherical cancer models in tumor biology.</a> Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li><li>Oliveira, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+prostate:+a+basic+anatomical+and+histological+guideline.">The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline.</a> Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).</li><li>Callis, G., Sterchi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decalcification+of+Bone:+Literature+Review+and+Practical+Study+of+Various+Decalcifying+Agents,+Methods,+and+Their+Effects+on+Bone+Histology.">Decalcification of Bone: Literature Review and Practical Study of Various Decalcifying Agents, Methods, and Their Effects on Bone Histology.</a> The Journal of Histotechnology. (21), 49-58 (1998).</li><li>Dardenne, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Myc+Induces+an+EZH2-Mediated+Transcriptional+Program+Driving+Neuroendocrine+Prostate+Cancer.">N-Myc Induces an EZH2-Mediated Transcriptional Program Driving Neuroendocrine Prostate Cancer.</a> Cancer Cell. 30 (4), 563-577 (2016).</li><li>Blattner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPOP+Mutation+Drives+Prostate+Tumorigenesis+In+Vivo+through+Coordinate+Regulation+of+PI3K/mTOR+and+AR+Signaling.">SPOP Mutation Drives Prostate Tumorigenesis In Vivo through Coordinate Regulation of PI3K/mTOR and AR Signaling.</a> Cancer Cell. 31 (3), 436-451 (2017).</li><li>Agarwal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Different+Classes+of+Luminal+Progenitor+Cells+within+Prostate+Tumors.">Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors.</a> Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).</li></ol>

الخطوات الحاسمة ضمن بروتوكول تشريح أورام البروستاتا وتوليد الجهازية إزالة الأنسجة غير البروستاتا وتشريح غرامة من ورم البروستاتا الماوس أمر بالغ الأهمية للجيل الأمثل من الأعضاء السرطان ية منذ كل من الخلايا الظهارية غير البروستاتا والخلايا الظهارية البروستاتا الطبيعية سوف تو...

منذ أواخر الثمانينات، وقد تقدمت القدرة على تغيير الجينات عن طريق إعادة تركيب متجانسة إلى حد كبير دراسة النظم البيولوجية1. وقد تقدمت الدراسات الجينية من خلال تسهيل السيطرة على التعديلات الجينية من الناحيتين الزمنية والمكانية2و3، 4. وقد خلق الجمع بين هذه الاستراتيجيات الوراثيةمجموعة واسعة من أنظمة النماذج التجريبية 5،6،7.
نماذج الماوس المهندسة وراثيا (GEMMs) هي أداة متكاملة لتقييم كيفية تأثير الجينات الفردية أو مجموعات الجينات على نمو الثدييات والمرض. في أبحاث السرطان قبل السريرية، GEMMs هي الطريقة الأكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية وصارمة لدراسة تطور السرطان، والتقدم، والعلاج8. لدينا مختبر متخصص في توليد وتميز السرطان GEMMs.
السرطان غير الجلدي الأكثر تشخيصا ً بين الرجال في الولايات المتحدة هو سرطان البروستاتا (PCa). غالبية المرضى الذين يعانون من مرض PCa يعانون من مرض منخفض المخاطر واحتمال كبير للبقاء على قيد الحياة، ولكن معدلات البقاء على قيد الحياة تنخفض بشكل كبير عندما يتم تشخيص المرض في مراحل متقدمة أو إذا كان العلاج الهرموني المستهدف يحفز على التقدم إلى العدوانية، غير قابلة للشفاء PCa الأنواع الفرعية9،10. وقد وضعت مختبرنا GEMMs التي تستخدم الأليلات floxed من واحد أو أكثر من الجينات قمع الورم. إعادة تركيب وفقدان التعبير الجيني المثبط للورم يحدث على وجه التحديد في البروستاتا لأننا قد أدخلت transgene مع Cre recombinase المصب من المروج probasin تفعيلها فقط في الخلايا الظهارية البروستاتا11، 12.لقد ولدت أيضا لدينا GEMMs لاحتواء transgene مراسل كري دعا mT / mG، الذي يحفز الطماطم التعبير البروتين الفلورسنت في الخلايا التي تفتقر إلى Cre والأخضر بروتين الفلورسنت (GFP) التعبير في الخلايا مع كري13. في حين أن عرض هذه الطريقة ونتائجنا التمثيلية تظهر GEMMs ندرس في مختبرنا، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتوليد الأعضاء سرطان البروستاتا من أي نموذج الماوس. ومع ذلك، كما نوقش بالتفصيل في قسم النتائج التمثيلية لدينا، لاحظنا أن بعض خصائص الورم هي الأمثل لتوليد سرطان البروستاتا العضوية.
في العقد الماضي ، أدت أساليب جديدة لزراعة الخلايا من الأنسجة ذات المنشأ الظهاري إلى تقدم كبير في قدرتنا على نموذج أنظمة الأعضاء في المختبر14،15. وقد عُزي مصطلح "ثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد" إلى التقنيات التي ينطوي عليها إنشاء الأعضاء وصيانتها، والتي يمكن تعريفها عموماً بأنها هياكل تتكون من خلايا تجمع الهندسة المعمارية الثانوية التي تحركها سلالة الخلايا الخاصة بالأعضاء. 16. هذه الأساليب الجديدة تختلف عن الكلاسيكية 2D ثقافة الخلية في أن الخلايا لا تتطلب التحول أو الخلود للنمو على المدى الطويل. وهكذا، يمكن مقارنة الثقافات 3D من الخلايا الطبيعية إلى الخلايا المريضة. وهذا أمر ذو قيمة خاصة في أبحاث السرطان حيث الثقافات العادية للسيطرة على الخلايا عادة لم تكن متاحة. وبالإضافة إلى ذلك، تشكل الأعضاء تلقائيا الأنسجة الثانوية مع أنواع الخلايا المتمايزة بشكل مناسب، مما يجعلها أفضل نظام نموذج لفهم السرطان في المختبر من خطوط الخلايا 2D17. وقد أنشأ مختبرنا خطوط عضوية ثلاثية الدنابية من قضية الورم معزولة عن نظام PCa GEMMs لدينا لاستكمال بياناتنا في الجسم الحي وإجراء التجارب التي لن تكون مجدية في GEMMs.
في هذه المقالة، نقدم بروتوكولات مكتوبة ومرئية للنخر الكامل من GEMMs PCa، بما في ذلك تشريح فصوص البروستاتا الماوس متميزة والآفات النقيلية. نحن نصف ونظهر طريقة خطوة بخطوة لتوليد الأوجانات من أورام البروستاتا الماوس على أساس بروتوكول نشر سابقا من قبل Drost وآخرون لاشتقاق اتوجينيات من الأنسجة الظهارية البروستاتا الماوس العادي18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:680px;" width="680">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">0.25 % Trypsin+2.21 mM EDTA</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-053</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">1 1/4 in, 23 gauge, disposable syringe needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">Z192430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">10 % neutral buffered formalin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">32 % paraformaldehyde</td>
			<td style="width:177px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">A83-01</td>
			<td style="width:177px;">MedChemExpress</td>
			<td style="width:119px;">HY-10432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Advanced DMEM/F12+++</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Analytical balance</td>
			<td style="width:177px;">Mettler Toledo</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30216623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">B27 (50X)</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Collagenase II</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Dissecting Board</td>
			<td style="width:177px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">36-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:217px;">EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10</td>
			<td style="width:177px;">Manufactured by Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory</td>
			<td style="width:167px;">Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">human recombinant Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:177px;">PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">N-Acetyl-L-Cysteine</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Precision balance</td>
			<td style="width:177px;">Mettler Toledo</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30216561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Scalpel #23</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">504176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Scalpel Handle #7, 16 cm</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">500238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Single-edge carbon razor blade</td>
			<td style="width:177px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">504489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Y-276632 (Rock Inhibitor)</td>
			<td style="width:177px;">APExBIO</td>
			<td style="width:119px;">A3008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of tumor organoids from genetically engineered mouse models of prostate cancer

وقد أدت الأساليب القائمة على إعادة التركيب المتجانس لتعديل الجينات إلى تعزيز البحوث البيولوجية إلى حد كبير. نماذج الماوس المهندسة وراثيا (GEMMs) هي طريقة صارمة لدراسة تطور الثدييات والمرض. وقد طور مختبرنا العديد من GEMMs من سرطان البروستاتا (PCa) التي تفتقر إلى التعبير عن واحد أو عدة جينات قمع الورم باستخدام موقع محدد Cre-loxP نظام إعادة الكومبوماومر والمروج البروستاتا محددة. في هذه المقالة، ونحن نصف طريقتنا لnecropsy من هذه GEMMs PCa، مع التركيز في المقام الأول على تشريح أورام البروستاتا الماوس. وقد سهلت الأساليب الجديدة التي تم تطويرها على مدى العقد الماضي ثقافة الخلايا المستمدة من الظهارة إلى نموذج أنظمة الأعضاء في المختبر في ثلاثة أبعاد. كما نقوم بتفصيل طريقة زراعة الخلايا ثلاثية الدنابية لتوليد أعضاء الورم من الماوس PCa GEMMs. وقد هيمنت أبحاث السرطان قبل السريرية من قبل ثقافة الخلايا 2D ونماذج xenograft المستمدة من خط الخلية أو المريض المستمدة. هذه الطرق تفتقر إلى البيئة الدقيقة الورم، والحد من استخدام هذه التقنيات في الدراسات ما قبل السريرية. GEMMs هي أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية لفهم الأورام وتطور السرطان. ثقافة الجهاز الورم هو نظام نموذج في المختبر الذي يلخص الهندسة المعمارية الورم وخصائص سلالة الخلية. وبالإضافة إلى ذلك، تسمح أساليب زراعة الخلايا ثلاثية الدمن بنمو الخلايا الطبيعية للمقارنة مع ثقافات الخلايا السرطانية، ونادراً ما يكون ذلك ممكناً باستخدام تقنيات زراعة الخلايا ثلاثية الد. في تركيبة، استخدام GEMMs وثقافة الخلايا ثلاثية الد في الدراسات ما قبل السريرية لديه القدرة على تحسين فهمنا لبيولوجيا السرطان.

تظهر في الشكل 2Aصور المحاصيل التمثيلية للفأر مع ورم البروستاتا الأولي الكبير المملوء بالسوائل في منطقة البروستاتا الأمامية . وعلى النقيض من ذلك، يظهر الشكل 2B، صور ًا تمثيلية للفأر مع ورم كبير قوي في البروستاتا لا يمكن تمييزه من مناطق البر...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer at JoVE.com

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

نعرض طريقة لتشريح وتشريح نماذج سرطان البروستاتا الماوس، مع التركيز على تشريح ورم البروستاتا. كما يتم تقديم بروتوكول خطوة بخطوة لتوليد الأعضاء ورم البروستاتا الماوس.

جيل من الأعضاء الورم من نماذج الماوس المهندسة وراثيا من سرطان البروستاتا

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

الثقافات الماوس organoid تشبه بشكل أوثق في منظمة خلية الجسم الحي من الثقافات الخلية التقليدية. في أبحاث السرطان, العضيات نموذج الورم الأصلي أفضل من خطوط الخلايا 2D ويمكن استخدامها لاختبار علاجات السرطان المحتملة في المختبر لتطوير علاجات المخدرات الجديدة. لاستخراج كتلة من الذكور الماوس الجهاز البولي التناسلي فهم وسادة الدهون على جانبي المثانة وسحب صعودا لفضح الخصية.تشريح بعناية كل الخصية بعيدا عن بقية المنطقة البولية التناسلية. رفع بلطف المثانة بحيث يتم رفع المنطقة البولي التناسلية معا، مما يعرض مجرى البول تحتها. أثناء الإمساك بالمثانة، وجه المقص ضد الجانب السفلي من البروستاتا الظهرية لـ incise مجرى البول.سيتم إطلاق منطقة البولي التناسلي بأكملها من تجويف البطن. بعد إزالة الجهاز البولي التناسلي، سيتم تعريض العقد اللمفاوية الحوضية المتمركزة مباشرة خلف الجهاز البولي التناسلي وعلى جانبي العمود الفقري. لإزالة الغدد الليمفاوية الملمية المزالط المستقيمة تحت النسيج الليمفاوي وسحب ما يصل.بعد ذلك ، فهم المستقيم مع ملقط مستقيم وقطع ، وسحب ما يصل على المستقيم لكشف القولون كله والأمعاء الدقيقة للبحث عن الآفات النقيلي في العقد الليمفاوية mesenteric. عندما تم إزالة ilium كامل الاستمرار في سحب على الاثنيع لفضح المعدة. قطع المريء لإزالة المعدة تماما.إذا لوحظ أي آفات النقيلي في العقد الليمفاوية، تشريح بعناية هذه العقد بعيدا عن الأمعاء لتخزين في برنامج تلفزيوني. عندما تمت إزالة المعدة ، يمكن حصاد الطحال من الجانب الظهري من البطن للتخزين في 4 ٪ شبهفورمالدهيد. إزالة الكبد لتخزين في برنامج تلفزيوني.إزالة الكلى من جانبي العمود الفقري جنبا إلى جنب مع أي الغدد الليمفاوية الكلوية التي تحتوي على الآفات النقيلي. لفضح تجويف الصدر قطع بعناية الحجاب الحاجز على طول القفص الصدري. الضغط السلبي الذي يتم إطلاقه داخل تجويف الصدر سوف يعرض القلب والرئتين.سحب ما يصل على القص لفتح تجويف الصدر كذلك. مسح الوجه البطني للتجويف الصدري على طول القفص الصدري بحثا عن الآفات النقيلي في الغدد الليمفاوية الصدرية للتشريح إذا كان موجودا. بينما لا يزال عقد القص، وقطع بعيدا القفص الصدري البطني للوصول إلى القلب والرئتين وسحب ما يصل على القلب لقطع تحت الرئتين.لإزالة القلب والرئتين في كتلة قطع كل من الأوعية الدموية الأمامية في القصبة الهوائية. نقل القلب بعناية دون إتلاف أنسجة الرئة أو الآفات النقيلي الرئة في حاوية من برنامج تلفزيوني. لتشريح ورم البروستاتا مكان المنطقة البولية التناسلية تحت مجهر تشريح.استخدم زوجًا من ملقط مستقيم وزوج من ملقط منحنية لقلب منطقة البولي التناسلية على سطحها الظهري. حدد موقع منطقة البروستاتا القريبة التي يمكن تحديدها بواسطة اللون الوردي والأحمر من مجرى البول. فهم مجرى البول بقوة للسماح للتلاعب في الأنسجة البولي التناسلية مع ملقط المنحني.حدد موقع قاعدة من الـ(هينيولات) للسماح بإزالتها بعناية ثم استخدام الجانب المنحني من ملقط لإزالة المزهريات والأنسجة الدهنية والزام أكبر قدر ممكن. في حين لا يزال عقد بحزم في منطقة مجرى البول والبروستاتا القريبة، واستخدام زوج من مقص مدبب غرامة لإزالة المثانة من مجرى البول.عقد منطقة البروستاتا القريبة ومجرى البول بقوة مع ملقط على التوالي فهم منطقة البروستاتا الأمامية مع الجانب المنحني من ملقط لسحب بحزم الأنسجة بعيدا عن المثانة وبقية البروستاتا. ضع أنسجة البروستاتا الأمامية في PBS وحدد موقع منطقة البروستاتا البطنية. إزالة منطقة البروستاتا البطنية بنفس الطريقة.إذا كان يمكن تمييز المنطقة الجانبية عن المنطقة الظهرية إزالة منطقة البروستاتا الجانبية على كلا الجانبين. ثم إزالة منطقة البروستاتا الظهرية ووضع منطقة البروستاتا القريبة في 4٪ شبهformaldehyde. بعد الرامز ، ضع قطع الورم في أنبوب 15 ملليلتر من عازلة الهضم لعملية الهضم من ساعة ونصف إلى ساعتين في 37 درجة مئوية.في نهاية عملية الهضم، رواسب الأنسجة المهضمة عن طريق الطرد المركزي والتخلص من اهب. نفض الغبار الأنبوب لتخفيف بيليه الخلية. Resuspend الخلايا في ملليلتر واحد من التربسين قبل الدافئة تكملها 10 ميكرومولار Y-27632 روك المانع لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية.في نهاية الحضانة إعادة تثاؤب الأنسجة خمس مرات مع تلميح P1000 ماصة القياسية. العودة أنبوب إلى حمام الماء لمدة خمس دقائق إضافية الحضانة والتثاب. لطلاء قبة مصفوفة غسل الخلايا المهضوضة في تسعة ملليلتر من المتوسط البارد، ثم جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.إعادة تثبيت الخلايا في ملليلتر واحد من المتوسطة الطازجة للعد. وبعد العد، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي مرة أخرى. تمييع الخلايا السرطانية في الحجم المناسب من المصفوفة.إسقاط بعناية 200 ميكرولترات من حل الخلية مصفوفة في كل بئر من 55 درجة مئوية درجة حرارة ستة بئر لوحة. السماح للقباب لترسيخ في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين قبل وضع لوحة رأسا على عقب في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. عندما تكون القباب قد توطدت تماما إضافة ملليلتر اثنين من وسط البروستاتا organoid تكملة مع الاندروجين R1881 ومثبط روك لكل بئر.إعادة لوحة إلى الحاضنة ثقافة الخلية. تكشف صور تشريح الفلورسنت عن البروتين الفلوري الأخضر، أو تعبير GFP، عن طريق أورام البروستاتا الصلبة، مما يشير إلى أن الخلايا السرطانية تعبر عن Cre. الكبد والرئتين من نفس الحيوان المعرض الأورام النقيلي التعبير عن GFP مما يدل على أن هذه الأورام نشأت من ورم البروستاتا الأولية.العقدة الليمفاوية الحوض من هذا الماوس يعبر عن GFP وليس الطماطم، مشيرا إلى أن هذا الورم النقيلي قد تجاوزت العقدة الليمفاوية ولا يبقى أي أنسجة طبيعية. في اليوم واحد من العضيات الصغيرة ولدت من ورم البروستاتا الصلبة تبدأ في تشكيل مع كل من الطماطم والخلايا التي تعبر عن GFP الموجودة في ثقافة الورم الجهاز. بحلول اليوم السابع وما بعده عندما تكون الأورام العضوية في البروستاتا قد تشكلت بالكامل ومع ذلك ، فإن الأعضاء تعبر عن GFP ، ولكن ليس الطماطم ، مما يشير إلى أن الأعضاء قد نشأت من الخلايا السرطانية الصريحة وليس من الخلايا الظهارية العادية.في اليوم الأول من ثقافة الأعضاء الصغيرة التي تم إنشاؤها من ورم البروستاتا المليئة بالسوائل على حد سواء الطماطم والخلايا المعبرة عن GFP موجودة داخل الثقافة العضوية. Organoids من أورام البروستاتا مملوءة بالسوائل تعبر عن أي من GFP أو الطماطم في اليوم السابع وما بعده ومع ذلك ، مشيرا إلى أن الأعضاء تشكلت من الخلايا التي لا تعبر عن Cre. للبقاء موجهة عند حصاد أنسجة البروستاتا، تكون على بينة من المثانة ومزهاء البول في جميع الأوقات.بعد جيلهم يمكن استخدام الأعضاء في تطبيقات التصوير وتحليل البيولوجيا الجزيئية وشاشات الأدوية.

Research

JoVE Journal

Genetics

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

جيل من الكروماتين الأصلية إيمونوبريسيبيتيشن تسلسل المكتبات لتحليل كثافة نوكليوسومي

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

جيل من الكروماتين على نطاق الجينوم تكيف التقاط المكتبات من الأجنة المورفولوجية محكم نظموا في وقت مبكر

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

متزامنة الفيديو-EEG-ECG الرصد لتحديد الخلل نيوروكاردياك في نماذج الماوس من الصرع

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

تحديد الأحداث جزئ مثلى في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس باستخدام النشاف الجنوبي وتفاعل البوليميراز المتسلسل

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

جيل من سرطان الخلية استنساخ لتصور تيلوميريك التي تحتوي على تكرار الحمض النووي الريبي تيرا أعرب من Telomere واحدة في الخلايا الحية

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

زرع داخل البطين من السلائف العصبية المهندسة لدراسات الهندسة العصبية في الجسم الحي

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein بوساطة تحرير الجينات الدقيقة عن طريق أنبوب الكهربائي

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

استخدام الخلايا السرطانية الثديية الماوس في مختبر الغزو الاختباري كمقياس لسلوك الخلايا الأنكجينية

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level

الجيش النيبالي الجديد الجيل التالي التسلسل وخط أنابيب المعلوماتية الحيوية لتحديد خط التعبير-1s في مستوي محدد الموضع

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and ...