Name: generation of tumor organoids from genetically engineered mouse models of prostate cancer
Uploaded: 2019-06-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Calvin Kuo Laboratory på Stanford University for at levere HEK293 celler stabilt transficeret med enten ha-Mouse Noggin-FC eller ha-Mouse Rspo1-FC. Vi vil også gerne takke Dr. Dean tang for at give os adgang til fluorescerende dissektion mikroskop i hans laboratorium. Dette arbejde blev støttet af CA179907 til D.W.G. fra National Cancer Institute. Delte ressourcer på Roswell Park Comprehensive Cancer Center blev støttet af nationale institutter for Health Cancer Center support Grant CA016056.

De dyre procedurer, der er beskrevet her, blev udført med godkendelse af Udvalget for institutionel dyrepleje og-anvendelse (IACUC) på Institut for Laboratoriedyrs ressourcer, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, New York.
Bemærk: Mandlige mus, der skal dissekeres for at isolere prostater eller prostata tumorer til generation af organoider bør have mindst nået en alder af seksuel modenhed — omkring 8-10 uger af alder. Specifikke aldre af mus kan variere bl...

<ol>
	<li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altering+the+genome+by+homologous+recombination.">Altering the genome by homologous recombination.</a> Science. 244 (4910), 1288-1292 (1989).</li><li>Furth, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+control+of+gene+expression+in+transgenic+mice+by+a+tetracycline-responsive+promoter.">Temporal control of gene expression in transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (20), 9302-9306 (1994).</li><li>Aranda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+directionality+in+the+Cre-LoxP+site-specific+recombination+pathway.">Altered directionality in the Cre-LoxP site-specific recombination pathway.</a> Journal of Molecular Biology. 311 (3), 453-459 (2001).</li><li>Schwenk, F., Kuhn, R., Angrand, P. O., Rajewsky, K., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+and+spatially+regulated+somatic+mutagenesis+in+mice.">Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice.</a> Nucleic Acids Research. 26 (6), 1427-1432 (1998).</li><li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+mice.">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).</li><li>Goodrich, M. M., Talhouk, R., Zhang, X., Goodrich, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+approach+for+controlling+the+timing+and+order+of+engineered+mutations+in+mice.">An approach for controlling the timing and order of engineered mutations in mice.</a> Genesis. 56 (8), 23242 (2018).</li><li>Brocard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporally+controlled+site-specific+somatic+mutagenesis+in+the+mouse.">Spatio-temporally controlled site-specific somatic mutagenesis in the mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14559-14563 (1997).</li><li>Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+mouse+cancer+models:+a+maze+of+opportunities+and+challenges.">Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges.</a> Cell. 163 (1), 39-53 (2015).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2019.">Cancer statistics, 2019.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. , (2019).</li><li>Bluemn, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+Receptor+Pathway-Independent+Prostate+Cancer+Is+Sustained+through+FGF+Signaling.">Androgen Receptor Pathway-Independent Prostate Cancer Is Sustained through FGF Signaling.</a> Cancer Cell. 32 (4), 474-489 (2017).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+of+p53+and+Rb+deficiency+in+a+conditional+mouse+model+for+metastatic+prostate+cancer.">Synergy of p53 and Rb deficiency in a conditional mouse model for metastatic prostate cancer.</a> Cancer Research. 66 (16), 7889-7898 (2006).</li><li>Ku, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rb1+and+Trp53+cooperate+to+suppress+prostate+cancer+lineage+plasticity,+metastasis,+and+antiandrogen+resistance.">Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance.</a> Science. 355 (6320), 78-83 (2017).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions.">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+cancer+models+in+tumor+biology.">Spherical cancer models in tumor biology.</a> Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li><li>Oliveira, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+prostate:+a+basic+anatomical+and+histological+guideline.">The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline.</a> Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).</li><li>Callis, G., Sterchi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decalcification+of+Bone:+Literature+Review+and+Practical+Study+of+Various+Decalcifying+Agents,+Methods,+and+Their+Effects+on+Bone+Histology.">Decalcification of Bone: Literature Review and Practical Study of Various Decalcifying Agents, Methods, and Their Effects on Bone Histology.</a> The Journal of Histotechnology. (21), 49-58 (1998).</li><li>Dardenne, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Myc+Induces+an+EZH2-Mediated+Transcriptional+Program+Driving+Neuroendocrine+Prostate+Cancer.">N-Myc Induces an EZH2-Mediated Transcriptional Program Driving Neuroendocrine Prostate Cancer.</a> Cancer Cell. 30 (4), 563-577 (2016).</li><li>Blattner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPOP+Mutation+Drives+Prostate+Tumorigenesis+In+Vivo+through+Coordinate+Regulation+of+PI3K/mTOR+and+AR+Signaling.">SPOP Mutation Drives Prostate Tumorigenesis In Vivo through Coordinate Regulation of PI3K/mTOR and AR Signaling.</a> Cancer Cell. 31 (3), 436-451 (2017).</li><li>Agarwal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Different+Classes+of+Luminal+Progenitor+Cells+within+Prostate+Tumors.">Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors.</a> Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).</li></ol>

Kritiske trin i protokollen for prostata tumor dissektion og organoid generation Fjernelse af ikke-prostata væv og fine dissektion af musen prostata tumor er afgørende for den optimale generation af kræft organoider, da både ikke-prostata epiteliale celler og normale prostata epitelceller vil generere organoider. For solide prostata tumorer specifikt, det er afgørende at isolere områder af levedygtig tumor til at fjerne forurening med nekrotisk væv, der ville reducere antallet af levedygtige ce...

Siden slutningen af 1980 ' erne, evnen til at ændre gener ved homologe rekombination har i høj grad fremskreden studiet af biologiske systemer1. Inducerbare, vævs-eller celle specifikke promotor-systemer og site-specifikke rekombinaser, såsom CRE-loxp, har avancerede genetiske undersøgelser ved at lette kontrollen med genetiske modifikationer både timeligt og rumligt2,3, 4. Kombinationen af disse genetiske strategier har skabt en bred vifte af eksperimentelle modelsystemer5,6,7.
Genetisk modificerede musemodeller (Gemm'er) er et integreret redskab til at vurdere, hvordan individuelle gener eller grupper af gener påvirker pattedyrs udvikling og sygdom. I præ-klinisk kræftforskning, GEMMs er den mest fysiologisk-relevant og stringent metode til at studere kræft udvikling, progression, og behandling8. Vores laboratorium har specialiseret sig i at generere og karakterisere kræft GEMMs.
Den mest højt diagnosticerede ikke-kutane kræft blandt mænd i USA er prostatacancer (PCa). Størstedelen af patienterne med PCa har lav-risiko sygdom og høj sandsynlighed for overlevelse, men overlevelsesraten falder drastisk, når sygdommen diagnosticeres på avancerede stadier, eller hvis målrettet hormonel terapi inducerer progression til aggressive, ikke-helbredelig PCa undertyper9,10. Vores laboratorium har udviklet gemmer, der udnytter floxed alleler af en eller flere tumor suppressor gener. Rekombination og tab af tumor suppressor genekspression forekommer specifikt i prostata, fordi vi har introduceret et Trans gen med CRE rekombinase nedstrøms for probasin promotoren aktiveret kun i prostata epiteliale celler11, 12. vi har også opdrættet vores gemmer til at indeholde en CRE reporter transgen kaldet MT/mG, som inducerer tomat fluorescerende protein udtryk i celler, der mangler CRE og grønt fluorescerende protein (gfp) udtryk i celler med CRE13. Mens præsentationen af denne metode og vores repræsentative resultater viser GEMMs vi studere i vores laboratorium, denne protokol kan bruges til at generere prostatacancer organoider fra enhver musemodel. Men, som diskuteret i detaljer i vores repræsentative resultater sektion, vi har observeret, at visse tumorkarakteristika er optimale for prostatacancer organoid generation.
I det sidste årti har nye metoder til dyrkning af celler fra væv af epitelial oprindelse ført til betydelige fremskridt i vores evne til at modellere orgel systemer in vitro14,15. Udtrykket "3D-cellekultur" er blevet tilskrevet de teknikker, der er involveret i etablering og vedligeholdelse af organoider, som generelt kan defineres som strukturer, der består af celler, som samler sekundær arkitektur drevet af organspecifik cellelinje Karakteristik16. Disse nye metoder adskiller sig fra klassisk 2D-cellekultur i, at cellerne ikke kræver transformation eller immortalization for langsigtet vækst; således kan 3D-kulturer af normale celler sammenlignes med syge celler. Dette er især værdifuldt i kræftforskning, hvor normale celle kontrol kulturer har typisk ikke været tilgængelige. Desuden danner organoider spontant sekundære vævs arkitekturer med passende differentierede celletyper, hvilket gør dem til et bedre model system til at forstå kræft in vitro end 2D cellelinjer17. Vores laboratorium har skabt 3D organoid linjer fra tumor problem isoleret fra vores PCa GEMMs at supplere vores in vivo data og udføre eksperimenter, som ikke ville være muligt i GEMMs.
I denne artikel præsenterer vi skriftlige og visuelle protokoller for den komplette nekropsy af PCa GEMMs, herunder dissektion af forskellige mus prostata lapper og metastatiske læsioner. Vi beskriver og viser en trin-for-trin metode til generering af organoider fra mus prostata tumorer baseret på en protokol, der tidligere blev offentliggjort af Drost et al. for at udlede organoider fra normal mus prostata epitelial væv18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:680px;" width="680">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">0.25 % Trypsin+2.21 mM EDTA</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-053</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">1 1/4 in, 23 gauge, disposable syringe needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">Z192430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">10 % neutral buffered formalin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">32 % paraformaldehyde</td>
			<td style="width:177px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">A83-01</td>
			<td style="width:177px;">MedChemExpress</td>
			<td style="width:119px;">HY-10432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Advanced DMEM/F12+++</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Analytical balance</td>
			<td style="width:177px;">Mettler Toledo</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30216623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">B27 (50X)</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Collagenase II</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Dissecting Board</td>
			<td style="width:177px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">36-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:217px;">EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10</td>
			<td style="width:177px;">Manufactured by Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory</td>
			<td style="width:167px;">Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">human recombinant Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:177px;">PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">N-Acetyl-L-Cysteine</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Precision balance</td>
			<td style="width:177px;">Mettler Toledo</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30216561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Scalpel #23</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">504176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Scalpel Handle #7, 16 cm</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">500238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Single-edge carbon razor blade</td>
			<td style="width:177px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">504489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Y-276632 (Rock Inhibitor)</td>
			<td style="width:177px;">APExBIO</td>
			<td style="width:119px;">A3008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of tumor organoids from genetically engineered mouse models of prostate cancer

Metoder baseret på homologe rekombination til at ændre gener har væsentligt fremmet biologisk forskning. Gensplejsede musemodeller (Gemm'er) er en stringent metode til at studere mammalan udvikling og sygdom. Vores laboratorium har udviklet flere gemmer af prostatacancer (PCa), der mangler udtryk for en eller flere tumor suppressor gener ved hjælp af den site-specifikke CRE-loxP rekombinase system og en prostata-specifik promotor. I denne artikel beskriver vi vores metode til nekropsy af disse PCa GEMMs, primært med fokus på dissektion af mus prostata tumorer. Nye metoder udviklet i løbet af de sidste ti år har lettet kulturen af epiteliale-afledte celler til model orgel systemer in vitro i tre dimensioner. Vi også detaljer en 3D cellekultur metode til at generere tumor organoider fra mus PCa GEMMs. Præklinisk kræftforskning har været domineret af 2D cellekultur og celle line-afledte eller patient-afledte xenograft modeller. Disse metoder mangler tumor mikromiljø, en begrænsning af brugen af disse teknikker i præ-kliniske undersøgelser. Gemmer er mere fysiologisk relevante for forståelsen af tumor og cancer progression. Tumor organoid kultur er en in vitro model system, der rekapitulerer tumor arkitektur og celle Lineage egenskaber. Desuden, 3D cellekultur metoder giver mulighed for vækst af normale celler til sammenligning med tumor cellekulturer, sjældent muligt ved hjælp af 2D cellekultur teknikker. I kombination, brug af gemmer og 3D cellekultur i præ-kliniske undersøgelser har potentiale til at forbedre vores forståelse af kræft biologi.

Repræsentative nekropsy billeder af en mus med en stor væskefyldt primær prostata tumor i den forreste prostata region er vist i figur 2a. I modsætning hertil, figur 2B, viser repræsentative nekropsy billeder af en mus med en stor solid primær prostata tumor, som individuelle prostata regioner er umulig at skelne. Fluorescerende dissektion billeder viser den samme solide prostata tumor fra figur 2</str...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer at JoVE.com

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Vi viser en metode til nekropsy og dissektion af mus prostatacancer modeller, med fokus på prostata tumor dissektion. En trin-for-trin protokol til generering af mus prostata tumor organoider er også præsenteret.

Generation af tumor Organoider fra genetisk manipulerede musemodeller af prostata cancer

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

Mus organoid kulturer mere ligner in vivo celle organisation end traditionelle cellekulturer. I kræftforskning, organoids model den oprindelige tumor bedre end 2D-celle linjer og kan bruges til at teste potentielle kræftbehandlinger in vitro at udvikle nye lægemiddelbehandlinger. For en bloc udvinding af den mandlige mus urogenital system gribe fedt pad på hver side af blæren og trække opad for at udsætte testikel.Disseker forsigtigt hver testikel væk fra resten af den urogenitale region. Løft forsigtigt blæren, så den urogenitale region er forhøjet sammen, udsætter urinrøret nedenunder. Mens du holder blæren, orientere saks mod undersiden af dorsale prostata at indskube urinrøret.Hele urogenital regionen vil blive frigivet fra bughulen. Efter fjernelse af urogenital systemet, bækken lymfeknuder placeret umiddelbart bag det urogenitale system og på hver side af rygsøjlen vil blive udsat. For at fjerne lymfeknuder orientere lige snævler under lymfevæv og trække op.Dernæst gribe endetarmen med lige stænde og skære, trække op på endetarmen for at optrævle hele tyktarmen og tyndtarmen til at lede efter metastatiske læsioner i mesenteric lymfeknuder. Når hele ilium er blevet fjernet fortsætte med at trække på duodenum at udsætte maven. Skær spiserøret til helt at fjerne maven.Hvis der observeres metastatiske læsioner i lymfeknuderne, dissekerer forsigtigt disse nikder væk fra tarmen til opbevaring i PBS. Når maven er fjernet, milten kan høstes fra dorsale side af maven til opbevaring i 4% paraformaldehyd. Fjern leveren til opbevaring i PBS.Fjern nyrerne fra begge sider af rygsøjlen sammen med eventuelle nyrelymfeknuder, der indeholder metastatiske læsioner. At udsætte brysthulen omhyggeligt skære mellemgulvet langs brystkassen. Det undertryk, der frigives i brysthulen, vil udsætte hjertet og lungerne.Træk op på brystbenet for at åbne brysthulen yderligere. Scan brysthulens ventrale ansigt langs brystkassen for metastatiske læsioner i thoraxlymfeknuderne til dissektion, hvis de findes. Mens du stadig holder brystbenet, skæres væk ventrale brystkassen for at få adgang til hjertet og lungerne og trække op på hjertet til at skære under lungerne.For fuldt ud at fjerne hjertet og lungerne en bloc skære alle de forreste blodkar i luftrøret. Overfør forsigtigt hjertet uden at beskadige lungevævet eller lungemetastik læsionerne i en beholder med PBS. Til dissektion af prostata tumor sted urogenital regionen under en dissektion mikroskop.Brug et par lige kraftbefængte og et par buede kraftbefængte til at vende den urogenitale region på dens dorsale overflade. Find den proksimale prostata region, der kan identificeres ved den lyserøde-røde farve urinrøret. Tag godt fat i urinrøret for at tillade manipulation af det urogenitale væv med de buede stænt.Find bunden af sædsjegene for at tillade deres omhyggelig fjernelse. Brug derefter den buede side af skrænt til at fjerne vas deferens og så meget fedt og bindevæv som muligt. Mens du stadig fast holder urinrøret og proksimale prostata region, bruge et par fine spidse saks til at fjerne blæren fra urinrøret.Holding den proksimale prostata region og urinrøret fast med lige scet gribe den forreste prostata region med den buede side af scef'et til fast trække vævet væk fra blæren og resten af prostata. Placer forreste prostata væv i PBS og finde ventral prostata region. Fjern den ventrale prostata region på samme måde.Hvis den laterale region kan skelnes fra den dorsale region fjerne lateral prostata region på begge sider. Fjern derefter den dorsale prostata region og placere proksimale prostata region i 4% paraformaldehyd. Efter hakning, placere tumor stykker i en 15-milliliter rør af fordøjelsen buffer for en halvanden til to timers fordøjelse ved 37 grader Celsius.Ved afslutningen af fordøjelsen sedimenteres det fordøjede væv ved centrifugering, og supernatanten kasseres. Svirp røret for at løsne cellepellet. Resuspend cellerne i en milliliter forvarmet trypsin suppleret med 10 mikromolar Y-27632 ROCK-hæmmer i fem minutter ved 37 grader Celsius.Ved slutningen af inkubationen triturere vævsslamten fem gange med en standard P1000 pipettespids. Returnering af røret i vandbadet i yderligere fem minutters inkubation og trituration. For matrix dome plating vaske fordøjet celler i ni milliliter koldt medium, derefter indsamle cellerne ved centrifugering.Resuspend cellerne i en milliliter frisk medium til optælling. Og efter optælling, indsamle cellerne ved centrifugering igen. Tumorcellerne fortyndes i den relevante matrixmængde.Drop forsigtigt 200 mikroliter matrixcelleopløsning i hver brønd på 55 grader Celsius opvarmet seks-brønd plade. Lad kuplerne størkne ved stuetemperatur i to minutter, før pladen sættes på hovedet i en 37 grader Celsius inkubator i 20 minutter. Når kuplerne har fuldt størknet tilføje to milliliter prostata organoid medium suppleret med androgen R1881 og ROCK-hæmmer til hver brønd.Returner pladen til cellekulturinkubatoren. Fluorescerende dissektion billeder afslører grønne fluorescerende protein, eller GFP udtryk, ved fast prostata tumorer, hvilket indikerer, at tumorcellerne udtrykker Cre. Leveren og lungerne fra samme dyr udviser metastatiske tumorer, der udtrykker GFP, der viser, at disse tumorer stammer fra den primære prostatatumor.Bækkenlymfeknuden fra denne mus udtrykker GFP og ikke Tomat, hvilket indikerer, at denne metastatiske tumor har overhalet lymfeknuden og ingen normale væv tilbage. På dag et af kultur små organoids genereret fra en solid prostata tumor begynder at danne med både Tomat og GFP-udtryk celler til stede i tumor organoid kultur. Ved dag syv og videre, når prostata tumor organoids har fuldt dannet dog, organoider udtrykke GFP, men ikke Tomat, tyder på, at organoider stammer fra Cre-udtrykke tumorceller og ikke fra normale epitelceller.På dag et af kultur af små organoids genereret fra væskefyldt prostata tumor både Tomat og GFP-udtryk celler er til stede i organoid kultur. Organoider fra væskefyldte prostatatumorer udtrykker enten GFP eller Tomat på dag syv og videre, hvilket indikerer, at de organoider dannet af celler, der ikke udtrykker Cre. At holde sig orienteret, når høst prostata væv, være opmærksom på blæren og urinrøret positioner på alle tidspunkter.Efter deres generation kan organoiderne bruges i billeddannelsesapplikationer, molekylærbiologianalyse og lægemiddelskærme.

Research

JoVE Journal

Genetics

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generation af indfødte kromatin Immunoprecipitation sekventering biblioteker for Nucleosome tæthed analyse

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation af Genome-wide kromatin kropsbygning Capture biblioteker fra stramt iscenesatte tidlige Drosophila embryoner

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

Samtidige Video-EEG-EKG overvågning for at identificere Neurocardiac dysfunktion i musemodeller af epilepsi

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identifikation af homologe rekombination begivenheder i mus embryonale stamceller ved hjælp af det sydlige Blotting og Polymerase kædereaktion

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Generation af kræft celle kloner til at visualisere Telomeric Repeat-holdige RNA TERRA udtrykt fra en enkelt Telomer i levende celler

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Intraventrikulær transplantation af konstruerede neuronal prækursorer til in vivo Neuroarchitecture studier

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-medieret præcis Genredigering ved Rørelektroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

Brugen af mus mammary tumor celler i en in vitro invasion analyse som et mål for Oncogenic celle adfærd

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level

RNA Next-generations sekvensering og en Bioinformatik pipeline til identificering af udtrykte linje-1s på det locus-specifikke niveau

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and ...