Name: generation of tumor organoids from genetically engineered mouse models of prostate cancer
Uploaded: 2019-06-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer at JoVE.com

De auteurs danken het Calvin Kuo-laboratorium aan de Stanford-Universiteit voor het feit dat HEK293 cellen stabiel zijn getransventeerd met HA-Mouse Noggin-FC of HA-Mouse Rspo1-FC. We willen ook Dr. Dean Tang bedanken voor het toestaan van toegang tot de fluorescerende dissectie Microscoop in zijn laboratorium. Dit werk werd gesteund door CA179907 tot D.W.G. van het National Cancer Institute. Gedeelde bronnen bij Roswell Park uitgebreid Kankercentrum werden ondersteund door National Institutes of Health Cancer Center ondersteuning Grant CA016056.

De hier beschreven dier procedures zijn uitgevoerd met de goedkeuring van het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) op het departement laboratorium dierlijk materiaal, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, New York.
Opmerking: Mannelijke muizen om te worden ontleed om te isoleren van prostates of prostaattumoren voor het genereren van organoïden moet ten minste de leeftijd van seksuele volwassenheid hebben bereikt-over 8-10 weken van leeftijd. Spe...

<ol>
	<li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altering+the+genome+by+homologous+recombination.">Altering the genome by homologous recombination.</a> Science. 244 (4910), 1288-1292 (1989).</li><li>Furth, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+control+of+gene+expression+in+transgenic+mice+by+a+tetracycline-responsive+promoter.">Temporal control of gene expression in transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (20), 9302-9306 (1994).</li><li>Aranda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+directionality+in+the+Cre-LoxP+site-specific+recombination+pathway.">Altered directionality in the Cre-LoxP site-specific recombination pathway.</a> Journal of Molecular Biology. 311 (3), 453-459 (2001).</li><li>Schwenk, F., Kuhn, R., Angrand, P. O., Rajewsky, K., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+and+spatially+regulated+somatic+mutagenesis+in+mice.">Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice.</a> Nucleic Acids Research. 26 (6), 1427-1432 (1998).</li><li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+mice.">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).</li><li>Goodrich, M. M., Talhouk, R., Zhang, X., Goodrich, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+approach+for+controlling+the+timing+and+order+of+engineered+mutations+in+mice.">An approach for controlling the timing and order of engineered mutations in mice.</a> Genesis. 56 (8), 23242 (2018).</li><li>Brocard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporally+controlled+site-specific+somatic+mutagenesis+in+the+mouse.">Spatio-temporally controlled site-specific somatic mutagenesis in the mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14559-14563 (1997).</li><li>Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+mouse+cancer+models:+a+maze+of+opportunities+and+challenges.">Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges.</a> Cell. 163 (1), 39-53 (2015).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2019.">Cancer statistics, 2019.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. , (2019).</li><li>Bluemn, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+Receptor+Pathway-Independent+Prostate+Cancer+Is+Sustained+through+FGF+Signaling.">Androgen Receptor Pathway-Independent Prostate Cancer Is Sustained through FGF Signaling.</a> Cancer Cell. 32 (4), 474-489 (2017).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+of+p53+and+Rb+deficiency+in+a+conditional+mouse+model+for+metastatic+prostate+cancer.">Synergy of p53 and Rb deficiency in a conditional mouse model for metastatic prostate cancer.</a> Cancer Research. 66 (16), 7889-7898 (2006).</li><li>Ku, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rb1+and+Trp53+cooperate+to+suppress+prostate+cancer+lineage+plasticity,+metastasis,+and+antiandrogen+resistance.">Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance.</a> Science. 355 (6320), 78-83 (2017).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions.">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+cancer+models+in+tumor+biology.">Spherical cancer models in tumor biology.</a> Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li><li>Oliveira, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+prostate:+a+basic+anatomical+and+histological+guideline.">The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline.</a> Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).</li><li>Callis, G., Sterchi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decalcification+of+Bone:+Literature+Review+and+Practical+Study+of+Various+Decalcifying+Agents,+Methods,+and+Their+Effects+on+Bone+Histology.">Decalcification of Bone: Literature Review and Practical Study of Various Decalcifying Agents, Methods, and Their Effects on Bone Histology.</a> The Journal of Histotechnology. (21), 49-58 (1998).</li><li>Dardenne, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Myc+Induces+an+EZH2-Mediated+Transcriptional+Program+Driving+Neuroendocrine+Prostate+Cancer.">N-Myc Induces an EZH2-Mediated Transcriptional Program Driving Neuroendocrine Prostate Cancer.</a> Cancer Cell. 30 (4), 563-577 (2016).</li><li>Blattner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPOP+Mutation+Drives+Prostate+Tumorigenesis+In+Vivo+through+Coordinate+Regulation+of+PI3K/mTOR+and+AR+Signaling.">SPOP Mutation Drives Prostate Tumorigenesis In Vivo through Coordinate Regulation of PI3K/mTOR and AR Signaling.</a> Cancer Cell. 31 (3), 436-451 (2017).</li><li>Agarwal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Different+Classes+of+Luminal+Progenitor+Cells+within+Prostate+Tumors.">Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors.</a> Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).</li></ol>

Kritische stappen binnen het protocol voor prostaat tumor dissectie en organoïde generatie Verwijdering van niet-prostaatweefsel en fijne dissectie van de muis prostaat tumor is cruciaal voor de optimale generatie van kanker organoïden omdat zowel niet-prostaat epitheelcellen en normale prostaat epitheelcellen organoïden zullen genereren. Voor vaste prostaattumoren specifiek, het is cruciaal om te isoleren gebieden van levensvatbare tumor te verwijderen van besmetting met necrotisch weefsel dat het...

Sinds de late jaren 1980, de mogelijkheid om genen te veranderen door homologe recombinatie heeft sterk gevorderd de studie van biologische systemen1. Indusgebonden, weefsel-, of cel-specifieke promotor systemen en sitespecifieke recombinases, zoals CRE-loxp, heeft geavanceerde genetische studies door het faciliteren van controle over genetische modificaties zowel temporeel als ruimtelijk2,3, 4. De combinatie van deze genetische strategieën heeft een breed scala aan experimentele modelsystemen5,6,7gecreëerd.
Genetisch gemanipuleerde Muismodellen (GEMMs) zijn een integraal instrument om te beoordelen hoe individuele genen of groepen van genen van invloed zijn op de ontwikkeling en ziekte van zoogdieren. In preklinisch kankeronderzoek zijn GEMMs de meest fysiologisch relevante en rigoureuze methode om kankerontwikkeling, progressie en behandeling8te bestuderen. Ons laboratorium is gespecialiseerd in het genereren en karakteriseren van kanker GEMMs.
De hoogst gediagnosticeerde niet-cutane kanker onder mannen in de Verenigde Staten is prostaatkanker (PCa). De meerderheid van de patiënten met PCa heeft een ziekte met een laag risico en een hoge overlevingskans, maar de overlevingskansen dalen drastisch wanneer ziekte wordt gediagnosticeerd in gevorderde stadia of als gerichte hormonale therapie progressie induceert naar agressieve, niet-curabele PCa subtypen9,10. Ons laboratorium heeft GEMMs ontwikkeld die gebruik maken van floxed allelen van één of meer tumor suppressor genen. Recombinatie en verlies van tumor suppressor genexpressie komt specifiek voor in de prostaat omdat we een transgen hebben geïntroduceerd met CRE of downstream van de probasin Promoter geactiveerd alleen in prostaat epitheelcellen11, 12. we hebben ook onze gemms gefokt om een CRE reporter transgen genaamd MT/mg, die induceert tomaat fluorescerende eiwit expressie in cellen ontbreekt CRE en groene fluorescerende proteïne (GFP) expressie in cellen met CRE13. Terwijl de presentatie van deze methode en onze representatieve resultaten tonen GEMMs we studeren in ons laboratorium, dit protocol kan worden gebruikt voor het genereren van prostaatkanker organoïden van elke muismodel. Echter, zoals uitvoerig besproken in onze representatieve resultaten sectie, we hebben geconstateerd dat bepaalde tumor kenmerken zijn optimaal voor prostaatkanker organoïde generatie.
In het afgelopen decennium, nieuwe methoden voor het kweken van cellen uit weefsels van epitheliale oorsprong heeft geleid tot aanzienlijke vooruitgang in ons vermogen om te modelleren orgel systemen in vitro14,15. De term "3D-celcultuur" is toegeschreven aan de technieken die betrokken zijn bij het tot stand brengen en onderhouden van organoïden, die in het algemeen kunnen worden gedefinieerd als structuren die bestaan uit cellen die secundaire architectuur assembleren, aangestuurd door Orgaanspecifieke cellineage kenmerken16. Deze nieuwe methoden zijn verschillend van de klassieke 2D-celcultuur in die cellen vereisen geen transformatie of vermoralisatie voor langetermijngroei; Zo kunnen 3D-culturen van normale cellen worden vergeleken met zieke cellen. Dit is vooral waardevol bij kankeronderzoek waarbij normale celcontrole culturen meestal niet beschikbaar zijn. Daarnaast vormen organoïden spontaan secundaire weefsel architecturen met geschikte gedifferentieerde celtypen, waardoor ze een beter modelsysteem zijn om kanker in vitro te begrijpen dan 2D cellijnen17. Ons laboratorium heeft 3D organoïde lijnen gemaakt van tumor probleem geïsoleerd van onze PCA gemms om onze in vivo gegevens aan te vullen en experimenten uit te voeren die niet haalbaar zijn in gemms.
In dit artikel presenteren we geschreven en visuele protocollen voor de volledige obductie van PCa GEMMs, inclusief dissectie van verschillende muizen prostaat lobben en gemetastaseerde laesies. We beschrijven en tonen een stap-voor-stap methode voor het genereren van organoïden van muizen prostaattumoren op basis van een protocol eerder gepubliceerd door Drost et al. voor het afleiden van organoïden van normale muis prostaat epitheelweefsel18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:680px;" width="680">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">0.25 % Trypsin+2.21 mM EDTA</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-053</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">1 1/4 in, 23 gauge, disposable syringe needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">Z192430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">10 % neutral buffered formalin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">32 % paraformaldehyde</td>
			<td style="width:177px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">A83-01</td>
			<td style="width:177px;">MedChemExpress</td>
			<td style="width:119px;">HY-10432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Advanced DMEM/F12+++</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Analytical balance</td>
			<td style="width:177px;">Mettler Toledo</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30216623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">B27 (50X)</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Collagenase II</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Dissecting Board</td>
			<td style="width:177px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">36-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:217px;">EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10</td>
			<td style="width:177px;">Manufactured by Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory</td>
			<td style="width:167px;">Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">human recombinant Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:177px;">PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">N-Acetyl-L-Cysteine</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Precision balance</td>
			<td style="width:177px;">Mettler Toledo</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30216561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Scalpel #23</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">504176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Scalpel Handle #7, 16 cm</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">500238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Single-edge carbon razor blade</td>
			<td style="width:177px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">504489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Y-276632 (Rock Inhibitor)</td>
			<td style="width:177px;">APExBIO</td>
			<td style="width:119px;">A3008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of tumor organoids from genetically engineered mouse models of prostate cancer

Methoden op basis van homologe recombinatie om genen te wijzigen hebben aanzienlijk bevorderd biologisch onderzoek. Genetisch gemanipuleerde Muismodellen (GEMMs) zijn een strenge methode om de ontwikkeling en ziekte van zoogdieren te bestuderen. Ons laboratorium heeft verschillende GEMMs van prostaatkanker (PCa) ontwikkeld die geen expressie van één of meerdere tumor suppressor genen hebben met behulp van het sitespecifieke CRE-loxP of systeem en een prostaat-specifieke promotor. In dit artikel beschrijven we onze methode voor obductie van deze PCa GEMMs, voornamelijk gericht op dissectie van muis prostaattumoren. Nieuwe methoden die de afgelopen tien jaar zijn ontwikkeld, hebben de cultuur van epitheel afgeleide cellen vergemakkelijkt om orgel systemen in vitro in drie dimensies te modelleren. We ook detail een 3D-cel cultuur methode voor het genereren van tumor organoïden van muis PCa GEMMs. Pre-klinisch kankeronderzoek is gedomineerd door 2D celcultuur en cellijn-afgeleide of patiënt-afgeleide xenotransplantaatmodellen is modellen. Deze methoden ontbreken tumor micro Environment, een beperking van het gebruik van deze technieken in pre-klinische studies. Gemms zijn fysiologisch relevant voor het begrijpen van tumorvorming en kanker progressie. Tumor organoïde cultuur is een in vitro modelsysteem dat tumor architectuur en cellineage kenmerken aan. Bovendien, 3D-celkweek methoden zorgen voor groei van normale cellen voor vergelijking met tumor celculturen, zelden mogelijk met behulp van 2D-celkweek technieken. In combinatie heeft het gebruik van GEMMs en 3D-celcultuur in preklinische studies het potentieel om ons begrip van Kankerbiologie te verbeteren.

Representatieve obductie beelden van een muis met een grote vloeistof gevulde primaire prostaat tumor in de voorste prostaat regio worden weergegeven in Figuur 2a. Figuur 2Bdaarentegen vertoont representatieve obductie beelden van een muis met een grote vaste primaire prostaat tumor waarvoor individuele prostaat gebieden niet te onderscheiden zijn. Fluorescerende dissectie beelden tonen dezelfde solide prostaat tumor uit <strong...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer at JoVE.com

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

We tonen een methode voor obductie en dissectie van muizen prostaatkanker modellen, gericht op prostaat tumor dissectie. Een stap-voor-stap protocol voor het genereren van muis prostaat tumor organoïden wordt ook gepresenteerd.

Generatie van tumor Organoïden uit genetisch gemanipuleerde Muismodellen van prostaatkanker

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

Muis organoïde culturen lijken meer op in vivo celorganisatie dan traditionele celculturen. In kankeronderzoek, organoïden model de oorspronkelijke tumor beter dan 2D-cellijnen en kan worden gebruikt om potentiële kankertherapieën te testen in vitro om nieuwe medicamenteuze behandelingen te ontwikkelen. Voor en bloc extractie van de mannelijke muis urogenital systeem pak de vetmat aan weerszijden van de blaas en trek naar boven om de testikel bloot te leggen.Ontleden zorgvuldig elke testikel uit de buurt van de rest van het urogenitale gebied. Til voorzichtig de blaas op, zodat het urogenitale gebied samen wordt verhoogd, waardoor de plasbuis eronder wordt blootsteld. Terwijl u de blaas vasthoudt, oriënteert u de schaar tegen de onderkant van de rugstaat om de urethra in te ringen.Het hele urogenitale gebied komt vrij uit de buikholte. Na het verwijderen van het urogenitale systeem worden de bekkenlymfeklieren die direct achter het urogenitale systeem en aan weerszijden van de wervelkolom worden geplaatst, blootgesteld. Om de lymfeklieren te verwijderen oriënteren rechte tangen onder het lymfeweefsel en trek omhoog.Greep vervolgens het rectum met de rechte tangen en snijd, trekken op het rectum om de hele dikke darm en dunne darm te ontrafelen om te zoeken naar uitgezaaide laesies in de mesenterische lymfeklieren. Wanneer het hele ilium is verwijderd blijven trekken op de twaalfvingerige darm om de maag bloot te stellen. Snijd de slokdarm om de maag volledig te verwijderen.Als er gemetastaseerde laesies in de lymfeklieren worden waargenomen, ontleden u deze knooppunten zorgvuldig uit de buurt van de darm voor opslag in PBS. Wanneer de maag is verwijderd, kan de milt worden geoogst van de rugzijde van de buik voor opslag in 4%paraformaldehyde. Verwijder de lever voor opslag in PBS.Verwijder de nieren van beide zijden van de wervelkolom, samen met eventuele nierlymfeklieren die uitgezaaide laesies bevatten. Om de borstholte bloot te leggen, snijdt u het middenrif langs de ribbenkast zorgvuldig door. De negatieve druk die vrijkomt in de borstholte zal het hart en de longen blootstellen.Trek op het borstbeen om de borstholte verder te openen. Scan het ventrale gezicht van de borstholte langs de ribbenkast op gemetastaseerde laesies in de thoracale lymfeklieren voor dissectie indien aanwezig. Terwijl nog steeds het borstbeen, snijd de ventrale ribbenkast om toegang te krijgen tot het hart en de longen en trek op het hart te snijden onder de longen.Om volledig te verwijderen van het hart en de longen en bloc snijd alle voorste bloedvaten in de luchtpijp. Breng het hart zorgvuldig over zonder het longweefsel of longverstastatische laesies in een container met PBS te beschadigen. Voor dissectie van de prostaattumor plaats het urogenitale gebied onder een dissectiemicroscoop.Gebruik een paar rechte tangen en een paar gebogen tangen om het urogenitale gebied op het rugoppervlak te draaien. Zoek het proximale proximale prostaatgebied dat kan worden geïdentificeerd door de roze-rode kleur van de plasbuis. Pak de plasbuis stevig vast om manipulatie van het urogenitale weefsel met de gebogen tangen mogelijk te maken.Zoek de basis van de zaadblasels om hun zorgvuldige verwijdering mogelijk te maken. Gebruik vervolgens de gebogen kant van de tangen om de vas deferens en zoveel mogelijk vet en bindweefsel te verwijderen. Terwijl nog steeds stevig bedrijf de plasbuis en proximale prostaat regio, gebruik maken van een paar fijne puntige schaar om de blaas te verwijderen uit de plasbuis.Houd het proximale prostaatgebied en urethra stevig met de rechte tangen grijpen het voorste prostaatgebied met de gebogen kant van de tangen om het weefsel stevig weg te trekken van de blaas en de rest van de prostaat. Plaats het voorste prostaatweefsel in PBS en lokaliseer het ventrale prostaatgebied. Verwijder het ventrale prostaatgebied op dezelfde manier.Als het zijgebied kan worden onderscheiden van het ruggebied verwijder het laterale prostaatgebied aan beide zijden. Verwijder vervolgens het dorsale prostaatgebied en plaats het proximale prostaatgebied in 4%paraformaldehyde. Na het snijden, plaats de tumor stukken in een 15-milliliter buis van de spijsvertering buffer voor een anderhalf tot twee uur spijsvertering op 37 graden Celsius.Aan het einde van de spijsvertering, sediment het verteerde weefsel door centrifugatie en gooi de supernatant. Veeg met de buis om de celpellet los te maken. Resuspend de cellen in een milliliter van voorverwarmde trypsine aangevuld met 10 micromolar Y-27632 ROCK remmer gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius.Aan het einde van de incubatietrituraat de weefseldrijfmest vijf keer met een standaard P1000 pipetpunt. Breng de buis terug naar het waterbad voor een extra vijf minuten incubatie en trituratie. Voor matrix koepel beplating wassen de verteerde cellen in negen milliliter van koud medium, dan verzamelen van de cellen door centrifugatie.Resuspend de cellen in een milliliter vers medium voor het tellen. En na het tellen, verzamel de cellen door centrifugatie opnieuw. Verdun de tumorcellen in het juiste volume van matrix.Laat voorzichtig 200 microliter matrixceloplossing in elke put van een 55 graden Celsius opgewarmde zesputige plaat vallen. Laat de koepels twee minuten op kamertemperatuur stollen voordat u de plaat gedurende 20 minuten ondersteboven in een couveuse van 37 graden Celsius plaatst. Wanneer de koepels volledig gestolde voeg twee milliliter van prostaat organoïde medium aangevuld met androgeen R1881 en ROCK remmer aan elke put.Breng de plaat terug naar de celkweek incubator. Fluorescerende dissectie beelden onthullen groene fluorescerende eiwitten, of GFP expressie, door vaste prostaat tumoren, wat aangeeft dat de tumorcellen Cre uitdrukken. De lever en longen van hetzelfde dier vertonen uitgezaaide tumoren die GFP uitdrukken waaruit blijkt dat deze tumoren afkomstig zijn van de primaire prostaattumor.De bekkenlymfeklier van deze muis drukt GFP uit en niet Tomaat, wat aangeeft dat deze uitgezaaide tumor de lymfeklier heeft ingehaald en er geen normaal weefsel overblijft. Op dag één van cultuur beginnen de kleine organoïden die uit een stevige prostaattumor worden geproduceerd zich met zowel Tomaat als GFP-uitdrukkende cellen te vormen die in de tumor organoïde cultuur aanwezig zijn. Op dag zeven en daarna, wanneer de prostaat tumor organoïden volledig zijn gevormd echter, de organoïden uitdrukken GFP, maar niet Tomaat, wat suggereert dat de organoïden zijn ontstaan uit Cre-uitdrukkende tumorcellen en niet uit normale epitheliale cellen.Op dag één van cultuur van kleine organoïden die uit vloeistof-gevulde prostaattumor worden geproduceerd zowel Tomaat als GFP-uitdrukkende cellen zijn aanwezig binnen de organoïde cultuur. Organoïden van met vloeistof gevulde prostaattumoren drukken op dag zeven en daarna echter GFP of Tomaat uit, wat aangeeft dat de organoïden gevormd zijn uit cellen die Cre niet uitdrukken. Om te blijven georiënteerd bij het oogsten van het prostaatweefsel, zich bewust zijn van de blaas en urethra posities te allen tijde.Na hun generatie kunnen de organoïden worden gebruikt in beeldvormende toepassingen, moleculaire biologieanalyse en medicijnschermen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generatie van inheemse chromatine Immunoprecipitation Sequencing bibliotheken nucleosoom dichtheid p.a.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generatie van genoom-brede chromatine conformatie Capture bibliotheken uit strak geënsceneerde vroege Drosophila embryo 's

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

Gelijktijdige Video-EEG-ECG controle om te identificeren Neurocardiac dysfunctie in muismodellen van epilepsie

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identificatie van homologe recombinatie gebeurtenissen in muis embryonale stamcellen met behulp van Southern Blotting en de Kettingreactie van de Polymerase

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Generatie van kanker cel klonen te visualiseren Telomere Repeat-bevattende RNA TERRA uitgedrukt uit een enkele Telomere in levende cellen

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Intraveneuze triculaire transplantatie van engineered neuronale precursoren voor in vivo Neuroarchitecture studies

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

SCHERPEr/Cas9 Ribonucleoproteã-gemedieerde nauwkeurige Gene bewerking door buis Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

Het gebruik van muizen-borstkanker tumor cellen in een in vitro invasie assay als een maat voor oncogene Celgedrag

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level

De volgende-generatie van RNA het rangschikken en een bioinformatica pijpleiding om uitgedrukte lijn-1S op het Locus-specific niveau te identificeren

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and ...