Name: generation of tumor organoids from genetically engineered mouse models of prostate cancer
Uploaded: 2019-06-13T14:00:00
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Les auteurs tiens à remercier le laboratoire Calvin Kuo de l'Université Stanford d'avoir fourni des cellules HEK293 transfectées de la souris Noggin-Fc ou de la souris Ha Rspo1-Fc. Nous tenons également à remercier le Dr Dean Tang de nous avoir permis d'avoir accès au microscope à dissection fluorescente dans son laboratoire. Ce travail a été soutenu par CA179907 à D.W.G. de l'Institut national du cancer. Les ressources partagées du Roswell Park Comprehensive Cancer Center ont été appuyées par la subvention de soutien CA016056 des National Institutes of Health Cancer Center.

Les procédures animales décrites ici ont été effectuées avec l'approbation du Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) au Département des ressources animales de laboratoire, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, New York.
REMARQUE: Les souris mâles à disséquer pour isoler les tumeurs de la prostate ou de la prostate pour la génération d'organoïdes devraient avoir au moins atteint l'âge de la maturité sexuelle - environ 8-1...

<ol>
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Étapes critiques dans le protocole pour la dissection de tumeur de prostate et la génération d'organoïde Le déplacement du tissu non-prostate et de la dissection fine de la tumeur de prostate de souris est crucial pour la génération optimale des organoïdes de cancer puisque les cellules épithéliales non-prostate et les cellules épithéliales normales de prostate produiront des organoïdes. Pour les tumeurs solides de prostate spécifiquement, il est crucial d'isoler des secteurs de tumeur v...

Depuis la fin des années 1980, la capacité de modifier les gènes par recombinaison homologue a grandement avancé l'étude des systèmes biologiques1. Les systèmes promoteurs inductibles, tissulaires ou cellulaires et les recombinases spécifiques au site, comme Cre-loxP, ont fait progresser les études génétiques en facilitant le contrôle des modifications génétiques tant temporellement que spatialement2,3, 4. La combinaison de ces stratégies génétiques a créé un large éventail de systèmes de modèles expérimentaux5,6,7.
Les modèles de souris génétiquement modifiés (GEMM) sont un outil intégral pour évaluer comment les gènes individuels ou les groupes de gènes affectent le développement et la maladie des mammifères. Dans la recherche préclinique sur le cancer, les GEMM sont la méthode la plus pertinente sur le plan physiologique et la plus rigoureuse pour étudier le développement, la progression et le traitement du cancer8. Notre laboratoire est spécialisé dans la génération et la caractérisation des GEMM cancéreux.
Le cancer non cutané le plus fortement diagnostiqué chez les hommes aux États-Unis est le cancer de la prostate (PCa). La majorité des patients atteints de PCa ont une maladie à faible risque et une forte probabilité de survie, mais les taux de survie diminuent considérablement lorsque la maladie est diagnostiquée à des stades avancés ou si l'hormonothérapie ciblée induit une progression vers une PCa agressive et non curable. sous-types9,10. Notre laboratoire a développé des GEMM qui utilisent des alleles floxed d'un ou plusieurs gènes suppresseurs de tumeur. La recombinaison et la perte de l'expression de gène de suppresseur de tumeur se produit spécifiquement dans la prostate parce que nous avons introduit un transgène avec Cre recombinase en aval du promoteur de probasin activé seulement dans les cellules épithéliales de prostate11, 12. Nous avons également élevé nos GEMMpour contenir un transgène Cre reporter appelé mT/mG, qui induit l'expression de protéines fluorescentes de tomate dans les cellules dépourvues d'expression de cre et de protéine fluorescente verte (GFP) dans les cellules avec Cre13. Tandis que la présentation de cette méthode et nos résultats représentatifs montrent GEMMs que nous étudions dans notre laboratoire, ce protocole peut être employé pour produire des organoïdes de cancer de la prostate à partir de n'importe quel modèle de souris. Cependant, comme discuté en détail dans notre section représentative de résultats, nous avons observé que certaines caractéristiques de tumeur sont optimales pour la génération d'organoïdes de cancer de la prostate.
Au cours de la dernière décennie, de nouvelles méthodes de culture des cellules à partir de tissus d'origine épithéliale ont conduit à des progrès significatifs dans notre capacité à modéliser les systèmes d'organes in vitro14,15. Le terme « culture cellulaire 3D » a été attribué aux techniques impliquées dans l'établissement et le maintien des organoïdes, qui peuvent généralement être définis comme des structures composées de cellules qui assemblent l'architecture secondaire entraînée par la lignée cellulaire spécifique à l'organe caractéristiques16. Ces nouvelles méthodes sont distinctes de la culture classique des cellules 2D en ce que les cellules ne nécessitent pas de transformation ou d'immortalisation pour la croissance à long terme; ainsi, les cultures 3D des cellules normales peuvent être comparées aux cellules malades. Ceci est particulièrement utile dans la recherche sur le cancer où les cultures normales de contrôle cellulaire n'ont généralement pas été disponibles. En outre, les organoïdes forment spontanément des architectures de tissus secondaires avec des types de cellules correctement différenciés, ce qui en fait un meilleur système modèle pour comprendre le cancer in vitro que les lignées cellulaires 2D17. Notre laboratoire a créé des lignes organoïdes 3D à partir de la question tumorale isolée de nos GEMM PCa pour compléter nos données in vivo et effectuer des expériences qui ne seraient pas réalisables dans les GEMM.
Dans cet article, nous présentons des protocoles écrits et visuels pour l'autopsie complète des GEMM de PCa, y compris la dissection des lobes distincts de prostate de souris et des lésions métastatiques. Nous décrivons et montrons une méthode étape par étape pour produire des organoïdes des tumeurs de prostate de souris basées sur un protocole précédemment édité par Drost et autres pour dériver des organoïdes du tissu épithélial normal de prostate de souris18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:680px;" width="680">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">0.25 % Trypsin+2.21 mM EDTA</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-053</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">1 1/4 in, 23 gauge, disposable syringe needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">Z192430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">10 % neutral buffered formalin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">32 % paraformaldehyde</td>
			<td style="width:177px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">A83-01</td>
			<td style="width:177px;">MedChemExpress</td>
			<td style="width:119px;">HY-10432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Advanced DMEM/F12+++</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Analytical balance</td>
			<td style="width:177px;">Mettler Toledo</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30216623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">B27 (50X)</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Collagenase II</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Dissecting Board</td>
			<td style="width:177px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">36-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:217px;">EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10</td>
			<td style="width:177px;">Manufactured by Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory</td>
			<td style="width:167px;">Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">human recombinant Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:177px;">PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">N-Acetyl-L-Cysteine</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Precision balance</td>
			<td style="width:177px;">Mettler Toledo</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30216561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Scalpel #23</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">504176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Scalpel Handle #7, 16 cm</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">500238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Single-edge carbon razor blade</td>
			<td style="width:177px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">504489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Y-276632 (Rock Inhibitor)</td>
			<td style="width:177px;">APExBIO</td>
			<td style="width:119px;">A3008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of tumor organoids from genetically engineered mouse models of prostate cancer

Les méthodes basées sur la recombinaison homologue pour modifier des gènes ont considérablement favorisé la recherche biologique. Les modèles de souris génétiquement modifiés (GEMM) sont une méthode rigoureuse pour étudier le développement et la maladie des mammifères. Notre laboratoire a développé plusieurs GEMMs du cancer de la prostate (PCa) qui manquent d'expression d'un ou plusieurs gènes suppresseurs de tumeur utilisant le système de recombinase de Cre-loxP site-spécifique et un promoteur prostate-spécifique. Dans cet article, nous décrivons notre méthode pour l'autopsie de ces GEMMs de PCa, se concentrant principalement sur la dissection des tumeurs de prostate de souris. De nouvelles méthodes développées au cours de la dernière décennie ont facilité la culture des cellules épithéliales pour modéliser les systèmes d'organes in vitro en trois dimensions. Nous détaillons également une méthode de culture cellulaire 3D pour produire des organoïdes de tumeur des GEMMs de PCa de souris. La recherche préclinique sur le cancer a été dominée par la culture cellulaire 2D et les modèles de xénogreffe dérivés de lignées cellulaires ou dérivés du patient. Ces méthodes manquent de microenvironnement tumoral, une limitation de l'utilisation de ces techniques dans les études précliniques. GemMs sont plus physiologiquement-pertinents pour comprendre la tumorigénèse et la progression du cancer. La culture organoïde de tumeur est un système in vitro de modèle qui récapitule l'architecture de tumeur et les caractéristiques de lignée cellulaire. En outre, les méthodes de culture cellulaire 3D permettent la croissance des cellules normales pour la comparaison aux cultures de cellules de tumeur, rarement possible utilisant des techniques de culture cellulaire 2D. En combinaison, l'utilisation des GEMM et de la culture cellulaire 3D dans les études précliniques a le potentiel d'améliorer notre compréhension de la biologie du cancer.

Les images d'autopsie représentatives d'une souris avec une grande tumeur primaire remplie de liquide de prostate dans la région antérieure de prostate sont montrées dans la figure 2A. En revanche, la figure 2B, montre des images d'autopsie représentatives d'une souris avec une grande tumeur primaire solide de prostate pour laquelle les régions individuelles de prostate sont indiscernables. Les images fluorescentes de diss...

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Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Nous montrons une méthode pour l'autopsie et la dissection des modèles de cancer de la prostate de souris, se concentrant sur la dissection de tumeur de prostate. Un protocole étape par étape pour la génération des organoïdes de tumeur de prostate de souris est également présenté.

Génération d'organoïdes tumoraux à partir de modèles de souris génétiquement modifiés du cancer de la prostate

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

Les cultures organoïdes de souris ressemblent plus étroitement à l’organisation cellulaire in vivo qu’aux cultures cellulaires traditionnelles. Dans la recherche sur le cancer, les organoïdes modélisent la tumeur originale mieux que les lignées cellulaires 2D et peuvent être utilisés pour tester des thérapies potentielles contre le cancer in vitro pour développer de nouveaux traitements médicamenteux. Pour l’extraction en bloc du système urogène de souris mâle saisir la garniture de graisse de chaque côté de la vessie et tirer vers le haut pour exposer le testicule.Disséquer soigneusement chaque testicule loin du reste de la région urogène. Soulevez doucement la vessie de sorte que la région urogène est élevée ensemble, exposant l’urètre en dessous. Tout en tenant la vessie, orientez les ciseaux contre le dessous de la prostate dorsale pour inciser l’urètre.Toute la région ovrogénétique sera libérée de la cavité abdominale. Après avoir enlevé le système urogène, les ganglions lymphatiques pelviens placés immédiatement derrière le système urogène et de chaque côté de la colonne vertébrale seront exposés. Pour enlever les ganglions lymphatiques orienter les forceps droits sous le tissu lymphatique et tirer vers le haut.Ensuite, saisissez le rectum avec les forceps droits et coupez, tirant vers le haut sur le rectum pour démêler le côlon entier et l’intestin grêle pour rechercher des lésions métastatiques dans les ganglions lymphatiques mésentériques. Lorsque l’ilium entier a été enlevé continuer à tirer sur le dudénon pour exposer l’estomac. Couper l’œsophage pour enlever complètement l’estomac.Si des lésions métastatiques dans les ganglions lymphatiques sont observées, disséquez soigneusement ces ganglions loin de l’intestin pour le stockage dans PBS. Lorsque l’estomac a été enlevé, la rate peut être récoltée du côté dorsale de l’abdomen pour le stockage dans 4% paraformaldéhyde. Retirer le foie pour le stockage dans PBS.Retirez les reins de chaque côté de la colonne vertébrale avec tous les ganglions lymphatiques rénaux contenant des lésions métastatiques. Pour exposer la cavité thoracique soigneusement couper le diaphragme le long de la cage thoracique. La pression négative libérée dans la cavité thoracique exposera le cœur et les poumons.Tirez vers le haut sur le sternum pour ouvrir la cavité thoracique plus loin. Scannez le visage ventral de la cavité thoracique le long de la cage thoracique pour les lésions métastatiques dans les ganglions lymphatiques thoraciques pour la dissection s’il est présent. Tout en tenant le sternum, couper la cage thoracique ventrale pour accéder au cœur et aux poumons et tirer vers le haut sur le cœur pour couper sous les poumons.Pour enlever complètement le cœur et les poumons en bloc couper tous les vaisseaux sanguins antérieurs dans la trachée. Transférez soigneusement le cœur sans endommager le tissu pulmonaire ou les lésions métastatiques pulmonaires dans un récipient de PBS. Pour la dissection de la tumeur de prostate placer la région urogène sous un microscope de dissection.Utilisez une paire de forceps droits et une paire de forceps incurvés pour retourner la région urogène sur sa surface dorsale. Localiser la région proximale de la prostate qui peut être identifiée par la couleur rose-rouge de l’urètre. Saisissez fermement l’urètre pour permettre la manipulation du tissu urogène avec les forceps incurvés.Localiser la base des vésicules séminal pour permettre leur enlèvement soignent. Ensuite, utilisez le côté incurvé des forceps pour enlever les déférents de vas et autant de tissu gras et conjonctif que possible. Tout en maintenant fermement l’urètre et la région proximale de la prostate, utilisez une paire de ciseaux pointus fins pour enlever la vessie de l’urètre.Tenant fermement la région proximale de prostate et l’urètre avec les forceps droits saisissent la région antérieure de prostate avec le côté courbé des forceps pour tirer fermement le tissu loin de la vessie et du reste de la prostate. Placez le tissu antérieur de prostate dans PBS et localisez la région ventrale de prostate. Retirez la région ventrale de la prostate de la même manière.Si la région latérale peut être distinguée de la région dorsale enlever la région latérale de la prostate des deux côtés. Retirez ensuite la région dorsale de la prostate et placez la région proximale de la prostate dans 4% de paraformaldéhyde. Après le hachage, placez les morceaux de tumeur dans un tube de 15 millilitres de tampon de digestion pour une digestion d’une heure et demie à deux heures à 37 degrés Celsius.À la fin de la digestion, sédimenter le tissu digéré par centrifugation et jeter le supernatant. Feuilletez le tube pour desserrer la pastille cellulaire. Resuspendez les cellules en un millilitre de trypsine préchauffée complétée par 10 inhibiteurs micromolaires Y-27632 ROCK pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius.À la fin de l’incubation triturer le lisier tissulaire cinq fois avec une pointe standard P1000 pipette. Remettre le tube au bain d’eau pour une incubation et une trituration supplémentaires de cinq minutes. Pour le placage matricielle dôme laver les cellules digérées en neuf millilitres de milieu froid, puis recueillir les cellules par centrifugation.Resuspendez les cellules en un millilitre de milieu frais pour compter. Et après le comptage, recueillir les cellules par centrifugation une fois de plus. Diluer les cellules tumorales dans le volume approprié de la matrice.Déposez soigneusement 200 microlitres de solution cellulaire matricielle dans chaque puits d’une plaque de six puits réchauffée de 55 degrés Celsius. Laissez les dômes se solidifier à température ambiante pendant deux minutes avant de placer la plaque à l’envers dans un incubateur de 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Lorsque les dômes ont entièrement solidifié ajouter deux millilitres de milieu organoïde de la prostate complétée par androgène R1881 et inhibiteur rock à chaque puits.Retournez la plaque à l’incubateur de culture cellulaire. Les images fluorescentes de dissection révèlent la protéine fluorescente verte, ou expression de GFP, par les tumeurs solides de prostate, indiquant que les cellules de tumeur expriment cre. Le foie et les poumons du même animal présentent des tumeurs métastatiques exprimant GFP démontrant que ces tumeurs provenaient de la tumeur primaire de prostate.Le ganglion lymphatique pelvien de cette souris exprime GFP et non Tomate, indiquant que cette tumeur métastatique a dépassé le ganglion lymphatique et aucun tissu normal ne reste. Au premier jour de la culture de petits organoïdes générés à partir d’une tumeur solide de prostate commencent à se former avec la tomate et les cellules GFP-exprimant présentes dans la culture organoïde de tumeur. Au septième jour et au-delà quand les organoïdes de tumeur de prostate se sont complètement formés cependant, les organoïdes expriment GFP, mais pas tomate, suggérant que les organoïdes aient provenu des cellules tumorales cre-expressing et non des cellules épithéliales normales.Le premier jour de la culture des petits organoïdes produits à partir de la tumeur de prostate fluide-remplie à la fois tomate et GFP-exprimant des cellules sont présentes dans la culture organoïde. Les organoïdes des tumeurs de prostate remplies de liquide expriment gfp ou tomate au septième jour et au-delà cependant, indiquant que les organoïdes formés à partir de cellules qui n’expriment pas Cre. Pour rester orienté lors de la récolte du tissu prostatique, soyez conscient des positions de la vessie et de l’urètre en tout temps.Après leur génération, les organoïdes peuvent être utilisés dans les applications d’imagerie, l’analyse de la biologie moléculaire et les écrans de médicaments.

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JoVE Journal

Genetics

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