Name: generation of tumor organoids from genetically engineered mouse models of prostate cancer
Uploaded: 2019-06-13T14:00:00
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Die Autoren danken dem Calvin Kuo Laboratory an der Stanford University für die Bereitstellung von HEK293-Zellen, die entweder mit HA-Maus Noggin-Fc oder HA-Maus Rspo1-Fc stabil transfiziert wurden. Wir möchten uns auch bei Dr. Dean Tang dafür bedanken, dass er uns den Zugang zum fluoreszierenden Seziermikroskop in seinem Labor ermöglicht hat. Diese Arbeit wurde von CA179907 an D.W.G. vom National Cancer Institute unterstützt. Gemeinsame Ressourcen im Roswell Park Comprehensive Cancer Center wurden von National Institutes of Health Cancer Center Support Grant CA016056 unterstützt.

Die hier beschriebenen Tierprozeduren wurden mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Department of Laboratory Animal Resources, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, New York durchgeführt.
HINWEIS: Männliche Mäuse, die seziert werden, um Prostata- oder Prostatatumoren für die Erzeugung von Organoiden zu isolieren, sollten mindestens das Alter der Geschlechtsreife erreicht haben – etwa 8-10 Wochen alt. Spezifische Spezifiena...

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	<li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altering+the+genome+by+homologous+recombination.">Altering the genome by homologous recombination.</a> Science. 244 (4910), 1288-1292 (1989).</li><li>Furth, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+control+of+gene+expression+in+transgenic+mice+by+a+tetracycline-responsive+promoter.">Temporal control of gene expression in transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (20), 9302-9306 (1994).</li><li>Aranda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+directionality+in+the+Cre-LoxP+site-specific+recombination+pathway.">Altered directionality in the Cre-LoxP site-specific recombination pathway.</a> Journal of Molecular Biology. 311 (3), 453-459 (2001).</li><li>Schwenk, F., Kuhn, R., Angrand, P. O., Rajewsky, K., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+and+spatially+regulated+somatic+mutagenesis+in+mice.">Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice.</a> Nucleic Acids Research. 26 (6), 1427-1432 (1998).</li><li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+mice.">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).</li><li>Goodrich, M. M., Talhouk, R., Zhang, X., Goodrich, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+approach+for+controlling+the+timing+and+order+of+engineered+mutations+in+mice.">An approach for controlling the timing and order of engineered mutations in mice.</a> Genesis. 56 (8), 23242 (2018).</li><li>Brocard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporally+controlled+site-specific+somatic+mutagenesis+in+the+mouse.">Spatio-temporally controlled site-specific somatic mutagenesis in the mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14559-14563 (1997).</li><li>Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+mouse+cancer+models:+a+maze+of+opportunities+and+challenges.">Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges.</a> Cell. 163 (1), 39-53 (2015).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2019.">Cancer statistics, 2019.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. , (2019).</li><li>Bluemn, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+Receptor+Pathway-Independent+Prostate+Cancer+Is+Sustained+through+FGF+Signaling.">Androgen Receptor Pathway-Independent Prostate Cancer Is Sustained through FGF Signaling.</a> Cancer Cell. 32 (4), 474-489 (2017).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+of+p53+and+Rb+deficiency+in+a+conditional+mouse+model+for+metastatic+prostate+cancer.">Synergy of p53 and Rb deficiency in a conditional mouse model for metastatic prostate cancer.</a> Cancer Research. 66 (16), 7889-7898 (2006).</li><li>Ku, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rb1+and+Trp53+cooperate+to+suppress+prostate+cancer+lineage+plasticity,+metastasis,+and+antiandrogen+resistance.">Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance.</a> Science. 355 (6320), 78-83 (2017).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions.">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+cancer+models+in+tumor+biology.">Spherical cancer models in tumor biology.</a> Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li><li>Oliveira, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+prostate:+a+basic+anatomical+and+histological+guideline.">The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline.</a> Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).</li><li>Callis, G., Sterchi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decalcification+of+Bone:+Literature+Review+and+Practical+Study+of+Various+Decalcifying+Agents,+Methods,+and+Their+Effects+on+Bone+Histology.">Decalcification of Bone: Literature Review and Practical Study of Various Decalcifying Agents, Methods, and Their Effects on Bone Histology.</a> The Journal of Histotechnology. (21), 49-58 (1998).</li><li>Dardenne, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Myc+Induces+an+EZH2-Mediated+Transcriptional+Program+Driving+Neuroendocrine+Prostate+Cancer.">N-Myc Induces an EZH2-Mediated Transcriptional Program Driving Neuroendocrine Prostate Cancer.</a> Cancer Cell. 30 (4), 563-577 (2016).</li><li>Blattner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPOP+Mutation+Drives+Prostate+Tumorigenesis+In+Vivo+through+Coordinate+Regulation+of+PI3K/mTOR+and+AR+Signaling.">SPOP Mutation Drives Prostate Tumorigenesis In Vivo through Coordinate Regulation of PI3K/mTOR and AR Signaling.</a> Cancer Cell. 31 (3), 436-451 (2017).</li><li>Agarwal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Different+Classes+of+Luminal+Progenitor+Cells+within+Prostate+Tumors.">Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors.</a> Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).</li></ol>

Kritische Schritte innerhalb des Protokolls zur Prostatatumorsektion und Organoiderzeugung Die Entfernung von Nicht-Prostatagewebe und die feine Zerlegung des Prostatatumors der Maus ist entscheidend für die optimale Erzeugung von Krebsorganoiden, da sowohl Nicht-Prostata-Epithelzellen als auch normale Prostata-Epithelzellen Organoide erzeugen. Für solide Prostata-Tumoren speziell, Es ist wichtig, Bereiche des lebensfähigen Tumors zu isolieren, um Kontamination mit nekrotischem Gewebe zu entfernen,...

Seit den späten 1980er Jahren hat die Fähigkeit, Gene durch homologe Rekombination zu verändern, die Untersuchung biologischer Systeme stark vorangebracht1. Induzible, gewebe- oder zellspezifische promotorische Systeme und standortspezifische Rekombinatore wie Cre-loxP haben fortgeschrittene genetische Studien, indem sie die Kontrolle über genetische Veränderungen sowohl zeitlich als auch räumlich erleichtern2,3, 4. Die Kombination dieser genetischen Strategien hat eine breite Palette von experimentellen Modellsystemen5,6,7geschaffen.
Gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMMs) sind ein integrales Werkzeug, um zu beurteilen, wie einzelne Gene oder Gengruppen die Entwicklung und Krankheit von Säugetieren beeinflussen. In der präklinischen Krebsforschung sind GEMMs die physiologisch relevanteste und strengste Methode zur Untersuchung der Krebsentwicklung, Progression und Behandlung8. Unser Labor ist spezialisiert auf die Erzeugung und Charakterisierung von Krebs-GEMMs.
Der am häufigsten diagnostizierte nicht-kutane Krebs bei Männern in den Vereinigten Staaten ist Prostatakrebs (PCa). Die Mehrheit der Patienten mit PCa haben eine Erkrankung mit geringem Risiko und eine hohe Überlebenswahrscheinlichkeit, aber die Überlebensraten sinken drastisch, wenn die Krankheit im fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert wird oder wenn eine gezielte Hormontherapie das Fortschreiten zu einer aggressiven, nicht heilbaren PCa induziert. Subtypen9,10. Unser Labor hat GEMMs entwickelt, die Flockenallele eines oder mehrerer Tumorsuppressorgene verwenden. Rekombination und Verlust der Tumorsuppressor-Genexpression tritt speziell in der Prostata auf, da wir ein Transgen mit Cre-Rekombinantase flussabwärts des Probasinpromotors eingeführt haben, der nur in den Prostataepithelzellen aktiviert ist11, 12. Wir haben auch unsere GEMMs gezüchtet, um ein Cre-Reporter-Transgen namens mT/mG zu enthalten, das eine tomatenfluoreszierende Proteinexpression in Zellen ohne Cre- und grüne fluoreszierende Protein-Expression (GFP) in Zellen mit Cre13induziert. Während die Präsentation dieser Methode und unsere repräsentativen Ergebnisse GEMMs zeigen, die wir in unserem Labor untersuchen, kann dieses Protokoll verwendet werden, um Prostatakrebs-Organoide aus jedem Mausmodell zu erzeugen. Jedoch, wie im Detail in unserem repräsentativen Ergebnisabschnitt diskutiert, haben wir beobachtet, dass bestimmte Tumoreigenschaften für die Erzeugung von Prostatakrebs-Organoid optimal sind.
In den letzten zehn Jahren haben neue Methoden zur Kultivierung von Zellen aus Geweben epithelialen Ursprungs zu signifikanten Fortschritten in unserer Fähigkeit geführt, Organsysteme in vitro14,15zu modellieren. Der Begriff "3D-Zellkultur" wurde den Techniken bei der Herstellung und Aufrechterhaltung von Organoiden zugeschrieben, die im Allgemeinen als Strukturen definiert werden können, die aus Zellen bestehen, die sekundäre Architektur zusammenfügen, die durch organspezifische Zelllinien angetrieben wird. Merkmale16. Diese neuen Methoden unterscheiden sich von der klassischen 2D-Zellkultur dadurch, dass Zellen keine Transformation oder Verewigung für langfristiges Wachstum erfordern; So können 3D-Kulturen normaler Zellen mit erkrankten Zellen verglichen werden. Dies ist besonders wertvoll in der Krebsforschung, wo normale Zellkontrollkulturen in der Regel nicht verfügbar waren. Darüber hinaus bilden Organoide spontan sekundäre Gewebearchitekturen mit entsprechend differenzierten Zelltypen, was sie zu einem besseren Modellsystem macht, um Krebs in vitro zu verstehen als 2D-Zelllinien17. Unser Labor hat 3D-Organoidlinien aus Tumorproblem erstellt, die aus unseren PCa GEMMs isoliert wurden, um unsere In-vivo-Daten zu ergänzen und Experimente durchzuführen, die bei GEMMs nicht möglich wären.
In diesem Artikel stellen wir schriftliche und visuelle Protokolle für die komplette Nekropsie von PCa GEMMs vor, einschließlich der Zerlegung von verschiedenen Mausprostatalappen und metastasierenden Läsionen. Wir beschreiben und zeigen eine Schritt-für-Schritt-Methode zur Erzeugung von Organoiden aus Maus-Prostatatumoren auf der Grundlage eines Protokolls, das zuvor von Drost et al. veröffentlicht wurde, um Organoide aus normalem Maus-Prostatagewebe abzuleiten18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:680px;" width="680">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">0.25 % Trypsin+2.21 mM EDTA</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-053</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">1 1/4 in, 23 gauge, disposable syringe needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">Z192430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">10 % neutral buffered formalin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">32 % paraformaldehyde</td>
			<td style="width:177px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">A83-01</td>
			<td style="width:177px;">MedChemExpress</td>
			<td style="width:119px;">HY-10432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Advanced DMEM/F12+++</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Analytical balance</td>
			<td style="width:177px;">Mettler Toledo</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30216623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">B27 (50X)</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Collagenase II</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Dissecting Board</td>
			<td style="width:177px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">36-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:217px;">EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10</td>
			<td style="width:177px;">Manufactured by Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory</td>
			<td style="width:167px;">Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">human recombinant Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:177px;">PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">N-Acetyl-L-Cysteine</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Precision balance</td>
			<td style="width:177px;">Mettler Toledo</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30216561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Scalpel #23</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">504176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Scalpel Handle #7, 16 cm</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">500238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Single-edge carbon razor blade</td>
			<td style="width:177px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">504489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Y-276632 (Rock Inhibitor)</td>
			<td style="width:177px;">APExBIO</td>
			<td style="width:119px;">A3008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of tumor organoids from genetically engineered mouse models of prostate cancer

Methoden, die auf homologe Rekombination basieren, um Gene zu modifizieren, haben die biologische Forschung erheblich gefördert. Gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMMs) sind eine strenge Methode zur Untersuchung der Entwicklung und Krankheit von Säugetieren. Unser Labor hat mehrere GEMMs von Prostatakrebs (PCa) entwickelt, die keine Expression eines oder mehrerer Tumorsuppressorgene mit dem standortspezifischen Cre-loxP-Rekombinatosasesystem und einem Prostata-spezifischen Promotor haben. In diesem Artikel beschreiben wir unsere Methode zur Nekropsie dieser PCa GEMMs, die sich in erster Linie auf die Zerlegung von Prostatatumoren der Maus konzentriert. Neue Methoden, die in den letzten zehn Jahren entwickelt wurden, haben die Kultur epitheliaaler Zellen erleichtert, Organsysteme in vitro in drei Dimensionen zu modellieren. Wir beschreiben auch eine 3D-Zellkultur-Methode, um Tumor-Organoide aus Maus-PCa GEMMs zu generieren. Die präklinische Krebsforschung wurde von 2D-Zellkultur und zelllinienabgeleiteten oder vom Patienten abgeleiteten Xenograft-Modellen dominiert. Diese Methoden fehlen Tumor-Mikroumgebung, eine Einschränkung der Verwendung dieser Techniken in präklinischen Studien. GEMMs sind physiologisch relevanter für das Verständnis von Tumorgenese und Krebsprogression. Tumororganoidkultur ist ein In-vitro-Modellsystem, das Tumorarchitektur und Zelllinieneigenschaften rekapituliert. Darüber hinaus ermöglichen 3D-Zellkulturmethoden das Wachstum normaler Zellen zum Vergleich mit Tumorzellkulturen, die mit 2D-Zellkulturtechniken nur selten möglich sind. In Kombination hat die Verwendung von GEMMs und 3D-Zellkultur in präklinischen Studien das Potenzial, unser Verständnis der Krebsbiologie zu verbessern.

Repräsentative Nekropsiebilder einer Maus mit einem großen flüssigkeitsgefüllten primären Prostatatumor im vorderen Prostatabereich sind in Abbildung 2Adargestellt. Im Gegensatz dazu zeigt Abbildung 2Brepräsentative Nekropsiebilder einer Maus mit einem großen festen primären Prostatatumor, für den einzelne Prostataregionen nicht zu unterscheiden sind. Fluoreszierende Dissektionsbilder zeigen den gleichen soliden Prostat...

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Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Wir zeigen eine Methode zur Nekropsie und Zerlegung von Prostatakrebsmodellen der Maus, die sich auf die Prostatatumorsektion konzentriert. Ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Erzeugung von Maus-Prostatatumor-Organoiden wird ebenfalls vorgestellt.

Generierung von Tumororganoiden aus gentechnisch veränderten Mausmodellen von Prostatakrebs

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

Mausorganoidkulturen ähneln eher der in vivo Zellorganisation als traditionellen Zellkulturen. In der Krebsforschung modellieren Organoide den ursprünglichen Tumor besser als 2D-Zelllinien und können verwendet werden, um potenzielle Krebstherapien in vitro zu testen, um neue medikamentöse Behandlungen zu entwickeln. Für en bloc Extraktion der männlichen Maus urogenitalsystem greifen Sie das Fettpolster auf beiden Seiten der Blase und ziehen Sie nach oben, um den Hoden auszusetzen.Sezieren Sie vorsichtig jeden Hoden vom Rest der Urogenitalregion entfernt. Heben Sie die Blase vorsichtig an, so dass der Urogenitalbereich zusammen erhöht wird, wodurch die Harnröhre darunter freigelegt wird. Während Des Haltens der Blase die Schere an der Unterseite der dorsalen Prostata ausrichten, um die Harnröhre zu indieren.Die gesamte Urogenitalregion wird aus der Bauchhöhle befreit. Nach dem Entfernen des Urogenitalsystems werden die Beckenlymphknoten, die unmittelbar hinter dem Urogenitalsystem und auf beiden Seiten der Wirbelsäule positioniert sind, freigelegt. Um die Lymphknoten zu entfernen, orientieren gerade Zangen unter dem Lymphgewebe und ziehen Sie nach oben.Als nächstes greifen Sie das Rektum mit den geraden Zangen und schneiden, ziehen auf dem Rektum, um den gesamten Dickdarm und Dünndarm zu entwirren, um nach metastasierenden Läsionen in den mesenterischen Lymphknoten zu suchen. Wenn das gesamte Ilium entfernt wurde, ziehen Sie weiter am Zwölffingerdarm, um den Magen freizulegen. Schneiden Sie die Speiseröhre, um den Magen vollständig zu entfernen.Wenn metastasierende Läsionen in den Lymphknoten beobachtet werden, sezieren Sie diese Knoten vorsichtig vom Darm weg, um sie in PBS zu speichern. Wenn der Magen entfernt wurde, kann die Milz von der Rückenseite des Bauches geerntet werden, um sie in 4% Paraformaldehyd einzulagern. Entfernen Sie die Leber für die Lagerung in PBS.Entfernen Sie die Nieren von beiden Seiten der Wirbelsäule zusammen mit allen Nierenlymphknoten, die metastasierende Läsionen enthalten. Um die Brusthöhle vorsichtig zu belichten, schneiden Sie das Zwerchfell entlang des Rippenkäfigs sorgfältig. Der in der Brusthöhle freigesetzte Unterdruck setzt Herz und Lunge frei.Ziehen Sie auf das Brustbein, um die Brusthöhle weiter zu öffnen. Scannen Sie die ventrale Fläche der Brusthöhle entlang des Rippenkäfigs auf metastasierende Läsionen in den thorakalen Lymphknoten zur Zerlegung, falls vorhanden. Während Sie noch das Brustbein halten, schneiden Sie den ventralen Rippenkäfig ab, um auf das Herz und die Lunge zuzugreifen und das Herz hochzuziehen, um unter die Lunge zu schneiden.Um das Herz und die Lunge en bloc vollständig zu entfernen, schneiden Sie alle vorderen Blutgefäße in der Luftröhre. Übertragen Sie das Herz vorsichtig, ohne das Lungengewebe oder die metastasierenden Lungenläsionen in einen Behälter mit PBS zu übertragen. Zur Zerlegung des Prostatatumors stellen Sie den Urogenitalbereich unter ein Dissektionsmikroskop.Verwenden Sie ein Paar gerade Zangen und ein Paar gekrümmte Zangen, um den Urogenitalbereich auf seine dorsale Oberfläche zu kippen. Suchen Sie den proximalen Prostatabereich, der durch die rosarote Farbe der Harnröhre identifiziert werden kann. Greifen Sie die Harnröhre fest, um die Manipulation des Urogenitalgewebes mit den gekrümmten Zangen zu ermöglichen.Suchen Sie die Basis der Samenbläschen, um ihre sorgfältige Entfernung zu ermöglichen. Dann verwenden Sie die gekrümmte Seite der Zange, um die Vas deferens und so viel Fett- und Bindegewebe wie möglich zu entfernen. Während Sie die Harnröhre und den proximalen Prostatabereich noch fest halten, verwenden Sie eine feine spitze Schere, um die Blase aus der Harnröhre zu entfernen.Halten Sie die proximale Prostataregion und Harnröhre fest mit den geraden Zangen greifen die vordere Prostatabereich mit der gekrümmten Seite der Zange, um das Gewebe fest weg von der Blase und den Rest der Prostata zu ziehen. Legen Sie das vordere Prostatagewebe in PBS und lokalisieren Sie die ventrale Prostataregion. Entfernen Sie den ventralen Prostatabereich auf die gleiche Weise.Wenn der seitliche Bereich von der dorsalen Region unterschieden werden kann, entfernen Sie den seitlichen Prostatabereich auf beiden Seiten. Entfernen Sie dann die dorsale Prostataregion und legen Sie die proximale Prostataregion in 4%Paraformaldehyd. Nach dem Hacken die Tumorstücke für eine eineinhalb- bis zweistündige Verdauung bei 37 Grad Celsius in eine 15-Milliliter-Röhre des Verdauungspuffers geben.Am Ende der Verdauung das verdaute Gewebe durch Zentrifugation ablagern und den Überstand entsorgen. Streichen Sie das Rohr, um das Zellpellet zu lösen. Setzen Sie die Zellen in einem Milliliter vorgewärmtem Trypsin wieder auf, ergänzt mit 10 Mikromolaren Y-27632 ROCK-Hemmern für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius.Am Ende der Inkubation trituieren Sie die Gewebeschlämme fünfmal mit einer Standard-P1000 Pipettenspitze. Bringen Sie das Rohr für weitere fünf Minuten Inkubation und Trituration ins Wasserbad zurück. Für Matrix-Dome-Beschichtung waschen Sie die verdauten Zellen in neun Milliliter kaltem Medium, dann sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation.Setzen Sie die Zellen in einem Milliliter frisches Medium zum Zählen aus. Und nach dem Zählen, sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation wieder. Verdünnen Sie die Tumorzellen im entsprechenden Matrixvolumen.Lassen Sie vorsichtig 200 Mikroliter Matrixzelllösung in jeden Brunnen einer 55 Grad Celsius erwärmten Sechs-Brunnen-Platte fallen. Lassen Sie die Kuppeln bei Raumtemperatur für zwei Minuten erstarren, bevor Sie die Platte 20 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius Inkubator auf den Kopf stellen. Wenn die Kuppeln vollständig verfestigt haben, fügen Sie zwei Milliliter Prostata-Organoid-Medium mit Androgen R1881 und ROCK-Hemmer zu jedem Brunnen ergänzt.Geben Sie die Platte an den Zellkultur-Inkubator zurück. Fluoreszierende Sezierbilder zeigen grünes fluoreszierendes Protein oder GFP-Expression durch feste Prostatatumoren, was darauf hinweist, dass die Tumorzellen Cre ausdrücken. Die Leber und die Lunge desselben Tieres weisen metastasierende Tumoren auf, die GFP ausdrücken und zeigen, dass diese Tumoren aus dem primären Prostatatumor stammen.Der Beckenlymphknoten von dieser Maus drückt GFP und nicht Tomate aus, was darauf hindeutet, dass dieser metastasierende Tumor den Lymphknoten überholt hat und kein normales Gewebe übrig bleibt. Am ersten Tag der Kultur beginnen sich kleine Organoide, die aus einem soliden Prostatatumor erzeugt werden, mit Tomaten- und GFP-exemitten Zellen zu bilden, die in der Tumororganoidkultur vorhanden sind. Am siebten Tag und darüber hinaus, wenn sich die Prostatatumor-Organoide jedoch vollständig gebildet haben, exprimieren die Organoide GFP, aber nicht Tomate, was darauf hindeutet, dass die Organoide aus cre-exprimierenden Tumorzellen stammen und nicht aus normalen Epithelzellen.Am ersten Tag der Kultur der kleinen Organoide aus flüssigkeitsgefüllten Prostatatumor sowohl Tomaten- als auch GFP-exemittierende Zellen sind innerhalb der Organoidkultur vorhanden. Organoide aus flüssigkeitsgefüllten Prostatatumoren drücken entweder GFP oder Tomate an Tag sieben und darüber hinaus aus, was darauf hindeutet, dass die Organoide aus Zellen gebildet wurden, die Cre nicht ausdrücken. Um sich bei der Ernte des Prostatagewebes zu orientieren, beachten Sie jederzeit die Blasen- und Harnröhrenpositionen.Nach ihrer Entstehung können die Organoide in bildgebenden Anwendungen, molekularbiologischen Analysen und Medikamentenscreens eingesetzt werden.

Research

JoVE Journal

Genetics

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Erzeugung von nativen Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung Bibliotheken für Nukleosom Dichteanalyse

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Forschung

Genetik

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation der genomweiten Chromatin Konformation Capture Bibliotheken aus dicht inszenierten Anfang Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

Gleichzeitige Video-EEG-EKG Monitoring Neurocardiac Dysfunktion in Mausmodellen der Epilepsie zu identifizieren

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identifikation der homologen Rekombinationsereignisse in embryonalen Stammzellen der Maus mit Southern Blotting und Polymerase-Kettenreaktion

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Generation von Krebs Zellklonen Telomeric Repeat-haltigen RNA TERRA von einem einzigen Telomere in lebenden Zellen ausgedrückt zu visualisieren

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Intraventrikuläre Transplantation von engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-vermittelte präzise Genbearbeitung durch Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

Die Verwendung von Maus-Mammary-Tumorzellen in einem In-Vitro-Invasions-Assay als Maß für das onkogene Zellverhalten

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level

RNA Next-Generation-Sequenzierung und eine Bioinformatik-Pipeline zur Identifizierung von ausgedrückten LINE-1s auf der Locus-spezifischen Ebene

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and ...