Name: generation of tumor organoids from genetically engineered mouse models of prostate cancer
Uploaded: 2019-06-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer at JoVE.com

המחברים רוצים להודות המעבדה קלווין קואו באוניברסיטת סטנפורד לאספקת תאים HEK293 באופן מאוד מנוכר עם העכבר הראש או העכבר Rspo1-Fc. אנחנו גם רוצים להודות לד ר הדיקן טאנג על שאיפשר לנו לגשת למיקרוסקופ לניתוח פלורסנט במעבדה שלו. עבודה זו נתמכת על ידי CA179907 כדי D.W.G. מן המכון הלאומי לסרטן. משאבים משותפים בפארק רוזוול מקיף הסרטן המרכז היו נתמכים על ידי המכון הלאומי לסרטן בריאות המרכז תמיכה גרנט CA016056.

הליכים בעלי חיים המתוארים כאן בוצעו באישור של הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) במחלקה למשאבי בעלי חיים במעבדה, מרכז הסרטן ברוזוול, באפלו, ניו יורק.
הערה: עכברים זכרים להיות גזור לבודד וגדלת או גידולים הערמונית עבור דור של אורגנואידים צריך לפחות להגיע לגיל של ב?...

<ol>
	<li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altering+the+genome+by+homologous+recombination.">Altering the genome by homologous recombination.</a> Science. 244 (4910), 1288-1292 (1989).</li><li>Furth, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+control+of+gene+expression+in+transgenic+mice+by+a+tetracycline-responsive+promoter.">Temporal control of gene expression in transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (20), 9302-9306 (1994).</li><li>Aranda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+directionality+in+the+Cre-LoxP+site-specific+recombination+pathway.">Altered directionality in the Cre-LoxP site-specific recombination pathway.</a> Journal of Molecular Biology. 311 (3), 453-459 (2001).</li><li>Schwenk, F., Kuhn, R., Angrand, P. O., Rajewsky, K., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+and+spatially+regulated+somatic+mutagenesis+in+mice.">Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice.</a> Nucleic Acids Research. 26 (6), 1427-1432 (1998).</li><li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+mice.">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).</li><li>Goodrich, M. M., Talhouk, R., Zhang, X., Goodrich, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+approach+for+controlling+the+timing+and+order+of+engineered+mutations+in+mice.">An approach for controlling the timing and order of engineered mutations in mice.</a> Genesis. 56 (8), 23242 (2018).</li><li>Brocard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporally+controlled+site-specific+somatic+mutagenesis+in+the+mouse.">Spatio-temporally controlled site-specific somatic mutagenesis in the mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14559-14563 (1997).</li><li>Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+mouse+cancer+models:+a+maze+of+opportunities+and+challenges.">Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges.</a> Cell. 163 (1), 39-53 (2015).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2019.">Cancer statistics, 2019.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. , (2019).</li><li>Bluemn, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+Receptor+Pathway-Independent+Prostate+Cancer+Is+Sustained+through+FGF+Signaling.">Androgen Receptor Pathway-Independent Prostate Cancer Is Sustained through FGF Signaling.</a> Cancer Cell. 32 (4), 474-489 (2017).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+of+p53+and+Rb+deficiency+in+a+conditional+mouse+model+for+metastatic+prostate+cancer.">Synergy of p53 and Rb deficiency in a conditional mouse model for metastatic prostate cancer.</a> Cancer Research. 66 (16), 7889-7898 (2006).</li><li>Ku, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rb1+and+Trp53+cooperate+to+suppress+prostate+cancer+lineage+plasticity,+metastasis,+and+antiandrogen+resistance.">Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance.</a> Science. 355 (6320), 78-83 (2017).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions.">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+cancer+models+in+tumor+biology.">Spherical cancer models in tumor biology.</a> Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li><li>Oliveira, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+prostate:+a+basic+anatomical+and+histological+guideline.">The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline.</a> Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).</li><li>Callis, G., Sterchi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decalcification+of+Bone:+Literature+Review+and+Practical+Study+of+Various+Decalcifying+Agents,+Methods,+and+Their+Effects+on+Bone+Histology.">Decalcification of Bone: Literature Review and Practical Study of Various Decalcifying Agents, Methods, and Their Effects on Bone Histology.</a> The Journal of Histotechnology. (21), 49-58 (1998).</li><li>Dardenne, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Myc+Induces+an+EZH2-Mediated+Transcriptional+Program+Driving+Neuroendocrine+Prostate+Cancer.">N-Myc Induces an EZH2-Mediated Transcriptional Program Driving Neuroendocrine Prostate Cancer.</a> Cancer Cell. 30 (4), 563-577 (2016).</li><li>Blattner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPOP+Mutation+Drives+Prostate+Tumorigenesis+In+Vivo+through+Coordinate+Regulation+of+PI3K/mTOR+and+AR+Signaling.">SPOP Mutation Drives Prostate Tumorigenesis In Vivo through Coordinate Regulation of PI3K/mTOR and AR Signaling.</a> Cancer Cell. 31 (3), 436-451 (2017).</li><li>Agarwal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Different+Classes+of+Luminal+Progenitor+Cells+within+Prostate+Tumors.">Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors.</a> Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).</li></ol>

צעדים קריטיים בפרוטוקול לניתוח גידול בערמונית ויצירת אורגנואיד הסרת רקמת הערמונית וניתוח עדין של הגידול בערמונית העכבר הוא חיוני עבור הדור האופטימלי של הסרטן אורגנואידים מאז הן תאים אפיתל שאינם הערמונית תאים אפיתל הערמונית נורמלי לייצר אורגנואידים. עבור גידולים בערמונית מו?...

מאז סוף שנות ה-80, היכולת לשנות גנים על ידי שילוב מחדש של הומוולוגי התקדמה מאוד במחקר של מערכות ביולוגיות1. Inducible, רקמה-, או תא ספציפי מערכות קידום האתר recombinases ספציפי, כגון היצור-loxp, יש מחקרים גנטיים מתקדמים על ידי הקלה על שליטה על שינויים גנטיים הן זמנית ו מרחב2,3, ד. השילוב של אסטרטגיות גנטיות אלה יצר מגוון רחב של מערכות מודל ניסיוני5,6,7.
מודלים של עכברים מהונדסים גנטית (GEMMs) הם כלי אינטגרלי כדי להעריך כיצד גנים בודדים או קבוצות של גנים משפיעים על פיתוח ומחלות היונקים. במחקר טרום קלינית לסרטן, GEMMs הם השיטה הפיזיולוגית ביותר הרלוונטית וקפדני ללמוד פיתוח סרטן, התקדמות, וטיפול8. המעבדה שלנו מתמחה בהפקת ואפיון של GEMMs סרטן.
הסרטן המאובחנים ביותר בקרב גברים בארצות הברית הוא סרטן הערמונית (PCa). רוב המטופלים עם PCa יש סיכון נמוך מחלה וסבירות גבוהה של הישרדות, אבל שיעורי הישרדות ירידה דרסטית כאשר המחלה מאובחנת בשלבים מתקדמים או אם טיפול הורמונלי ממוקד גורם התקדמות אגרסיבי, לא לריפוי PCa תת-סוגי9,10. המעבדה שלנו פיתחה GEMMs המשתמשים האללים של אחד או יותר גנים מדכא הגידול. שילוב ואובדן של הביטוי הגנטי מדכא הגידול מתרחשת במיוחד בבלוטת הערמונית, כי הצגנו transgene עם recombinase במורד הזרם של היזם פרוסין מופעל רק בתאי אפיתל הערמונית11, 12. יש לנו גם לגדל את ה-gemms שלנו להכיל את הכתבת שלנו שנקרא מקרא mT/mG, אשר משרה ביטוי חלבון פלורסנט העגבנייה בתאים חסרים היצורים הירוקים חלבון פלורסנט (gfp) ביטוי בתאים עם היצור13. בעוד המצגת של שיטה זו ותוצאות הנציג שלנו להראות GEMMs אנו לומדים במעבדה שלנו, פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי לייצר סרטן הערמונית אורגנואידים מכל מודל העכבר. עם זאת, כפי שנדונו בפירוט בסעיף התוצאות הנציג שלנו, הבחנו כי מאפייני הגידול מסוימים הם אופטימליים עבור הדור סרטן הערמונית אורגאיד.
בעשור האחרון, שיטות חדשות של תאים culturing מרקמות של מוצא אפיתל הובילו להתקדמות משמעותית ביכולתנו לדגמן מערכות איברים בתחום החוץ מבחנה14,15. המושג "3D תרבות התא" יוחסו טכניקות המעורבים בהקמת ושמירה על אורגנואידים, אשר ניתן להגדיר בדרך כלל מבנים העשויים מתאים להרכיב ארכיטקטורה משנית מונע על ידי אברי השושלת הספציפית האיברים מאפיינים16. שיטות חדשות אלה הן ברורות מתרבות התא דו-ממדית הקלאסית בתאים שאינם דורשים טרנספורמציה או התבגרות לצמיחה ארוכת טווח; כך, התרבויות 3D של תאים נורמליים ניתן להשוות לתאים חולים. זה בעל ערך רב במיוחד בחקר הסרטן שבו התרבויות נורמלי בקרת תאים בדרך כלל לא היה זמין. בנוסף, אורגנואידים בצורה ספונטנית ארכיטקטורות רקמה משנית עם סוגי תאים הבדיל כראוי, מה שהופך אותם מערכת מודל טוב יותר להבין סרטן באופן מתורבת מאשר 2D קווי התא17. המעבדה שלנו יצרה שורות 3D אורגאיד מבעיית הגידול מבודדים PCa שלנו GEMMs כדי להשלים את הנתונים שלנו vivo ולבצע ניסויים אשר לא יהיה ריאלי ב-GEMMs.
במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקולים כתובים וחזותיים עבור נקרופסי השלם של PCa GEMMs, כולל ניתוח של הערמונית ברורים העכבר נגעים גרורתית. אנו לתאר ולהראות צעד אחר צעד שיטה ליצירת אורגנואידים מפני גידולים בערמונית העכבר מבוסס על פרוטוקול שפורסם בעבר על-ידי Drost et al. עבור הנובעות אורגנואידים מרקמת הערמונית נורמלי עכבר אפיתל18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:680px;" width="680">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">0.25 % Trypsin+2.21 mM EDTA</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-053</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">1 1/4 in, 23 gauge, disposable syringe needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">Z192430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">10 % neutral buffered formalin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">32 % paraformaldehyde</td>
			<td style="width:177px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">A83-01</td>
			<td style="width:177px;">MedChemExpress</td>
			<td style="width:119px;">HY-10432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Advanced DMEM/F12+++</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Analytical balance</td>
			<td style="width:177px;">Mettler Toledo</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30216623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">B27 (50X)</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Collagenase II</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Dissecting Board</td>
			<td style="width:177px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">36-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:217px;">EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10</td>
			<td style="width:177px;">Manufactured by Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory</td>
			<td style="width:167px;">Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">human recombinant Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:177px;">PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">N-Acetyl-L-Cysteine</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Precision balance</td>
			<td style="width:177px;">Mettler Toledo</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30216561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Scalpel #23</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">504176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Scalpel Handle #7, 16 cm</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">500238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Single-edge carbon razor blade</td>
			<td style="width:177px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">504489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Y-276632 (Rock Inhibitor)</td>
			<td style="width:177px;">APExBIO</td>
			<td style="width:119px;">A3008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of tumor organoids from genetically engineered mouse models of prostate cancer

שיטות המבוססות על הומוולוגי מחדש לשנות גנים יש לקידום משמעותי מחקר ביולוגי. מודלים של עכברים מהונדסים גנטית (GEMMs) הם שיטה קפדנית לחקר התפתחות היונקים והמחלות. המעבדה שלנו פיתחה מספר GEMMs של סרטן הערמונית (PCa) כי חוסר הבעה של אחד או מספר גנים מדכא הגידול באמצעות אתר ספציפי-loxP recombinase מערכת ומקדם הערמונית ספציפי. במאמר זה, אנו מתארים את השיטה שלנו נקרופסי של אלה PCa GEMMs, בעיקר התמקדות בניתוח של גידולים בערמונית העכבר. שיטות חדשות שפותחו במהלך העשור האחרון הקלו את התרבות של תאים האפיתל-הנגזרים למודל מערכות איברים בתחום החוץ בשלושה מימדים. כמו כן, אנו מפרטים שיטת התרבות התא 3D כדי לייצר אורגנואידים הגידול של העכבר PCa GEMMs. טרום קלינית מחקר הסרטן נשלט על ידי תרבות התא 2d ו קו הנגזר או החולה מודלים מבע. שיטות אלה חסרות מיקרואקולוגיה הגידול, מגבלה של שימוש בטכניקות אלה במחקרים קדם-קליניים. GEMMs הם יותר מבחינה פיזיולוגית-רלוונטי להבנת tuמוריגנזה התקדמות הסרטן. התרבות האורגאידית של הגידול היא מערכת מודל מבחנה כי לכידה של ארכיטקטורת הגידול ומאפייני השושלת של התא. בנוסף, 3D שיטות תרבות התא לאפשר צמיחה של תאים נורמליים להשוואה לתרבויות תאים סרטניים, אפשרי לעתים נדירות באמצעות 2D טכניקות תרבות התא. בשילוב, השימוש בתרבות תא של GEMMs ו 3D במחקרים קדם-קליניים יש את הפוטנציאל לשפר את הבנתנו את הביולוגיה של סרטן.

הנציג תמונות נקרופסי של עכבר עם גידול הערמונית העיקרי ממולא נוזל באזור הערמונית הקדמי מוצגים באיור 2א. לעומת זאת, איור 2B, הצגת תמונות מייצגים נקרוסי של עכבר עם גידול מוצק גדול הערמונית העיקרי שבהם אזורי הערמונית בודדים אינם זהים. תמונות ל?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer at JoVE.com

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

אנו מראים שיטה של נקרופסי וניתוח של מודלים של סרטן הערמונית העכבר, התמקדות בניתוח גידול בערמונית. פרוטוקול צעד אחר צעד עבור דור של גידול בבלוטת הערמונית העכבר מוצג גם.

הדור של אורגנואידים גידול מ מהונדסים גנטית עכבר מודלים של סרטן הערמונית

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

תרבויות אורגנואיד העכבר דומות יותר בארגון התא vivo מאשר תרבויות תאים מסורתיות. בחקר הסרטן, אורגנואידים מודל הגידול המקורי טוב יותר מאשר קווי תאים 2D והוא יכול לשמש כדי לבדוק טיפולים פוטנציאליים בסרטן במבחנה לפתח טיפולים תרופתיים חדשים. עבור חילוץ גוש en של מערכת urogenital העכבר הגברי לתפוס את כרית השומן משני צדי שלפוחית השתן ולמשוך כלפי מעלה כדי לחשוף את האשך.בזהירות לנתח כל אשך הרחק משאר האזור urogenital. הרם בעדינות את שלפוחית השתן כך שהאזור האורגניטל מוגבה יחד, וחושף את השופכה שמתחתיו. תוך החזקת שלפוחית השתן, לכוון את המספריים על החלק התחתון של הערמונית הגבית כדי להצביע על השופכה.כל אזור urogenital ישוחרר חלל הבטן. לאחר הסרת מערכת urogenital, בלוטות הלימפה האגן ממוקם מיד מאחורי מערכת urogenital משני צדי עמוד השדרה ייחשפו. כדי להסיר את בלוטות הלימפה אוריינט מדפים ישר מתחת לרקמת הלימפה ולמשוך למעלה.לאחר מכן, לתפוס את פי הטבעת עם ממטרות ישר לחתוך, מושך על פי הטבעת כדי לפענח את המעי הגס כולו ואת המעי הדק כדי לחפש נגעים גרורתיים בבלוטות הלימפה mesenteric. כאשר איליום כולו הוסר להמשיך למשוך על התריסום כדי לחשוף את הקיבה. חותכים את הוושט כדי להסיר לחלוטין את הבטן.אם נצפו נגעים גרורתיים בבלוטות הלימפה, ניתוח זהיר של צמתים אלה הרחק מהמעי לאחסון ב- PBS. כאשר הבטן הוסרה, הטחול ניתן לקצור מהצד הגבי של הבטן לאחסון ב 4% paraformaldehyde. הסר את הכבד לאחסון ב- PBS.הסר את הכליות משני צדי עמוד השדרה יחד עם כל בלוטות הלימפה הכלייתי המכיל נגעים גרורתיים. כדי לחשוף את חלל בית החזה בזהירות לחתוך את הסרעפת לאורך כלוב הצלעות. הלחץ השלילי המשתחרר בתוך חלל בית החזה יחשוף את הלב והריאות.משוך על עצם החזה כדי לפתוח את חלל בית החזה עוד יותר. סרוק את הפנים הגחוניות של חלל בית החזה לאורך כלוב הצלעות עבור נגעים גרורתיים בבלוטות הלימפה בבית החזה לצורך ניתוח אם קיים. בעודם אוחזים בעצם החזה, חותכים את כלוב הצלעות הגחוני כדי לגשת ללב ולריאות ולעצור על הלב כדי לחתוך מתחת לריאות.כדי להסיר באופן מלא את הלב והריאות בגוש לחתוך את כל כלי הדם לפני קנה הנשימה. בזהירות להעביר את הלב מבלי לפגוע ברקמת הריאה או נגעים גרורתיים ריאות לתוך מיכל של PBS. עבור ניתוח של הגידול הערמונית למקם את האזור urogenital תחת מיקרוסקופ ניתוח.השתמש בזוג מטלפים ישרים וזוג מדפים מעוגלים כדי להפוך את האזור urogenital על פני הגב שלה. אתר את אזור הערמונית הפרוקסימלי שניתן לזהות על ידי הצבע הוורוד-אדום של השופכה. לתפוס את השופכה בחוזקה כדי לאפשר מניפולציה של רקמת urogenital עם מדפים מעוגלים.אתר את הבסיס של וריכים מכונן כדי לאפשר הסרה זהירה שלהם. לאחר מכן השתמש בצד המעוקל של המדפים כדי להסיר את האגרטלים ואת כמה שיותר שומן ורקמות חיבור ככל האפשר. בעוד עדיין מחזיק בחוזקה את השופכה ואת אזור הערמונית proximal, להשתמש בזוג מספריים מחודדים עדין כדי להסיר את שלפוחית השתן מן השופכה.מחזיק את אזור הערמונית proximal ושופכה בחוזקה עם מלקחיים ישר לתפוס את אזור הערמונית לפנים עם הצד המעוקל של המלקחיים כדי למשוך בחוזקה את הרקמה מן שלפוחית השתן ואת שאר הערמונית. מניחים את רקמת הערמונית לפני הדם ב- PBS ומאתרים את אזור הערמונית הגחוני. הסר את אזור הערמונית הגחוני באותו אופן.אם ניתן להבדיל את האזור הצדדי מאזור הגב להסיר את אזור הערמונית הצדדי משני הצדדים. לאחר מכן הסירו את אזור הערמונית הגבית והצבו את אזור הערמונית הפרוקסימלי בפרפורמלדהיד 4%. לאחר הטחון, מניחים את חלקי הגידול לתוך צינור 15 מיליליטר של חיץ עיכול לעיכול של שעה וחצי עד שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס.בסוף העיכול, מעים את הרקמה המתעכלת על ידי צנטריפוגה להשליך את supernatant. תעיף את הצינור כדי לשחרר את גלולת התא. תן מחדש את התאים במיליליטר אחד של טריפסין מחומם מראש בתוספת 10 מעכבי רוק Y-27632 מיקרומולרי במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס.בסוף הדגירה triturate תרחיף הרקמה חמש פעמים עם קצה פיפטה P1000 סטנדרטי. מחזירים את הצינור לאמבט המים לתוספו חמש דקות דגירה וטריוטורציה. עבור ציפוי כיפת מטריצה לשטוף את התאים מתעכלים תשעה מיליליטר של מדיום קר, ולאחר מכן לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה.תן שימוש חוזר בתאים במיליליטר אחד של מדיום טרי לספירה. ואחרי הספירה, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה שוב. לדלל את תאי הגידול בנפח המתאים של מטריצה.בזהירות טיפה 200 microliters של פתרון תא מטריצה לתוך כל באר של 55 מעלות צלזיוס חימם צלחת שש באר. אפשר את הכיפות להתגבש בטמפרטורת החדר במשך שתי דקות לפני הנחת הצלחת במהופך באינקובטור 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. כאשר הכיפות התגבשו באופן מלא להוסיף שני מיליליטר של מדיום אורגנואיד הערמונית בתוספת אנדרוגן R1881 ומעכב רוק לכל באר.תחזיר את הצלחת לאנקובטור של תרבות התאים. תמונות ניתוח פלואורסצנטיות חושפות חלבון פלואורסצנטי ירוק, או ביטוי GFP, על ידי גידולים מוצקים בערמונית, מה שמצביע על כך שתאי הגידול מבטאים את Cre. הכבד והריאות מאותה תערוכה של בעלי חיים גידולים גרורתיים המבטאים GFP המוכיחים כי גידולים אלה מקורם בגידול הערמונית העיקרי.בלוטות הלימפה באגן מעכבר זה מבטא GFP ולא עגבניות, המציין כי גידול גרורתי זה עקף את בלוטות הלימפה ולא נשאר רקמה נורמלית. ביום אחד של אורגנואידים קטנים תרבות שנוצר גידול ערמונית מוצקה מתחילים להיווצר עם שני תאים עגבניות GFP-ביטוי נוכח בתרבות האורגנואיד הגידול. ביום השביעי ומעבר כאשר האורגנואידים גידול הערמונית נוצרו באופן מלא עם זאת, האורגנואידים מבטאים GFP, אבל לא עגבניות, מה שמרמז כי האורגנואידים מקורם בתאי גידול המבטאים Cre ולא מתאים אפיתל נורמליים.ביום הראשון לתרבות האורגנואידים הקטנים הנוצרים מגידול ערמונית מלא בנוזלים, הן תאים מבטאי עגבניות והן תאים מבטאי GFP נמצאים בתרבות האורגנואידית. אורגנואידים מגידולי ערמונית מלאים בנוזלים מבטאים GFP או עגבניות ביום השביעי ומעבר לו, מה שמצביע על כך שהאיברנואידים נוצרו מתאים שאינם מבטאים את Cre. כדי להישאר בכיוון בעת קצירת רקמת הערמונית, להיות מודעים לשלפוחית השתן ותצורות השופכה בכל עת.לאחר הדור שלהם האורגנואידים יכולים לשמש יישומי הדמיה, ניתוח ביולוגיה מולקולרית ומסכי סמים.

Research

JoVE Journal

Genetics

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

דור של כרומטין יליד Immunoprecipitation רצף ספריות לניתוח צפיפות נוקלאוזום

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

הדור של הגנום כולו כרומטין קונפורמציה לכידת ספריות מעוברים דרוזופילה בחוזקה בשלבים המוקדמים

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

סימולטני וידאו-EEG-אק ג ניטור כדי לזהות Neurocardiac בתפקוד במודלים של העכבר של אפילפסיה

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

זיהוי של אירועי רקומבינציה הומולוגית בתאי גזע עובריים בעכבר באמצעות סופג הדרומי ואת תגובת שרשרת פולימראזית

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

הדור של סרטן התא שיבוטים כדי להמחיש Telomeric המכילים חוזר RNA טרה הביע מ טלומר יחיד בתאים חיים

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

השתלת השתלות מהונדסים של הנדסה עצבית בVivo לימודי נוירוארכיטקטורה

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 ריבונואופפרוטאין-תיווך מדויק לעריכה גנטית על ידי אלקטרופורציה

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

השימוש של העכבר בתאי סרטן הגידול בתוך שיטת הפלישה מחוץ למבחנה כמדד של התנהגות התא אונגניים

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level

ה-RNA רצף הדור הבא וצינור ביואינפורמטיקה לזיהוי קו מבוטא-1s ברמה הספציפית לוקוס

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and ...