Name: generation of tumor organoids from genetically engineered mouse models of prostate cancer
Uploaded: 2019-06-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer at JoVE.com

लेखकस्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय में केल्विन कू प्रयोगशाला को धन्यवाद देना चाहते हैं कि एचईके293 कोशिकाओं को या तो हा-माउस नोगिन-एफसी या हा-माउस Rspo1-Fc के साथ stably transfected प्रदान करने के लिए। हम भी हमें अपनी प्रयोगशाला में फ्लोरोसेंट विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करने की अनुमति के लिए डॉ डीन तांग धन्यवाद देना चाहूंगा. यह काम CA179907 द्वारा D.W.G. के लिए राष्ट्रीय कैंसर संस्थान से समर्थित किया गया था. Roswell पार्क व्यापक कैंसर केंद्र में साझा संसाधनों स्वास्थ्य कैंसर केंद्र सहायता अनुदान CA016056 के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित थे.

यहाँ वर्णित पशु प्रक्रियाओं प्रयोगशाला पशु संसाधन विभाग में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के अनुमोदन के साथ प्रदर्शन किया गया, Roswell पार्क व्यापक कैंसर केंद्र, भैंस, न्यूयॉर्क.
नोट:...

<ol>
	<li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altering+the+genome+by+homologous+recombination.">Altering the genome by homologous recombination.</a> Science. 244 (4910), 1288-1292 (1989).</li><li>Furth, P. 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D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Simian, M., Bissell, M. 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(21), 49-58 (1998).</li><li>Dardenne, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Myc+Induces+an+EZH2-Mediated+Transcriptional+Program+Driving+Neuroendocrine+Prostate+Cancer.">N-Myc Induces an EZH2-Mediated Transcriptional Program Driving Neuroendocrine Prostate Cancer.</a> Cancer Cell. 30 (4), 563-577 (2016).</li><li>Blattner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPOP+Mutation+Drives+Prostate+Tumorigenesis+In+Vivo+through+Coordinate+Regulation+of+PI3K/mTOR+and+AR+Signaling.">SPOP Mutation Drives Prostate Tumorigenesis In Vivo through Coordinate Regulation of PI3K/mTOR and AR Signaling.</a> Cancer Cell. 31 (3), 436-451 (2017).</li><li>Agarwal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Different+Classes+of+Luminal+Progenitor+Cells+within+Prostate+Tumors.">Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors.</a> Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).</li></ol>

प्रोस्टेट ट्यूमर विच्छेदन और organoid पीढ़ी के लिए प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम गैर-प्रोस्टेट ऊतक को हटाना और माउस प्रोस्टेट ट्यूमर के ठीक विच्छेदन कैंसर organoids के इष्टतम पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण ...

1980 के दशक के अंत से, समजात पुनर्संयोजन द्वारा जीनों को बदलने की क्षमता ने जैविक प्रणालियों1के अध्ययन को बहुत उन्नत किया है. प्रेरक, ऊतक-, या सेल-विशिष्ट promotor सिस्टम और साइट-विशिष्ट recombinases, जैसे Cre-loxP, दोनों लौकिक और स्थानिक रूप से आनुवंशिक संशोधनों पर नियंत्रण की सुविधा के द्वारा उन्नत आनुवंशिक अध्ययन किया है2,3, 4. इन आनुवंशिक रणनीतियों के संयोजन ने प्रायोगिक मॉडल प्रणालियों5,6,7की एक विस्तृत सरणी बनाई है .
आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (GEMMs) कैसे व्यक्तिगत जीन या जीन के समूहों स्तनधारी विकास और रोग को प्रभावित करने का आकलन करने के लिए एक अभिन्न उपकरण हैं. पूर्व नैदानिक कैंसर अनुसंधान में, GEMMs कैंसर के विकास, प्रगति, और उपचार8का अध्ययन करने के लिए सबसे अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक और कठोर विधि हैं। हमारी प्रयोगशाला पैदा करने और कैंसर GEMMs की विशेषता में माहिर हैं.
संयुक्त राज्य अमेरिका में पुरुषों के बीच सबसे उच्च निदान गैर-cutaneous कैंसर प्रोस्टेट कैंसर (PCa) है. पीसीए के साथ रोगियों के बहुमत कम जोखिम रोग और जीवित रहने की उच्च संभावना है, लेकिन अस्तित्व की दर काफी गिरावट जब रोग उन्नत चरणों में निदान किया जाता है या यदि लक्षित हार्मोनल चिकित्सा आक्रामक, गैर इलाज पीसीए के लिए प्रगति लाती है उपप्रकार9,10. हमारी प्रयोगशाला GEMMs विकसित किया है कि एक या एक से अधिक ट्यूमर suppressor जीन के floxed alleles का उपयोग. पुनर्संयोजन और ट्यूमर suppressor जीन अभिव्यक्ति की हानि प्रोस्टेट में विशेष रूप से होता है क्योंकि हम केवल प्रोस्टेट उपकला कोशिकाओं में सक्रिय probasin प्रमोटर के क्रे रिकॉमग्नेडाउन बहाव के साथ एक transgene शुरू की है11, 12.हमने अपने जीईएम को एम टी/एमजी नामक क्रे रिपोर्टर ट्रांसजीन को भी शामिल करने के लिए पैदा किया है, जो क्रे13के साथ कोशिकाओं में क्रे और ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) अभिव्यक्ति की कमी वाली कोशिकाओं में टमाटर फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है । जबकि इस विधि और हमारे प्रतिनिधि परिणाम की प्रस्तुति GEMMs हम अपनी प्रयोगशाला में अध्ययन दिखाने के लिए, इस प्रोटोकॉल किसी भी माउस मॉडल से प्रोस्टेट कैंसर organoids उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, के रूप में हमारे प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में विस्तार से चर्चा की, हमने देखा है कि कुछ ट्यूमर विशेषताओं प्रोस्टेट कैंसर organoid पीढ़ी के लिए इष्टतम हैं.
पिछले दशक में , उपकला मूल के ऊतकों से कोशिकाओं को संचित करने के नए तरीकों से इन विट्रो14,15में अंग प्रणालियों को मॉडल करने की हमारी क्षमता में महत्वपूर्ण प्रगति हुई है . शब्द "3 डी सेल संस्कृति" organoids की स्थापना और बनाए रखने में शामिल तकनीकों के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है, जो आम तौर पर कोशिकाओं से बना संरचनाओं के रूप में परिभाषित किया जा सकता है कि अंग-विशिष्ट कोशिका वंश द्वारा संचालित माध्यमिक वास्तुकला इकट्ठा विशेषताओं16| इन नए तरीकों में क्लासिक 2 D सेल संस्कृति से अलग हैं कि कोशिकाओं को दीर्घकालिक विकास के लिए परिवर्तन या अमरीकरण की आवश्यकता नहीं है; इस प्रकार, सामान्य कोशिकाओं के 3 डी संस्कृतियों रोगग्रस्त कोशिकाओं की तुलना में किया जा सकता है. यह कैंसर अनुसंधान में विशेष रूप से मूल्यवान है जहां सामान्य सेल नियंत्रण संस्कृतियों आम तौर पर उपलब्ध नहीं किया गया है. इसके अलावा, organoids स्वतः उचित रूप से विभेदित सेल प्रकार के साथ माध्यमिक ऊतक आर्किटेक्चर फार्म, उन्हें एक बेहतर मॉडल प्रणाली बनाने के लिए 2 डी सेल लाइनों17से इन विट्रो में कैंसर को समझने के लिए. हमारी प्रयोगशाला ट्यूमर मुद्दे से 3 डी organoid लाइनों बनाया गया है हमारे PCA GEMMs से अलग करने के लिए हमारे vivo डेटा में पूरक और प्रयोगों जो GEMMs में संभव नहीं होगा प्रदर्शन.
इस आलेख में, हम विशिष्ट माउस प्रोस्टेट लोब और मेटास्टैटिक घावों के विच्छेदन सहित, पीसीए GEMMs की पूरी नेक्रोप्सी के लिए लिखित और दृश्य प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हम वर्णन और माउस प्रोस्टेट ट्यूमर से organoids पैदा करने के लिए एक कदम दर कदम विधि दिखाने के एक प्रोटोकॉल के आधार पर पहले Drost एट अल द्वारा प्रकाशित सामान्य माउस प्रोस्टेट उपकला ऊतक से organoids प्राप्त करने के लिए18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:680px;" width="680">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">0.25 % Trypsin+2.21 mM EDTA</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-053</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">1 1/4 in, 23 gauge, disposable syringe needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">Z192430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">10 % neutral buffered formalin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">32 % paraformaldehyde</td>
			<td style="width:177px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">A83-01</td>
			<td style="width:177px;">MedChemExpress</td>
			<td style="width:119px;">HY-10432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Advanced DMEM/F12+++</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Analytical balance</td>
			<td style="width:177px;">Mettler Toledo</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30216623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">B27 (50X)</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Collagenase II</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Dissecting Board</td>
			<td style="width:177px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">36-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:217px;">EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10</td>
			<td style="width:177px;">Manufactured by Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory</td>
			<td style="width:167px;">Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">human recombinant Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:177px;">PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">N-Acetyl-L-Cysteine</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Precision balance</td>
			<td style="width:177px;">Mettler Toledo</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30216561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Scalpel #23</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">504176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Scalpel Handle #7, 16 cm</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">500238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Single-edge carbon razor blade</td>
			<td style="width:177px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">504489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Y-276632 (Rock Inhibitor)</td>
			<td style="width:177px;">APExBIO</td>
			<td style="width:119px;">A3008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of tumor organoids from genetically engineered mouse models of prostate cancer

जीनों को संशोधित करने के लिए समजात पुनर्संयोजन पर आधारित विधियों ने जैविक अनुसंधान को काफी आगे बढ़ाया है। आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (GEMMs) स्तनधारी विकास और रोग के अध्ययन के लिए एक कठोर तरीका है. हमारी प्रयोगशाला प्रोस्टेट कैंसर के कई GEMMs विकसित किया है (PCa) कि साइट विशेष Cre-loxP recombinase प्रणाली और एक प्रोस्टेट विशिष्ट प्रमोटर का उपयोग कर एक या कई ट्यूमर suppressor जीन की अभिव्यक्ति की कमी है. इस लेख में, हम इन पीसीए GEMMs के नेक्रोप्सी के लिए हमारी विधि का वर्णन, मुख्य रूप से माउस प्रोस्टेट ट्यूमर के विच्छेदन पर ध्यान केंद्रित. पिछले दशक में विकसित नए तरीकों ने उपकला व्युत्पन्न कोशिकाओं की संस्कृति को तीन आयामों में इन विट्रो में अंग प्रणालियों को मॉडल करने में सुविधा प्रदान की है। हम भी माउस पीसीए GEMMs से ट्यूमर organoids उत्पन्न करने के लिए एक 3 डी सेल संस्कृति विधि विस्तार. पूर्व नैदानिक कैंसर अनुसंधान 2 डी सेल संस्कृति और सेल लाइन व्युत्पन्न या रोगी व्युत्पन्न xenograft मॉडल का प्रभुत्व रहा है. इन तरीकों ट्यूमर microenvironment, पूर्व नैदानिक अध्ययन में इन तकनीकों का उपयोग करने की एक सीमा की कमी है. GEMMs ट्यूमरजनन और कैंसर की प्रगति को समझने के लिए अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक हैं। ट्यूमर organoid संस्कृति एक इन विट्रो मॉडल प्रणाली है कि ट्यूमर वास्तुकला और सेल वंश विशेषताओं recapitulates है. इसके अलावा, 3 डी सेल संस्कृति तरीकों ट्यूमर सेल संस्कृतियों की तुलना के लिए सामान्य कोशिकाओं के विकास के लिए अनुमति देते हैं, शायद ही कभी संभव 2 डी सेल संस्कृति तकनीक का उपयोग कर. संयोजन में, पूर्व नैदानिक अध्ययन में GEMMs और 3 डी सेल संस्कृति का उपयोग करने के लिए कैंसर जीव विज्ञान की हमारी समझ में सुधार करने की क्षमता है.

पूर्वकाल प्रोस्टेट क्षेत्र में एक बड़े तरल पदार्थ से भरे प्राथमिक प्रोस्टेट ट्यूमर के साथ एक माउस के प्रतिनिधि नेक्रोप्सी छवियों चित्र 2एमें दिखाए गए हैं। इसके विपरीत, चित्?...

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Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

हम नेक्रोप्सी और माउस प्रोस्टेट कैंसर मॉडल के विच्छेदन के लिए एक विधि दिखाने के लिए, प्रोस्टेट ट्यूमर विच्छेदन पर ध्यान केंद्रित. माउस प्रोस्टेट ट्यूमर organoids की पीढ़ी के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल भी प्रस्तुत किया है.

प्रोस्टेट कैंसर के आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल से ट्यूमर organoids की पीढ़ी

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

माउस ऑर्गेनॉइड संस्कृतियां पारंपरिक सेल संस्कृतियों की तुलना में वीवो सेल संगठन में अधिक निकटता से मिलती-जुलती हैं। कैंसर अनुसंधान में, ऑर्गेनॉइड मूल ट्यूमर को 2D सेल लाइनों से बेहतर मॉडल करते हैं और नई दवा उपचार विकसित करने के लिए विट्रो में संभावित कैंसर उपचारों का परीक्षण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। पुरुष माउस यूरोजेनिटल सिस्टम के एन ब्लॉक निष्कर्षण के लिए मूत्राशय के दोनों ओर वसा पैड को समझते हैं और अंडकोष को बेनकाब करने के लिए ऊपर की ओर खींचते हैं।प्रत्येक अंडकोष को यूरोजेनिटल क्षेत्र के बाकी हिस्सों से सावधानीपूर्वक विच्छेदन करें। धीरे से मूत्राशय उठाएं ताकि मूत्राशय क्षेत्र एक साथ ऊंचा हो, नीचे मूत्रमार्ग को उजागर करे। मूत्राशय को पकड़ते समय, मूत्रमार्ग को चीरने के लिए पृष्ठीय प्रोस्टेट के नीचे के खिलाफ कैंची उन्मुख करें।पूरे यूरोजेनिटल क्षेत्र को पेट की गुहा से छोड़ा जाएगा। यूरोजेनिटल सिस्टम को हटाने के बाद, यूरोजेनिटल सिस्टम के तुरंत पीछे और रीढ़ की हड्डी के दोनों तरफ तैनात पेल्विक लिम्फ नोड्स उजागर हो जाएंगे। लिम्फ नोड्स को हटाने के लिए लिम्फ ऊतक के नीचे सीधे संदंश उन्मुख और ऊपर खींच।इसके बाद, सीधे संदंश और कटौती के साथ मलाशय को समझें, पूरे पेट और छोटी आंत को जानने के लिए मलाशय पर खींच लें ताकि मेसेंटेरिक लिम्फ नोड्स में मेटास्टैटिक घावों की तलाश की जा सके। जब पूरे इलियम को हटा दिया गया है पेट को बेनकाब करने के लिए डुओडेनम पर खींचना जारी रखें। पेट को पूरी तरह से निकालने के लिए घेघा काट लें।यदि लिम्फ नोड्स में किसी भी मेटास्टैटिक घावों को देखा जाता है, तो पीबीएस में भंडारण के लिए आंत से इन नोड्स को सावधानी से काटना। जब पेट को हटा दिया गया हो, तो तिल्ली को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में भंडारण के लिए पेट के पृष्ठीय पक्ष से काटा जा सकता है। पीबीएस में स्टोरेज के लिए लिवर निकालें।मेटास्टैटिक घावों वाले किसी भी गुर्दे लिम्फ नोड्स के साथ रीढ़ के दोनों तरफ से गुर्दे निकालें। वक्ष गुहा को बेनकाब करने के लिए ध्यान से रिब पिंजरे के साथ डायाफ्राम काट दिया। वक्ष गुहा के भीतर जारी नकारात्मक दबाव दिल और फेफड़ों का पर्दाफाश करेगा।वक्ष गुहा को आगे खोलने के लिए उरोस्थि पर खींचें। यदि मौजूद है तो विच्छेदन के लिए छाती लिम्फ नोड्स में मेटास्टैटिक घावों के लिए रिब पिंजरे के साथ वक्ष गुहा के वेंट्रल चेहरे को स्कैन करें। जबकि अभी भी उरोस्थि पकड़े, दूर वेंट्रल रिब पिंजरे में कटौती करने के लिए दिल और फेफड़ों का उपयोग और दिल पर खींचने के लिए फेफड़ों के नीचे कटौती ।पूरी तरह से दिल और फेफड़ों को हटाने के लिए ब्लॉक श्वासनली में पूर्वकाल रक्त वाहिकाओं के सभी कटौती । ध्यान से फेफड़ों के ऊतकों या फेफड़ों के मेटास्टैटिक घावों को नुकसान पहुंचाए बिना दिल को पीबीएस के कंटेनर में स्थानांतरित करें। प्रोस्टेट ट्यूमर के विच्छेदन के लिए एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत यूरोजेनिटल क्षेत्र जगह है।अपने पृष्ठीय सतह पर यूरोजेनिटल क्षेत्र को फ्लिप करने के लिए सीधे संदंश की एक जोड़ी और घुमावदार संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें। मूत्रमार्ग के गुलाबी-लाल रंग से पहचाने जा सकने वाले समीपस्थ प्रोस्टेट क्षेत्र का पता लगाएं। घुमावदार संदंश के साथ यूरोजेनिटल ऊतक में हेरफेर की अनुमति देने के लिए मूत्रमार्ग को मजबूती से समझें।उनके सावधानीपूर्वक हटाने की अनुमति देने के लिए मौलिक वेसिकल्स के आधार का पता लगाएं। फिर संदंश के घुमावदार पक्ष का उपयोग करने के लिए वास deferens और जितना संभव हो फैटी और संयोजी ऊतक को दूर करने के लिए । हालांकि अभी भी दृढ़ता से मूत्रमार्ग और समीपस्थ प्रोस्टेट क्षेत्र पकड़, ठीक नुकीली कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करने के लिए मूत्राशय मूत्राशय से हटा दें ।समीपस्थ प्रोस्टेट क्षेत्र और मूत्रमार्ग को सीधे संदंश के साथ दृढ़ता से धारण करना पूर्ववर्ती प्रोस्टेट क्षेत्र को संदंश के घुमावदार पक्ष के साथ दृढ़ता से मूत्राशय और बाकी प्रोस्टेट से दूर खींचने के लिए समझता है। पूर्वकाल प्रोस्टेट ऊतक को पीबीएस में रखें और वेंट्रल प्रोस्टेट क्षेत्र का पता लगाएं। वेंट्रल प्रोस्टेट क्षेत्र को उसी तरीके से हटा दें।यदि पार्श्व क्षेत्र को पृष्ठीय क्षेत्र से प्रतिष्ठित किया जा सकता है तो दोनों पक्षों पर पार्श्व प्रोस्टेट क्षेत्र को हटा दें। फिर पृष्ठीय प्रोस्टेट क्षेत्र को हटा दें और समीपस्थ प्रोस्टेट क्षेत्र को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में रखें। कीमा बनाने के बाद, ट्यूमर के टुकड़ों को पाचन बफर की 15 मिलीलीटर ट्यूब में डेढ़ से दो घंटे के पाचन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।पाचन के अंत में, शतचंडी द्वारा पचा ऊतक तलछट और सुपरनेट त्यागें। सेल गोली को ढीला करने के लिए ट्यूब को झटका दें। पूर्व गर्म ट्रिप्सिन के एक मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें 10 माइक्रोमोलर वाई-27632 रॉक अवरोधक के साथ पांच मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पूरक।इनक्यूबेशन के अंत में एक मानक P1000 पिपेट टिप के साथ ऊतक घोल पांच बार ट्राइटेट करें। एक अतिरिक्त पांच मिनट इनक्यूबेशन और त्रिनाश के लिए पानी स्नान करने के लिए ट्यूब वापस । मैट्रिक्स गुंबद चढ़ाना के लिए ठंडे माध्यम के नौ मिलीलीटर में पचा कोशिकाओं को धोने, तो अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा ।मतगणना के लिए ताजा माध्यम के एक मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। और गिनती के बाद, एक बार फिर से अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें। मैट्रिक्स की उचित मात्रा में ट्यूमर कोशिकाओं को पतला करें।ध्यान से एक ५५ डिग्री सेल्सियस गर्म छह अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में मैट्रिक्स सेल समाधान के २०० माइक्रोलीटर ड्रॉप । गुंबदों को 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्लेट को उल्टा रखने से पहले दो मिनट के लिए कमरे के तापमान पर जमना की अनुमति दें। जब गुंबदों ने पूरी तरह से जम कर प्रोस्टेट ऑर्गेनॉइड माध्यम के दो मिलीलीटर को एंड्रोजन आर1881 और रॉक अवरोधक के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ा है।प्लेट को सेल कल्चर इनक्यूबेटर में लौटाएं। फ्लोरोसेंट विच्छेदन छवियों ठोस प्रोस्टेट ट्यूमर द्वारा हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन, या GFP अभिव्यक्ति, पता चलता है, यह दर्शाता है कि ट्यूमर कोशिकाओं Cre व्यक्त करते हैं । एक ही जानवर प्रदर्शनी मेटास्टैटिक ट्यूमर से जिगर और फेफड़ों का प्रदर्शन है कि इन ट्यूमर प्राथमिक प्रोस्टेट ट्यूमर से उत्पन्न व्यक्त करते हैं।इस माउस से श्रोणि लिम्फ नोड GFP व्यक्त करता है और टमाटर नहीं, यह दर्शाता है कि यह मेटास्टैटिक ट्यूमर लिम्फ नोड से आगे निकल गया है और कोई सामान्य ऊतक नहीं रहता है। संस्कृति के दिन एक ठोस प्रोस्टेट ट्यूमर से उत्पन्न छोटे ऑर्गेनॉइड ट्यूमर ऑर्गेनॉइड संस्कृति में मौजूद टमाटर और जीएफपी-एक्सप्रेसिंग कोशिकाओं दोनों के साथ बनने लगते हैं। सात दिन तक और परे जब प्रोस्टेट ट्यूमर ऑर्गेनॉइड पूरी तरह से गठन किया है, लेकिन ऑर्गेनॉइड GFP व्यक्त करते हैं, लेकिन टमाटर नहीं, सुझाव है कि ऑर्गेनॉइड क्रे-व्यक्त ट्यूमर कोशिकाओं से उत्पन्न हुआ है और सामान्य एपिथेलियल कोशिकाओं से नहीं ।तरल पदार्थ से भरे प्रोस्टेट ट्यूमर से उत्पन्न छोटे ऑर्गेनॉइड की संस्कृति के दिन टमाटर और जीएफपी-एक्सप्रेसिंग कोशिकाएं ऑर्गेनॉइड संस्कृति के भीतर मौजूद हैं। तरल पदार्थ से भरे प्रोस्टेट ट्यूमर से ऑर्गेनॉइड या तो जीएफपी या टमाटर को सात दिन और उससे आगे व्यक्त करते हैं, यह दर्शाता है कि उन कोशिकाओं से गठित ऑर्गेनॉइड जो क्रे व्यक्त नहीं करते हैं । प्रोस्टेट ऊतक की कटाई करते समय उन्मुख रहने के लिए, मूत्राशय और मूत्रमार्ग की स्थिति के बारे में हर समय जागरूक रहें।उनकी पीढ़ी के बाद ऑर्गेनॉइड का उपयोग इमेजिंग अनुप्रयोगों, आणविक जीव विज्ञान विश्लेषण और दवा स्क्रीन में किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Genetics

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Nucleosome घनत्व विश्लेषण के लिए देशी क्रोमेटिन Immunoprecipitation अनुक्रमण पुस्तकालयों की पीढ़ी

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

जीनोम की पीढ़ी चौड़ा क्रोमेटिन अनुरूप कब्जा पुस्तकालयों जल्दी Drosophila भ्रूण का मंचन

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

एक साथ वीडियो-ईईजी-ईसीजी निगरानी के लिए माउस में Neurocardiac शिथिलता की पहचान मिर्गी के मॉडल

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

माउस भ्रूण में मुताबिक़ पुनर्संयोजन की घटनाओं की पहचान स्टेम दक्षिणी सोख्ता और पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया का उपयोग कोशिकाओं

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

कैंसर सेल क्लोन की पीढ़ी Telomeric दोहराने-युक्त आरएनए टेरा कल्पना करने के लिए जीवित कोशिकाओं में एक एकल Telomere से व्यक्त

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

विवो न्यूरोआर्किटेक्चर स्टडीज के लिए इंजीनियर न्यूरोनल प्रवर्तकों का इंट्रावेंट्रिकल ट्रांसप्लांटेशन

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoप्रोटीन-मध्यस्थ सटीक जीन संपादन द्वारा ट्यूब इलेक्ट्रोपोरेशन

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

एक इन विट्रो आक्रमण परख में माउस मैमरी ट्यूमर कोशिकाओं का उपयोग Oncogenic सेल व्यवहार के एक उपाय के रूप में

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level

आरएनए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण और एक Bioसूचनातंत्र पाइप लाइन व्यक्त की पहचान करने के लिए-Locus-विशिष्ट स्तर पर 1s

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and ...