Name: generation of tumor organoids from genetically engineered mouse models of prostate cancer
Uploaded: 2019-06-13T14:00:00
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Gli autori desiderano ringraziare il Calvin Kuo Laboratory della Stanford University per aver fornito alle cellule HEK293 catetreganti trascate sia il topo HA Noggin-Fc che l'HA-mouse Rspo1-Fc. Vorremmo anche ringraziare il dottor Dean Tang per averci permesso di accedere al microscopio di dissezione fluorescente nel suo laboratorio. Questo lavoro è stato supportato da CA179907 a D.W.G. dal National Cancer Institute. Le risorse condivise del Roswell Park Comprehensive Cancer Center sono state supportate dal National Institutes of Health Cancer Center Support Grant CA016056.

Le procedure sugli animali qui descritte sono state eseguite con l'approvazione dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso il Department of Laboratory Animal Resources, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, New York.
 NOT:</</c0> I topi maschi da sezionare per isolare prostati o tumori alla prostata per la generazione di organoidi dovrebbero aver almeno raggiunto l'età della maturità sessuale - circa 8-10 settimane di età. Età specifiche dei topi p...

<ol>
	<li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altering+the+genome+by+homologous+recombination.">Altering the genome by homologous recombination.</a> Science. 244 (4910), 1288-1292 (1989).</li><li>Furth, P. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+prostate:+a+basic+anatomical+and+histological+guideline.">The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline.</a> Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).</li><li>Callis, G., Sterchi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decalcification+of+Bone:+Literature+Review+and+Practical+Study+of+Various+Decalcifying+Agents,+Methods,+and+Their+Effects+on+Bone+Histology.">Decalcification of Bone: Literature Review and Practical Study of Various Decalcifying Agents, Methods, and Their Effects on Bone Histology.</a> The Journal of Histotechnology. 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Passi critici all'interno del protocollo per la dissezione del tumore alla prostata e la generazione di organoidi La rimozione del tessuto non prostatico e la dissezione fine del tumore alla prostata del topo è cruciale per la generazione ottimale di organoidi tumorali poiché sia le cellule epiteliali non prostata che le normali cellule epiteliali della prostata genereranno organoidi. Per i tumori della prostata solida in particolare, è fondamentale isolare aree di tumore vitale per rimuovere la co...

Dalla fine degli anni '80, la capacità di alterare i geni con la ricombinazione omologa ha notevolmente avanzato lo studio dei sistemi biologici1. Sistemi promotori inducibili, tissutali o specifici delle cellule e ricombinazioni site-specific, come Cre-loxP, ha avanzato studi genetici facilitando il controllo sulle modifiche genetiche sia dal punto di vista temporale che spaziale2,3, 4. La combinazione di queste strategie genetiche ha creato una vasta gamma di sistemi di modelli sperimentali5,6,7.
I modelli murini geneticamente progettati (GEMM) sono uno strumento integrale per valutare in che modo i singoli geni o gruppi di geni influenzano lo sviluppo e la malattia dei mammiferi. Nella ricerca pre-clinica sul cancro, le GEMM sono il metodo più fisiologicamente rilevante e rigoroso per studiare lo sviluppo, la progressione e il trattamento del cancro8. Il nostro laboratorio è specializzato nella generazione e nella caratterizzazione delle GEMM tumorali.
Il cancro non cutaneo più altamente diagnosticato tra gli uomini negli Stati Uniti è il cancro alla prostata (PCa). La maggior parte dei pazienti con PCa ha una malattia a basso rischio e un'elevata probabilità di sopravvivenza, ma i tassi di sopravvivenza diminuiscono drasticamente quando la malattia viene diagnosticata in stadi avanzati o se la terapia ormonale mirata induce la progressione a PCa aggressiva e non curabile sottotipi9,10. Il nostro laboratorio ha sviluppato GEMM che utilizzano alleli sxed di uno o più geni soppressori tumorali. La ricombinazione e la perdita dell'espressione genica del soppressore tumorale si verifica specificamente nella prostata perché abbiamo introdotto un transgene con Cre ricombinase a valle del promotore probasinattivato attivato solo nelle cellule epiteliali prostata11, 12.Abbiamo anche allevato le nostre GEMM per contenere un Transgene Cre reporter chiamato mT/mG, che induce l'espressione delle proteine fluorescenti di pomodoro in cellule prive di Cre e proteina fluorescente verde (GFP) espressione nelle cellule con Cre13. Mentre la presentazione di questo metodo e i nostri risultati rappresentativi mostrano gemm che studiamo nel nostro laboratorio, questo protocollo può essere utilizzato per generare organoidi di cancro alla prostata da qualsiasi modello murino. Tuttavia, come discusso in dettaglio nella nostra sezione dei risultati rappresentativi, abbiamo osservato che alcune caratteristiche del tumore sono ottimali per la generazione di organoidi per il cancro alla prostata.
Nell'ultimo decennio, nuovi metodi di coltura delle cellule dai tessuti di origine epiteliale hanno portato a progressi significativi nella nostra capacità di modellare i sistemi di organi in vitro14,15. Il termine "coltura cellulare 3D" è stato attribuito alle tecniche coinvolte nella definizione e manutenzione degli organoidi, che possono essere generalmente definite come strutture costituite da cellule che assemblano l'architettura secondaria guidata dal lignaggio cellulare specifico dell'organo caratteristiche16. Questi nuovi metodi sono distinti dalla cultura cellulare 2D classica in quanto le celle non richiedono trasformazione o immortalizzazione per la crescita a lungo termine; pertanto, le colture 3D delle cellule normali possono essere confrontate con le cellule malate. Ciò è particolarmente utile nella ricerca sul cancro, dove le normali colture di controllo cellulare non sono state in genere disponibili. Inoltre, gli organoidi formano spontaneamente architetture di tessuti secondari con tipi di cellule opportunamente differenziate, rendendoli un sistema modello migliore per comprendere il cancro in vitro rispetto alle linee cellulari 2D17. Il nostro laboratorio ha creato linee organoidi 3D da un problema tumorale isolato dai nostri GEMM PCa per integrare i nostri dati in vivo ed eseguire esperimenti che non sarebbero fattibili nei GEMM.
In questo articolo, presentiamo protocolli scritti e visivi per la necropsia completa delle PCa GEMMs, tra cui la dissezione di lobi della prostata del topo distinti e lesioni metastatiche. Descriviamo e mostriamo un metodo passo-passo per generare organoidi da tumori della prostata del topo sulla base di un protocollo precedentemente pubblicato da Drost et al. per la derivazione di organoidi dal normale tessuto epiteliale della prostata del topo18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:680px;" width="680">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">0.25 % Trypsin+2.21 mM EDTA</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-053</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">1 1/4 in, 23 gauge, disposable syringe needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">Z192430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">10 % neutral buffered formalin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">32 % paraformaldehyde</td>
			<td style="width:177px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">A83-01</td>
			<td style="width:177px;">MedChemExpress</td>
			<td style="width:119px;">HY-10432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Advanced DMEM/F12+++</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Analytical balance</td>
			<td style="width:177px;">Mettler Toledo</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30216623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">B27 (50X)</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Collagenase II</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Dissecting Board</td>
			<td style="width:177px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">36-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:217px;">EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10</td>
			<td style="width:177px;">Manufactured by Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory</td>
			<td style="width:167px;">Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">human recombinant Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:177px;">PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">N-Acetyl-L-Cysteine</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Precision balance</td>
			<td style="width:177px;">Mettler Toledo</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30216561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Scalpel #23</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">504176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Scalpel Handle #7, 16 cm</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">500238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Single-edge carbon razor blade</td>
			<td style="width:177px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">504489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Y-276632 (Rock Inhibitor)</td>
			<td style="width:177px;">APExBIO</td>
			<td style="width:119px;">A3008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of tumor organoids from genetically engineered mouse models of prostate cancer

I metodi basati sulla ricombinazione omologa per modificare i geni hanno notevolmente favorito la ricerca biologica. I modelli murini geneticamente ingegnerizzati (GEMM) sono un metodo rigoroso per studiare lo sviluppo e la malattia dei mammiferi. Il nostro laboratorio ha sviluppato diverse GEMM di cancro alla prostata (PCa) che non sono espressione di uno o più geni soppressori tumorali utilizzando il sistema ricombinase Cre-loxP site-specific e un promotore specifico della prostata. In questo articolo, descriviamo il nostro metodo per la necropsia di questi GEMM PCa, concentrandoci principalmente sulla dissezione dei tumori della prostata del topo. Nuovi metodi sviluppati nell'ultimo decennio hanno facilitato la coltura delle cellule derivate epiteliali per modellare i sistemi di organi in vitro in tre dimensioni. Inoltre, dettagliamo un metodo di coltura cellulare 3D per generare organoidi tumorali dai GEMM PCa del topo. La ricerca pre-clinica sul cancro è stata dominata dalla coltura cellulare 2D e dai modelli di xenotrapianto derivati dalla linea cellulare o derivati dal paziente. Questi metodi mancano di microambiente tumorale, una limitazione dell'utilizzo di queste tecniche negli studi pre-clinici. Le GEMM sono più rilevanti dal livello fisiologico per comprendere la tumorigenesi e la progressione del cancro. La coltura organoide tumorale è un sistema di modelli in vitro che riassume l'architettura del tumore e le caratteristiche di lignaggio cellulare. Inoltre, i metodi di coltura cellulare 3D consentono la crescita di cellule normali per il confronto con le colture cellulari tumorali, raramente possibile utilizzando tecniche di coltura cellulare 2D. In combinazione, l'uso delle GEMM e della coltura cellulare 3D negli studi preclinici ha il potenziale per migliorare la nostra comprensione della biologia del cancro.

Le immagini di necropsia rappresentative di un topo con un grande tumore alla prostata primario pieno di liquidi nella regione della prostata anteriore sono mostrate nella Figura 2A. Al contrario, Figura 2B, mostra immagini necroscopia rappresentative di un topo con un grande tumore alla prostata primaria solido per il quale le singole regioni della prostata sono indistinguibili. Le immagini di dissezione fluorescente mostrano l...

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Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Mostriamo un metodo per la necropsia e la dissezione dei modelli di cancro alla prostata del topo, concentrandosi sulla dissezione del tumore alla prostata. Viene inoltre presentato un protocollo passo-passo per la generazione di organoidi tumorali della prostata del topo.

Generazione di organidi tumorali da modelli murini geneticamente ingegnerizzati del cancro alla prostata

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

Le colture organoidi del topo assomigliano più all'organizzazione cellulare in vivo che alle colture cellulari tradizionali. Nella ricerca sul cancro, gli organoidi modellano il tumore originale meglio delle linee cellulari 2D e possono essere utilizzati per testare potenziali terapie oncologiche in vitro per sviluppare nuovi trattamenti farmacologici. Per l'estrazione in blocco del sistema urogenitale del topo maschio afferrare il cuscinetto grasso su entrambi i lati della vescica e tirare verso l'alto per esporre il testicolo.Sezionare con cura ogni testicolo lontano dal resto della regione urogenitale. Sollevare delicatamente la vescica in modo che la regione urogenitale sia elevata insieme, esponendo l'uretra sottostante. Tenendo la vescica, orientare le forbici contro la parte inferiore della prostata dorsale per incidere l'uretra.L'intera regione urogenitale verrà rilasciata dalla cavità addominale. Dopo aver rimosso il sistema urogenitale, i linfonodi pelvici posizionati immediatamente dietro il sistema urogenitale e su entrambi i lati della colonna vertebrale saranno esposti. Per rimuovere i linfonodi orientare le forze dritte sotto il tessuto linfatico e tirare su.Successivamente, afferrare il retto con le forcep dritte e tagliare, tirando su sul retto per dipanare l'intero colon e l'intestino tenue per cercare lesioni metastatiche nei linfonodi mesenterici. Quando l'intero ilio è stato rimosso continuare a tirare sul duodeno per esporre lo stomaco. Tagliare l'esofago per rimuovere completamente lo stomaco.Se si osservano lesioni metastatiche nei linfonodi, sezionare attentamente questi nodi lontano dall'intestino per la conservazione in PBS. Quando lo stomaco è stato rimosso, la milza può essere raccolta dal lato dorsale dell'addome per la conservazione in paraformaldeide al 4%. Rimuovere il fegato per la conservazione in PBS.Rimuovere i reni da entrambi i lati della colonna vertebrale insieme a eventuali linfonodi renali contenenti lesioni metastatiche. Per esporre la cavità toracica tagliare con cura il diaframma lungo la gabbia toracica. La pressione negativa rilasciata all'interno della cavità toracica esporrà il cuore e i polmoni.Tirare su sullo sterno per aprire ulteriormente la cavità toracica. Scansionare la faccia ventrale della cavità toracica lungo la gabbia toracica alla ricerca di lesioni metastatiche nei linfonodi toracici per la dissezione, se presente. Mentre si tiene ancora lo sterno, tagliare la gabbia toracica ventrale per accedere al cuore e ai polmoni e tirare su sul cuore per tagliare sotto i polmoni.Per rimuovere completamente il cuore e i polmoni in blocco tagliare tutti i vasi sanguigni anteriori nella trachea. Trasferire con cura il cuore senza danneggiare il tessuto polmonare o le lesioni metastatiche polmonari in un contenitore di PBS. Per la dissezione del tumore alla prostata posizionare la regione urogenitale al microscopio a dissezione.Usa un paio di forcette dritte e un paio di forcette curve per capovolgere la regione urogenitale sulla sua superficie dorsale. Individuare la regione prossimale della prostata che può essere identificata dal colore rosa-rosso dell'uretra. Afferrare saldamente l'uretra per consentire la manipolazione del tessuto urogenitale con le forcelle curve.Individuare la base delle vescicole seminali per consentire la loro attenta rimozione. Quindi utilizzare il lato curvo delle forcep per rimuovere il deferente vas e il più possibile tessuto adiposo e connettivo. Pur mantenendo saldamente l'uretra e la regione prossimale della prostata, utilizzare un paio di forbici appuntite fini per rimuovere la vescica dall'uretra.Tenendo saldamente la regione prostatica prossimale e l'uretra con le flessione dritte afferrare la regione anteriore della prostata con il lato curvo delle forcep per allontanare saldamente il tessuto dalla vescica e dal resto della prostata. Posizionare il tessuto prostatico anteriore in PBS e localizzare la regione ventrale della prostata. Rimuovere la regione ventrale della prostata nello stesso modo.Se la regione laterale può essere distinta dalla regione dorsale, rimuovere la regione prostatica laterale su entrambi i lati. Quindi rimuovere la regione dorsale della prostata e posizionare la regione prossimale della prostata in paraformaldeide al 4%. Dopo aver macinato, posizionare i pezzi tumorali in un tubo di digestione da 15 millilitri per una digestione di un'ora e mezza o due ore a 37 gradi Celsius.Alla fine della digestione, sedimentare il tessuto digerito per centrifugazione e scartare il supernatante. Far scorrere il tubo per allentare il pellet cellulare. Rimescolare le cellule in un millilitro di tripsina prerimolata integrata con 10 micromolare Y-27632 ROCK inibitore per cinque minuti a 37 gradi Celsius.Alla fine dell'incubazione triturare il liquame tissutale cinque volte con una punta di pipetta P1000 standard. Riportare il tubo al bagno d'acqua per un'ulteriore incubazione e triturazione di cinque minuti. Per la placcatura a cupola a matrice lavare le cellule digerite in nove millilitri di mezzo freddo, quindi raccogliere le cellule per centrifugazione.Rimospend le cellule in un millilitro di mezzo fresco per il conteggio. E dopo aver contato, raccogli le cellule per centrifugazione ancora una volta. Diluire le cellule tumorali nel volume appropriato della matrice.Far cadere con cura 200 microlitri di soluzione di cellule matriciale in ogni pozzo di una piastra a sei pozzi riscaldata di 55 gradi Celsius. Lasciare solidificare le cupole a temperatura ambiente per due minuti prima di posizionare la piastra capovolta in un incubatore di 37 gradi Celsius per 20 minuti. Quando le cupole sono completamente solidificate aggiungere due millilitri di mezzo organoide prostatico integrati con androgeno R1881 e inibitore ROCK ad ogni pozzo.Riportare il piatto all'incubatore di coltura cellulare. Le immagini della dissezione fluorescente rivelano proteine fluorescenti verdi, o espressione GFP, da tumori solidi della prostata, indicando che le cellule tumorali esprimono Cre. Il fegato e i polmoni dello stesso animale mostrano tumori metastatici che esprimono GFP dimostrando che questi tumori hanno avuto origine dal tumore primario della prostata.Il linfonodo pelvico di questo topo esprime GFP e non Pomodoro, indicando che questo tumore metastatico ha superato il linfonodo e non rimane tessuto normale. Al primo giorno di coltura piccoli organoidi generati da un solido tumore alla prostata iniziano a formarsi con cellule che esprimono sia pomodoro che GFP presenti nella coltura organoide tumorale. Al settimo giorno e oltre, quando gli organoidi del tumore alla prostata si sono completamente formati, tuttavia, gli organoidi esprimono GFP, ma non Pomodoro, suggerendo che gli organoidi hanno avuto origine da cellule tumorali che esprimono Cre e non da normali cellule epiteliali.Il primo giorno di coltura di piccoli organoidi generati da tumore alla prostata riempito di liquidi sia le cellule che esprimono pomodoro che le cellule che esprimono la GFP sono presenti all'interno della coltura organoide. Gli organoidi dei tumori della prostata riempiti di liquidi esprimono gfp o pomodoro al settimo giorno e oltre, indicando tuttavia che gli organoidi si sono formati da cellule che non esprimono Cre. Per rimanere orientati durante la raccolta del tessuto prostatico, essere consapevoli delle posizioni della vescica e dell'uretra in ogni momento.Dopo la loro generazione gli organoidi possono essere utilizzati in applicazioni di imaging, analisi di biologia molecolare e schermi di farmaci.

Research

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