Name: generation of tumor organoids from genetically engineered mouse models of prostate cancer
Uploaded: 2019-06-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer at JoVE.com

著者らは、HAマウスのノギンFcまたはHAマウスRspo1-Fcのいずれかで安定してトランスフェクトHEK293細胞を提供してくれたスタンフォード大学のカルビン・クオ研究所に感謝したいと思います。また、彼の研究室で蛍光解剖顕微鏡にアクセスさせてくださったディーン・タン博士に感謝します。この研究は、国立がん研究所からD.W.G.にCA179907によってサポートされました。ロズウェルパーク総合癌センターの共有リソースは、国立衛生癌センター支援助成金CA016056によって支援されました。

ここに記載されている動物の手順は、ニューヨーク州バッファローのロズウェルパーク総合癌センターの実験動物資源部門で、施設動物管理および使用委員会(IACUC)の承認を得て行われました。
注:オルガノイドの生成のために前立腺または前立腺腫瘍を分離するために解剖される雄マウスは、少なくとも性的成熟の年齢に達している必要があります - 約8〜10?...

<ol>
	<li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altering+the+genome+by+homologous+recombination.">Altering the genome by homologous recombination.</a> Science. 244 (4910), 1288-1292 (1989).</li><li>Furth, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+control+of+gene+expression+in+transgenic+mice+by+a+tetracycline-responsive+promoter.">Temporal control of gene expression in transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (20), 9302-9306 (1994).</li><li>Aranda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+directionality+in+the+Cre-LoxP+site-specific+recombination+pathway.">Altered directionality in the Cre-LoxP site-specific recombination pathway.</a> Journal of Molecular Biology. 311 (3), 453-459 (2001).</li><li>Schwenk, F., Kuhn, R., Angrand, P. O., Rajewsky, K., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+and+spatially+regulated+somatic+mutagenesis+in+mice.">Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice.</a> Nucleic Acids Research. 26 (6), 1427-1432 (1998).</li><li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+mice.">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).</li><li>Goodrich, M. M., Talhouk, R., Zhang, X., Goodrich, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+approach+for+controlling+the+timing+and+order+of+engineered+mutations+in+mice.">An approach for controlling the timing and order of engineered mutations in mice.</a> Genesis. 56 (8), 23242 (2018).</li><li>Brocard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporally+controlled+site-specific+somatic+mutagenesis+in+the+mouse.">Spatio-temporally controlled site-specific somatic mutagenesis in the mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14559-14563 (1997).</li><li>Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+mouse+cancer+models:+a+maze+of+opportunities+and+challenges.">Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges.</a> Cell. 163 (1), 39-53 (2015).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2019.">Cancer statistics, 2019.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. , (2019).</li><li>Bluemn, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+Receptor+Pathway-Independent+Prostate+Cancer+Is+Sustained+through+FGF+Signaling.">Androgen Receptor Pathway-Independent Prostate Cancer Is Sustained through FGF Signaling.</a> Cancer Cell. 32 (4), 474-489 (2017).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+of+p53+and+Rb+deficiency+in+a+conditional+mouse+model+for+metastatic+prostate+cancer.">Synergy of p53 and Rb deficiency in a conditional mouse model for metastatic prostate cancer.</a> Cancer Research. 66 (16), 7889-7898 (2006).</li><li>Ku, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rb1+and+Trp53+cooperate+to+suppress+prostate+cancer+lineage+plasticity,+metastasis,+and+antiandrogen+resistance.">Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance.</a> Science. 355 (6320), 78-83 (2017).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions.">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+cancer+models+in+tumor+biology.">Spherical cancer models in tumor biology.</a> Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li><li>Oliveira, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+prostate:+a+basic+anatomical+and+histological+guideline.">The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline.</a> Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).</li><li>Callis, G., Sterchi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decalcification+of+Bone:+Literature+Review+and+Practical+Study+of+Various+Decalcifying+Agents,+Methods,+and+Their+Effects+on+Bone+Histology.">Decalcification of Bone: Literature Review and Practical Study of Various Decalcifying Agents, Methods, and Their Effects on Bone Histology.</a> The Journal of Histotechnology. (21), 49-58 (1998).</li><li>Dardenne, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Myc+Induces+an+EZH2-Mediated+Transcriptional+Program+Driving+Neuroendocrine+Prostate+Cancer.">N-Myc Induces an EZH2-Mediated Transcriptional Program Driving Neuroendocrine Prostate Cancer.</a> Cancer Cell. 30 (4), 563-577 (2016).</li><li>Blattner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPOP+Mutation+Drives+Prostate+Tumorigenesis+In+Vivo+through+Coordinate+Regulation+of+PI3K/mTOR+and+AR+Signaling.">SPOP Mutation Drives Prostate Tumorigenesis In Vivo through Coordinate Regulation of PI3K/mTOR and AR Signaling.</a> Cancer Cell. 31 (3), 436-451 (2017).</li><li>Agarwal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Different+Classes+of+Luminal+Progenitor+Cells+within+Prostate+Tumors.">Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors.</a> Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).</li></ol>

前立腺腫瘍解剖およびオルガノイド生成のためのプロトコル内の重要なステップ 非前立腺組織の除去とマウス前立腺腫瘍の微細な解剖は、非前立腺上皮細胞と正常前立腺上皮細胞の両方がオルガノイドを生成するので、癌オルガノイドの最適な生成のために重要である。特に固形前立腺腫瘍の場合、生存可能な細胞の数を減らす壊死組織による汚染を除去するために生存性腫?...

1980年代後半以降、相同組換えによって遺伝子を改変する能力は、生物学的システム1の研究を大きく進めてきた。Cre-loxPのような誘導性、組織、または細胞特異的な組換えシステムおよび部位特異的組換え物は、時間的および空間的に2、3の両方の遺伝子改変に対する制御を容易にすることによって、高度な遺伝子研究を行っている。 4.これらの遺伝的戦略の組み合わせは、実験モデルシステム5、6、7の広い配列を作成しました。
遺伝子組み換えマウスモデル(GEMM)は、個々の遺伝子または遺伝子群が哺乳類の発達や疾患に与える影響を評価するための不可欠なツールです。前臨床癌研究において、GEMMは癌の発達、進行、および治療8を研究するための最も生理学的に関連する厳格な方法である。当研究室は、がんGEMMの生成と特徴付けに特化しています。
米国の男性の間で最も高く診断された非皮癌は前立腺癌(PCa)である。PCa患者の大半は、リスクの低い疾患と生存率が高いが、疾患が進行段階で診断されたり、標的ホルモン療法が積極的で治癒不可能なPCaに進行を誘導する場合、生存率は劇的に低下する。サブタイプ9,10.当研究室では、1つ以上の腫瘍抑制遺伝子の凝対性アセレルを利用したGEMMsを開発しました。前立腺上皮細胞のみで活性化されるプロバシンプロモーターの下流にクレ・レコンビネーゼを用いてトランスジーンを導入したため、腫瘍抑制遺伝子発現の組み換えおよび喪失が前立腺に特異的に起こる。12.我々はまた、Cre13を有する細胞において、Creおよび緑色蛍光タンパク質(GFP)発現を欠く細胞においてトマト蛍光タンパク質発現を誘導するmT/mGと呼ばれるCreレポータートランスジーンを含むためにGEMMを飼育した。この方法の提示と我々の代表的な結果は、我々が我々の研究室で研究するGEMMを示しているが、このプロトコルは、任意のマウスモデルから前立腺癌オルガノイドを生成するために使用することができる。しかし、代表的な結果セクションで詳しく説明したように、特定の腫瘍特性が前立腺癌オルガノイド生成に最適であることを観察しました。
過去10年間で、上皮起源の組織から細胞を培養する新しい方法は、インビトロ14、15の器官系をモデル化する能力の著しい進歩をもたらした。「3D細胞培養」という用語は、オルガノイドの確立と維持に関わる技術に起因しており、一般に、臓器特異的細胞系統によって駆動される二次的なアーキテクチャを組み立てる細胞からなる構造として定義することができる。特性16.これらの新しい方法は、細胞が長期的な成長のために変換や不死化を必要としないという古典的な2D細胞培養とは異なります。したがって、正常細胞の3D培養物は、病気の細胞と比較することができる。これは、通常、正常な細胞対照培養が利用できないがん研究において特に有益です。さらに、オルガノイドは、適切に分化した細胞型を持つ二次組織アーキテクチャを自発的に形成し、2D細胞株よりもインビトロで癌を理解するより良いモデルシステムを作る17。当研究室では、PCa GEMMから分離した腫瘍問題から3Dオルガノイドラインを作成し、インビボデータを補完し、GEMMでは実現できない実験を行っています。
この記事では、明確なマウス前立腺葉と転移性病変の解剖を含む、PCa GEMMの完全な壊死のための書かれた視覚的なプロトコルを提示する。我々は、正常マウス前立腺上皮組織18からオルガノイドを導出するためのDrostらによって以前に発表されたプロトコルに基づいて、マウス前立腺腫瘍からオルガノイドを生成するためのステップバイステップの方法を説明し、示す。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:680px;" width="680">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">0.25 % Trypsin+2.21 mM EDTA</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-053</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">1 1/4 in, 23 gauge, disposable syringe needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">Z192430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">10 % neutral buffered formalin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">32 % paraformaldehyde</td>
			<td style="width:177px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">A83-01</td>
			<td style="width:177px;">MedChemExpress</td>
			<td style="width:119px;">HY-10432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Advanced DMEM/F12+++</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Analytical balance</td>
			<td style="width:177px;">Mettler Toledo</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30216623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">B27 (50X)</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Collagenase II</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Dissecting Board</td>
			<td style="width:177px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">36-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:217px;">EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10</td>
			<td style="width:177px;">Manufactured by Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory</td>
			<td style="width:167px;">Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">human recombinant Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:177px;">PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">N-Acetyl-L-Cysteine</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Precision balance</td>
			<td style="width:177px;">Mettler Toledo</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30216561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Scalpel #23</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">504176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Scalpel Handle #7, 16 cm</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">500238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Single-edge carbon razor blade</td>
			<td style="width:177px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">504489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Y-276632 (Rock Inhibitor)</td>
			<td style="width:177px;">APExBIO</td>
			<td style="width:119px;">A3008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of tumor organoids from genetically engineered mouse models of prostate cancer

遺伝子を改変するための相同組換えに基づく方法は、生物学的研究を著しく進めている。遺伝子組み換えマウスモデル(GEMM)は、哺乳類の発達と疾患を研究するための厳格な方法です。当研究室では、部位特異的Cre-loxP組換後システムと前立腺特異的プロモーターを用いて、1つまたは複数の腫瘍抑制遺伝子の発現を欠く前立腺癌(PCa)のいくつかのGEMMを開発しました。本稿では、マウス前立腺腫瘍の解剖に焦点を当てて、これらのPCa GEMMの壊死に対する我々の方法について説明する。過去10年間に開発された新しい方法は、三次元でインビトロで臓器系をモデル化する上皮由来細胞の培養を促進した。また、マウスPCa GEMMsから腫瘍オルガノイドを生成する3D細胞培養法についても詳しく述べる。前臨床癌研究は、2D細胞培養および細胞株由来または患者由来異種移植片モデルによって支配されてきた。これらの方法は腫瘍微小環境を欠き、前臨床試験でこれらの技術を使用する限界である。GEMMは、腫瘍形成と癌の進行を理解するために、より生理学的に関連しています。腫瘍オルガノイド培養は、腫瘍のアーキテクチャおよび細胞系統特性を要約するインビトロモデルシステムである。さらに、3D細胞培養法は、腫瘍細胞培養と比較して正常細胞の増殖を可能にし、2D細胞培養技術を用いてはほとんど不可能である。組み合わせて、前臨床試験におけるGEMMと3D細胞培養の使用は、がん生物学に対する理解を深める可能性を秘めています。

前立腺領域に大きな流体で満たされた原発性前立腺腫瘍を有するマウスの代表的な壊死画像を図2Aに示す。これに対して、図2Bは、個々の前立腺領域が区別できない大きな固体原発性前立腺腫瘍を有するマウスの代表的な壊死画像を示す。蛍光解剖画像は、GFPを発現する図2Bと同じ固体前?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer at JoVE.com

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

前立腺腫瘍解剖に焦点を当て、マウス前立腺癌モデルの壊死および解剖の方法を示す。マウス前立腺腫瘍オルガノイドの生成のためのステップバイステッププロトコルも提示される。

前立腺癌の遺伝子組み換えマウスモデルからの腫瘍オルガノイドの生成

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

マウスオルガノイド培養は、従来の細胞培養よりもインビボ細胞組織によく似ています。がん研究では、オルガノイドは2D細胞株よりも元の腫瘍をモデル化し、新しい薬物治療を開発するためにインビトロで潜在的な癌療法をテストするために使用することができます。男性マウス泌尿生殖器系のエンブロック抽出のために膀胱の両側の脂肪パッドをつかみ、睾丸を露出させるために上方に引っ張る。各睾丸を尿生殖器領域の残りの部分から慎重に解剖する。膀胱を穏やかに持ち上げて、尿生殖器領域が一緒に上昇し、下の尿道を露出させる。膀胱を保持しながら、下側前立腺の下側に向けて尿道を切開する。泌尿生殖器領域全体が腹腔から放出されます。泌尿生殖器系を除去した後、泌尿生殖器系のすぐ後ろおよび脊柱の両側に位置する骨盤リンパ節が露出する。リンパ節を取り除くために、リンパ組織の下でまっすぐな鉗子を配向し、引き上げる。次に、直腸をまっすぐ鉗子でつかみ、直腸を引き上げて結腸全体を解明し、腸間膜リンパ節の転移性病変を探す。全体のイリウムが除去されたとき胃を露出させるために十二指腸を引っ張り続けます.食道を切って胃を完全に取り除きます。リンパ節に転移性病変が認められた場合は、これらの節を腸から慎重に解剖してPBSに貯蔵する。胃が取り除かれたとき、脾臓は4%パラホルムアルデヒドで貯蔵するために腹部の後側から収穫することができる。PBSに保存するための肝臓を除去します。転移性病変を含む腎リンパ節と一緒に脊椎の両側から腎臓を取り除きます。胸腔を露出させるために、慎重にリブケージに沿って横隔膜を切断します。胸腔内で放出される陰圧は、心臓と肺を露出させます。胸骨を引き上げて胸部腔をさらに開きます。胸部の歯房に沿って胸腔の腹側面をスキャンし、胸部リンパ節の転移病変が存在する場合は解剖を行います。胸骨を保持しながら、心臓と肺にアクセスするために腹側肋骨ケージを切り取り、心臓を引き上げて肺の下を切り取る。完全に心臓と肺を除去するためにブロックは、気管内の前血管のすべてを切断します.肺組織や肺転移病変を損傷することなく、PBSの容器に慎重に心臓を移す。前立腺腫瘍の解剖のために、尿生殖器領域を解剖顕微鏡下に置く。一対のストレート鉗子と湾曲した鉗子を使用して、尿生殖領域を後部表面に反転させます。尿道のピンク赤色で識別できる前立腺近位領域を見つけます。尿道をしっかりとつかんで、曲面鉗子で尿生殖組織を操作できるようにします。精嚢の基部を見つけて、慎重に取り除きます。次に、鉗子の湾曲した側を使用して、精管とできるだけ多くの脂肪と結合組織を取り除きます。尿道と近位前立腺領域をしっかりと保持しながら、尿道から膀胱を取り除くために細かい尖ったはさみを使用してください。真っ直ぐな鉗子で近位前立腺領域と尿道をしっかりと保持し、前立腺前立領域を鉗子の湾曲した側で把握し、組織を膀胱および残りの前立腺からしっかりと引き離す。前立腺前立腺組織をPBSに入れ、腹側前立腺領域を見つけます。同じように腹側前立腺領域を除去する。側側領域が側側領域と区別できる場合は、両側の前立腺領域の横方向を除去する。次に、後元の前立腺領域を取り除き、4%パラホルムアルデヒドに近位前立腺領域を配置します。みじん切り後、腫瘍片を15ミリリットルの消化バッファーに入れ、摂氏37度で1時間半から2時間の消化を行います。消化の終わりに、遠心分離によって消化された組織を沈降させ、上清を捨てる。チューブをフリックして細胞ペレットを緩めます。摂氏37度で5分間、10マイクロモルY-27632 ROCK阻害剤を補充したプリ温めたトリプシンの1ミリリットルで細胞を再懸濁する。インキュベーションの終わりに、標準的なP1000ピペットチップで組織スラリーを5回トリチュレートする。さらに5分間のインキュベーションとトリチュレーションのために、チューブを水浴に戻します。マトリックスドームメッキの場合は、消化した細胞を9ミリリットルの冷媒で洗浄し、遠心分離によって細胞を採取する。カウントのための新鮮な媒体の1ミリリットルで細胞を再懸濁します。そして、カウントした後、再び遠心分離によって細胞を収集します。適切な量のマトリックスで腫瘍細胞を希釈します。慎重に55°Cの各ウェルにマトリックスセル溶液の200マイクロリットルをドロップし、6ウェルプレートを温めました。ドームを室温で2分間固めてから、プレートを37°Cのインキュベーターで20分間逆さまにします。ドームが完全に固まった場合は、各ウェルにアンドロゲンR1881とROCK阻害剤を補った前立腺オルガノイド培地の2ミリリットルを追加します。プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。蛍光解剖画像は、緑色蛍光タンパク質、またはGFP発現を、固形前立腺腫瘍によって明らかにし、腫瘍細胞がCreを発現することを示す。同じ動物の肝臓と肺は、これらの腫瘍が原発性前立腺腫瘍に由来することを示すGFPを発現する転移性腫瘍を示す。このマウスの骨盤リンパ節は、トマトではなくGFPを発現し、この転移性腫瘍がリンパ節を追い越し、正常組織が残していないことを示している。固形前立腺腫瘍から生成された小オルガノイドの1日目に、腫瘍オルガノイド培養に存在するトマトおよびGFP発現細胞の両方で形成し始める。しかし、前立腺腫瘍オルガノイドが完全に形成された7日目以降までに、オルガノイドはGFPを発現するがトマトは発現せず、オルガノイドは正常な上皮細胞からではなく、Cre発現腫瘍細胞に由来していることを示唆している。1日目に、トマトおよびGFP発現細胞の両方の体液充填前立腺腫瘍から生成された小さなオルガノイドの培養物がオルガノイド培養物内に存在する。しかし、体液で満たされた前立腺腫瘍のオルガノイドは、7日目以降にGFPまたはトマトのいずれかを発現し、Creを発現しない細胞から形成されたオルガノイドを示す。前立腺組織を収穫する際に向きを保つために、常に膀胱と尿道の位置に注意してください。その生成後、オルガノイドは画像化アプリケーション、分子生物学分析および薬物スクリーンに使用することができる。

Research

JoVE Journal

Genetics

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

ネイティブのクロマチン免疫沈降のヌクレオソーム密度解析ライブラリをシーケンスの生成

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

しっかりと段階的な初期のショウジョウバエの胚からゲノムワイドなクロマチン構造キャプチャ ライブラリの生成

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

てんかんのマウス ・ モデルにおける Neurocardiac 機能障害を識別するために監視同時ビデオ脳波心電図

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

南しみが付くことおよびポリメラーゼの連鎖反応を使用してマウス胚性幹細胞での相同組換えイベントの識別

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

生きている細胞の単一テロメアから表現されるテロメア繰り返し含む RNA テラを視覚化するがん細胞クローンの生成

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

生化神経建築研究における工学的神経前駆体の脳内移植

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9リボヌクレオタンパク質媒介精密遺伝子編集チューブエレクトロポレーション

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

腫瘍性細胞行動の尺度としてのインビトロ侵血アッセイにおけるマウス乳腺腫瘍細胞の使用

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level

RNA 次世代シーケンシングと、遺伝子座固有のレベルで表現されたライン-1s を識別するバイオインフォマティクスパイプライン

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and ...