Name: generation of tumor organoids from genetically engineered mouse models of prostate cancer
Uploaded: 2019-06-13T14:00:00
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저자는 HEK293 세포가 HA 마우스 Noggin-Fc 또는 HA 마우스 Rspo1-Fc로 안정적으로 형질감염된 것을 제공한 스탠포드 대학의 캘빈 쿠오 연구소에 감사드립니다. 우리는 또한 우리가 그의 실험실에 있는 형광 해부 현미경에 접근할 수 있게 해 준 딘 탕 박사에게 감사하고 싶습니다. 이 작품은 국립 암 연구소에서 D.W.G.에 CA179907에 의해 지원되었다. 로스웰 파크 종합 암 센터의 공유 자원은 국립 보건원 암 센터 지원 보조금 CA016056에 의해 지원되었습니다.

여기에 설명된 동물 절차는 실험실 동물 자원부, 로스웰 파크 종합 암 센터, 버팔로, 뉴욕에 있는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 승인으로 수행되었습니다.
참고: 오르가노이드의 생성을 위해 전립선 또는 전립선 종양을 분리하기 위해 해부되는 수컷 마우스는 적어도 성숙의 나이에 도달해야 한다 - 나이의 약 8-10 주. 마우스의 특정 나이 연구 사이 다를 ?...

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	<li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altering+the+genome+by+homologous+recombination.">Altering the genome by homologous recombination.</a> Science. 244 (4910), 1288-1292 (1989).</li><li>Furth, P. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rb1+and+Trp53+cooperate+to+suppress+prostate+cancer+lineage+plasticity,+metastasis,+and+antiandrogen+resistance.">Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance.</a> Science. 355 (6320), 78-83 (2017).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Simian, M., Bissell, M. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+prostate:+a+basic+anatomical+and+histological+guideline.">The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline.</a> Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).</li><li>Callis, G., Sterchi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decalcification+of+Bone:+Literature+Review+and+Practical+Study+of+Various+Decalcifying+Agents,+Methods,+and+Their+Effects+on+Bone+Histology.">Decalcification of Bone: Literature Review and Practical Study of Various Decalcifying Agents, Methods, and Their Effects on Bone Histology.</a> The Journal of Histotechnology. (21), 49-58 (1998).</li><li>Dardenne, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Myc+Induces+an+EZH2-Mediated+Transcriptional+Program+Driving+Neuroendocrine+Prostate+Cancer.">N-Myc Induces an EZH2-Mediated Transcriptional Program Driving Neuroendocrine Prostate Cancer.</a> Cancer Cell. 30 (4), 563-577 (2016).</li><li>Blattner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPOP+Mutation+Drives+Prostate+Tumorigenesis+In+Vivo+through+Coordinate+Regulation+of+PI3K/mTOR+and+AR+Signaling.">SPOP Mutation Drives Prostate Tumorigenesis In Vivo through Coordinate Regulation of PI3K/mTOR and AR Signaling.</a> Cancer Cell. 31 (3), 436-451 (2017).</li><li>Agarwal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Different+Classes+of+Luminal+Progenitor+Cells+within+Prostate+Tumors.">Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors.</a> Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).</li></ol>

전립선 종양 해부 및 오르가노이드 생성을 위한 프로토콜 내의 중요한 단계 비 전립선 조직의 제거 및 마우스 전립선 종양의 미세 해부는 비 전립선 상피 세포와 정상 전립선 상피 세포 모두 오르가노이드를 생성하기 때문에 암 오르가노이드의 최적 생성에 매우 중요합니다. 특히 고형 전립선 종양의 경우, 생존 가능한 세포의 수를 줄일 괴사 조직오염을 제거하기 위해 실행 가능한...

1980 년대 후반 이후, 상동 재조합에 의해 유전자를 변경하는 능력은크게 생물학적 시스템의 연구를 진행했다 1. 유도성, 조직 또는 세포 특이적 운동 시스템 및 Cre-loxP와 같은 부위 별 재조합제는 현적으로 및 공간적으로모두유전 적 변형에 대한 제어를 용이하게하여 유전자 연구를 진행했다 2, 3 ,3, 4. 이러한 유전 전략의 조합은 실험 모델 시스템 5,6,7의 다양한 배열을 만들었습니다.
유전자 조작 마우스 모델 (GEMMs)는 개별 유전자 또는 유전자 그룹이 포유류 발달과 질병에 미치는 영향을 평가하는 필수적인 도구입니다. 전 임상 암 연구에서 GEMM은 암 발병, 진행 및 치료를 연구하는 가장 생리학적으로 관련성이 있고 엄격한 방법입니다8. 우리의 실험실은 암 GEM을 생성하고 특성화하는 것을 전문으로합니다.
미국에 있는 남자 중 가장 높게 진단된 비 절단암은 전립선암입니다 (PCa). PCa를 가진 환자의 대다수는 저위험 질병 및 생존의 높은 가능성을 가지고 있습니다, 그러나 질병이 향상된 단계에서 진단될 때 또는 표적으로 한 호르몬 치료가 공격적인, 비 치료가능한 PCa에 진행을 유도하는 경우에 생존율은 급격히 감소합니다 하위 유형9,10. 우리의 실험실은 하나 이상의 종양 억제 유전자의 floxed 대틀을 이용하는 GEMM를 개발했습니다. 종양 억제 유전자 발현의 재조합 및 손실은 전립선 상피 세포에서만 활성화된 프로바신 프로모터의 Cre 재조합 하류를 가진 이식유전자를 도입했기 때문에 전립선에서 구체적으로 발생한다(11). 12. 우리는 또한 Cre 13을 가진 세포에서 Cre 및 녹색 형광 단백질 (GFP) 발현이 결여된 세포에서 토마토 형광 단백질발현을 유도하는 mT/mG라는 Cre 리포터 이식유전자를 함유하기 위해 우리의 GEMM을 사육하였다. 이 방법의 프리젠 테이션과 우리의 대표적인 결과는 우리가 우리의 실험실에서 공부하는 GEMM을 보여주지만, 이 프로토콜은 어떤 마우스 모형든지에서 전립선암 오르가노이드를 생성하는 것을 이용될 수 있습니다. 그러나, 우리의 대표적인 결과 섹션에서 상세히 논의된 바와 같이, 우리는 특정 종양 특성이 전립선암 오르가노이드 생성에 최적이라는 것을 관찰하였다.
지난 10 년 동안, 상피 기원의 조직에서 세포를 배양하는 새로운 방법은 시험관 내 기관 시스템을 모델링하는 능력의 상당한 발전을 주도했다14,15. 용어 "3D 세포 배양"은 일반적으로 장기 특이적 세포 계보에 의해 구동 되는 이차 아키텍처를 조립 하는 세포로 구성 된 구조로 정의될 수 있는 오르가노이드를 확립 하고 유지에 관련 된 기술에 기인 했다 특성16. 이러한 새로운 방법은 세포가 장기 성장을 위해 변형 또는 불멸화를 필요로 하지 않는다는 점에서 고전적인 2D 세포 배양과 구별된다; 따라서, 정상 세포의 3D 배양은 병에 걸린 세포와 비교될 수 있다. 이것은 일반적인 세포 통제 문화가 전형적으로 유효하지 않은 암 연구에서 특히 귀중합니다. 또한, 오르가노이드는 적절하게 분화된 세포 유형을 가진 이차 조직 구조를 자발적으로 형성하여 2D 세포주(17)보다 시험관내 암을 이해하는 더 나은 모델 시스템이 다. 우리의 실험실은 우리의 생체 내 데이터를 보완하고 GEMM에서 실현 가능하지 않을 실험을 수행하기 위해 우리의 PCa GEMM에서 분리 된 종양 문제에서 3D organoid 라인을 만들었습니다.
이 문서에서는, 우리는 PCa GEMMs의 완전한 necropsy를 위한 서면및 시각적 프로토콜을 제시합니다, 명백한 마우스 전립선 엽 및 전이성 병변의 해부를 포함하여. 우리는 정상 마우스 전립선 상피 조직(18)으로부터 오르가노이드를 유도하기 위해 Drost et al.에 의해 이전에 발표된 프로토콜에 기초하여 마우스전립선 종양으로부터 오르가노이드를 생성하는 단계별 방법을 설명하고 보여준다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:680px;" width="680">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">0.25 % Trypsin+2.21 mM EDTA</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-053</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">1 1/4 in, 23 gauge, disposable syringe needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">Z192430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">10 % neutral buffered formalin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">32 % paraformaldehyde</td>
			<td style="width:177px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">A83-01</td>
			<td style="width:177px;">MedChemExpress</td>
			<td style="width:119px;">HY-10432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Advanced DMEM/F12+++</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Analytical balance</td>
			<td style="width:177px;">Mettler Toledo</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30216623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">B27 (50X)</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Collagenase II</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Dissecting Board</td>
			<td style="width:177px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">36-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:217px;">EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10</td>
			<td style="width:177px;">Manufactured by Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory</td>
			<td style="width:167px;">Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">human recombinant Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:177px;">PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">N-Acetyl-L-Cysteine</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Precision balance</td>
			<td style="width:177px;">Mettler Toledo</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30216561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Scalpel #23</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">504176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Scalpel Handle #7, 16 cm</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">500238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Single-edge carbon razor blade</td>
			<td style="width:177px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">504489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Y-276632 (Rock Inhibitor)</td>
			<td style="width:177px;">APExBIO</td>
			<td style="width:119px;">A3008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of tumor organoids from genetically engineered mouse models of prostate cancer

유전자를 수정하기 위해 상동 재조합에 기초한 방법은 생물학적 연구를 상당히 발전시켰습니다. 유전자 조작 마우스 모델 (GEMM)은 포유류 발달과 질병을 연구하기위한 엄격한 방법입니다. 우리의 실험실은 사이트 특이적인 Cre-loxP 재조합 시스템 및 전립선 특이적 프로모터를 사용하여 하나 또는 다중 종양 억제유전자의 발현이 결여된 전립선암(PCa)의 여러 GEMM을 개발하였다. 이 문서에서는, 우리는 주로 마우스 전립선 종양의 해부에 초점을 맞추고, 이러한 PCa GEMMs의 부검을위한 우리의 방법을 설명합니다. 지난 10년 동안 개발된 새로운 방법은 생체외에서 기관 시스템을 3차원으로 모델링하기 위해 상피 유래 세포의 배양을 촉진하였다. 우리는 또한 마우스 PCa GEMMs에서 종양 오르가노이드를 생성하는 3D 세포 배양 방법을 자세히 설명합니다. 전임상 암 연구는 2D 세포 배양 및 세포주 유래 또는 환자 유래 이종이식 모델에 의해 지배되고 있다. 이러한 방법은 종양 미세 환경이 부족하며, 전임상 연구에서 이러한 기술을 사용하는 데 제한이 있다. GEMM은 종양 발생 및 암 진행을 이해하는 데 더 생리학적으로 관련이 있습니다. 종양 오르가노이드 배양은 종양 건축 및 세포 계통 특성을 재량화하는 체외 모델 시스템입니다. 또한, 3D 세포 배양 방법은 종양 세포 배양에 비해 정상 세포의 성장을 허용하며, 2D 세포 배양 기술을 사용하는 경우는 거의 불가능합니다. 결합에서, 전 임상 연구에서 GEMM 및 3D 세포 배양을 사용하는 것은 암 생물학의 우리의 이해를 향상시킬 가능성이 있습니다.

전방 전립선 영역에서 큰 유체 충전 원발성 전립선 종양을 가진 마우스의 대표적인 부검 이미지는 도 2A에나타내고 있다. 대조적으로, 도 2B는, 개별 전립선 영역이 구별할 수 없는 큰 고체 원발성 전립선 종양을 가진 마우스의 대표적인 부검 이미지를 나타낸다. 형광 해부 이미지는 GFP를 발현하는 도 2<stro...

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Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

우리는 전립선 종양 해부에 초점을 맞춘 마우스 전립선 암 모델의 부검 및 해부를위한 방법을 보여줍니다. 마우스 전립선 종양 오르가노이드의 생성을 위한 단계별 프로토콜도 제시된다.

전립선암의 유전자 조작 마우스 모델에서 종양 오르가노이드의 생성

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

마우스 오르가노이드 배양은 전통적인 세포 배양보다는 생체 내 세포 조직에서 더 가깝게 유사합니다. 암 연구에서, 오르가노이드는 2D 세포주 보다 더 나은 원래 종양을 모델링하고 새로운 약 처리를 개발하기 위하여 시험관 내에서 잠재적인 암 치료를 시험하기 위하여 이용될 수 있습니다. 남성 마우스 비뇨 생식기 시스템의 en 블록 추출을 위해 방광의 양쪽에 지방 패드를 잡고 고환을 노출하기 위해 위쪽으로 당겨.각 고환을 비뇨 생식기 부위의 나머지 부분에서 조심스럽게 해부합니다. 비뇨 생식기 영역이 함께 상승되도록 방광을 부드럽게 들어 올려 그 아래에 요도가 노출됩니다. 방광을 들고 있는 동안, 요도를 절개하기 위해 등쪽 전립선의 밑면에 가위를 지향합니다.전체 비뇨 생식기 지역은 복강에서 방출될 것입니다. 비뇨 생식기 시스템을 제거 한 후, 골반 림프절은 비뇨 생식기 시스템 바로 뒤에 위치하고 척추의 양쪽에 노출됩니다. 림프절을 제거하려면 림프 조직 하에서 직선 집게를 직구하고 당깁니다.다음으로, 직선 집게로 직장을 잡고 절단하고, 창자 전체를 풀고 장 전체를 해명하여 장막림프절의 전이성 병변을 찾습니다. 전체 일리움이 제거되면 위장을 노출십인에 계속 당깁니다. 식도를 잘라 배를 완전히 제거합니다.림프절에 있는 어떤 전이성 병변이 관찰되는 경우에, PBS에 있는 저장을 위해 창자에서 멀리 이 노드를 주의 깊게 해부합니다. 위장이 제거되면 비장을 복부의 등쪽에서 수확하여 4%의 파라포름알데히드에 보관할 수 있습니다. PBS에서 보관을 위해 간을 제거하십시오.전이성 병변을 포함하는 신장 림프절과 더불어 척추의 양쪽에서 신장을 제거합니다. 흉부 구멍을 노출하려면 조심스럽게 흉곽을 따라 다이어프램을 잘라. 흉부 구멍 내에서 방출되는 부정적인 압력은 심장과 폐를 드러내게 됩니다.흉골을 위로 당겨 흉부 구멍을 더 엽니다. 흉부 림프절에서 전이성 병변을 위해 흉곽 구멍의 복부 면을 스캔하여 해부에 대해 말하십시오. 흉골을 들고 있는 동안 복부 흉곽을 잘라서 심장과 폐에 접근하고 심장을 위로 당겨 폐 밑을 자른다.완전히 심장과 폐를 제거하기 위해 en bloc는 기관내 전방 혈관을 모두 절단합니다. 폐 조직이나 폐 전이성 병변을 PBS 의 용기에 손상시키지 않고 심장을 조심스럽게 전달합니다. 전립선 종양의 해부에 대 한 해부 현미경 의 밑에 비뇨 생식기 영역을 배치합니다.직선 집게 한 쌍과 곡선 된 집게 한 쌍을 사용하여 비뇨 생식기 영역을 등색 표면으로 뒤집습니다. 요도의 분홍색-붉은 색으로 식별할 수 있는 근접 전립선 영역을 찾습니다. 구부러져 있는 집게로 비뇨생식기 조직을 조작할 수 있도록 요도를 단단히 잡습니다.정액 소포의 베이스를 찾아 조심스럽게 제거할 수 있도록 합니다. 그런 다음 집게의 곡선면을 사용하여 가능한 한 많은 지방 및 결합 조직을 제거하십시오. 요도와 근위 전립선 부위를 단단히 잡고 있지만, 요도에서 방광을 제거하기 위해 미세 뾰족한 가위를 사용합니다.근위 전립선 영역과 요도를 단단히 잡고 직선 집게로 앞쪽 전립선 부위를 잡아당기의 곡선면을 가진 전방 전립선 부위를 단단히 잡아 당광과 전립선의 나머지 부분에서 조직을 단단히 끌어당깁니다. PBS에 전방 전립선 조직을 놓고 복부 전립선 부위를 찾습니다. 같은 방식으로 복부 전립선 영역을 제거합니다.측면 영역이 등쪽 영역으로부터 구별될 수 있는 경우 양쪽의 측면 전립선 부위를 제거한다. 그런 다음 등쪽 전립선 부위를 제거하고 근위 전립선 부위를 4%의 파라포름알데히드에 배치합니다. 다진 후 종양 조각을 15 밀리리터 의 소화 완충관에 넣고 섭씨 37도에서 1-2 시간 소화합니다.소화의 끝에서, 퇴적물 원심 분리에 의해 소화 된 조직을 폐기하고 상체를 폐기. 튜브를 플릭하여 셀 펠릿을 풀어놓습니다. 섭씨 37도에서 5분 동안 10 마이크로몰라 Y-27632 ROCK 억제제로 보충된 미리 따뜻워진 트립신의 1밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다.인큐베이션의 끝에서 표준 P1000 파이펫 팁으로 조직 슬러리를 다섯 번 세리라세레이트합니다. 튜브를 수조에 반납하여 5분 간 인큐베이션과 트리튜레이션을 추가로 준비합니다. 매트릭스 돔 도금은 차가운 매체의 9 밀리리터에서 소화 된 세포를 세척 한 다음 원심 분리에 의해 세포를 수집합니다.계산을 위한 신선한 매체의 1 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다. 그리고 계산 한 후, 원심 분리에 의해 세포를 수집. 매트릭스의 적절한 부피에서 종양 세포를 희석.매트릭스 셀 용액 200마이크로리터를 55도의 각 웰에 조심스럽게 떨어뜨리면 6웰 플레이트를 데워집니다. 돔이 실온에서 2분 동안 고화된 후 플레이트를 섭씨 37도인큐베이터에 20분간 거꾸로 놓습니다. 돔이 완전히 고화되면 각각의 웰에 안드로겐 R1881 및 ROCK 억제제로 보충된 전립선 오르가노이드 배지의 2밀리리터를 첨가합니다.플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 되돌려 놓습니다. 형광 해부 이미지는 종양 세포가 Cre를 발현한다는 것을 나타내는 고형 전립선 종양에 의한 녹색 형광 단백질 또는 GFP 발현을 드러낸다. 같은 동물에서 간 및 폐는 이 종양이 1 차적인 전립선 종양에서 유래했다는 것을 보여주는 GFP를 표현하는 전이성 종양을 전시합니다.이 마우스에서 골반 림프절은 GFP를 표현하고 토마토가 아닌, 이 전이성 종양이 림프절을 추월하고 정상적인 조직이 남아 있지 않다는 것을 나타냅니다. 첫날에는 고형 전립선 종양에서 생성된 작은 오르가노이드가 종양 오르가노이드 배양에 존재하는 토마토와 GFP 발현 세포로 형성되기 시작합니다. 그러나 전립선 종양 오르가노이드가 완전히 형성되었을 때 7 일 이상까지, 오르가노이드는 GFP를 표현하지만 토마토는 아니지만, 오르가노이드가 일반적인 상피 세포가 아닌 Cre-expressing 종양 세포에서 유래했다는 것을 시사합니다.첫날에는 토마토와 GFP 발현 세포가 모두 유체로 채워진 전립선 종양에서 생성된 작은 오르가노이드 배양의 배양이 오르가노이드 배양 내에 존재한다. 그러나 유체가 채워진 전립선 종양의 오르가노이드는 GFP 또는 토마토를 7일 이상 표현하며, 이는 Cre를 발현하지 않는 세포에서 형성된 오르가노이드를 나타낸다. 전립선 조직을 수확 할 때 지향 상태를 유지하려면 항상 방광과 요도 위치를 알고 있어야합니다.그들의 생성 후에 오르가노이드는 화상 진찰 응용 프로그램, 분자 생물학 분석 및 약 스크린에서 이용될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

네이티브 Chromatin Immunoprecipitation Nucleosome 밀도 분석을 위한 라이브러리를 시퀀싱의 세대

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

연구

유전학

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

단단히 준비 초기 초파리 배아에서 게놈 넓은 Chromatin 구조 캡처 라이브러리의 생성

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

동시 비디오-뇌 파-ECG 모니터링 Neurocardiac 부전 간 질 마우스 모델에서을 식별 하

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

마우스 배아 줄기 세포 사용 하 여 남부 럽 연쇄 반응에서에서 동종 재결합 이벤트의 식별

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Telomeric 반복 포함 된 RNA 테라에서 살아있는 세포에서 단일 Telomere 표현 시각화 하 암 세포 클론의 세대

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

생체 내 신경 아키텍처 연구를 위한 엔지니어링된 신경 전구체의 내 측 통 이식

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질-튜브 전기포공에 의한 정밀 유전자 편집

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

종양 발생 세포 행동의 척도로 시험관 내 침략 분석에서 마우스 유방 종양 세포의 사용

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level

RNA 차세대 염기 서 열 분석 및 생물 정보학 파이프라인은 궤적 특이 수준에서 발현 된 라인-1s를 식별 한다

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and ...