Name: generation of tumor organoids from genetically engineered mouse models of prostate cancer
Uploaded: 2019-06-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne takke Calvin Kuo Laboratory ved Stanford University for å gi HEK293 celler stabilt transfekterte med enten HA-Mouse noggin-FC eller HA-Mouse Rspo1-FC. Vi vil også gjerne takke Dr. Dean tang for å la oss få tilgang til fluorescerende disseksjon mikroskop i laboratoriet hans. Dette arbeidet ble støttet av CA179907 til D.W.G. fra National Cancer Institute. Delte ressurser på Roswell Park Comprehensive Cancer Center ble støttet av National Institutes of Health Cancer Center support Grant CA016056.

Dyr prosedyrer beskrevet her ble utført med godkjenning av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) ved Institutt for laboratorium Animal Resources, Roswell Park omfattende Cancer Center, Buffalo, New York.
Merk: Mannlige mus skal dissekert å isolere prostates eller prostata svulster for generering av organoids bør ha minst nådd alder av seksuell modenhet-ca 8-10 ukers alder. Spesifikke alder av mus kan variere mellom studier. Noen faktorer å vurdere når du v...

<ol>
	<li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altering+the+genome+by+homologous+recombination.">Altering the genome by homologous recombination.</a> Science. 244 (4910), 1288-1292 (1989).</li><li>Furth, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+control+of+gene+expression+in+transgenic+mice+by+a+tetracycline-responsive+promoter.">Temporal control of gene expression in transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (20), 9302-9306 (1994).</li><li>Aranda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+directionality+in+the+Cre-LoxP+site-specific+recombination+pathway.">Altered directionality in the Cre-LoxP site-specific recombination pathway.</a> Journal of Molecular Biology. 311 (3), 453-459 (2001).</li><li>Schwenk, F., Kuhn, R., Angrand, P. O., Rajewsky, K., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+and+spatially+regulated+somatic+mutagenesis+in+mice.">Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice.</a> Nucleic Acids Research. 26 (6), 1427-1432 (1998).</li><li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+mice.">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).</li><li>Goodrich, M. M., Talhouk, R., Zhang, X., Goodrich, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+approach+for+controlling+the+timing+and+order+of+engineered+mutations+in+mice.">An approach for controlling the timing and order of engineered mutations in mice.</a> Genesis. 56 (8), 23242 (2018).</li><li>Brocard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporally+controlled+site-specific+somatic+mutagenesis+in+the+mouse.">Spatio-temporally controlled site-specific somatic mutagenesis in the mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14559-14563 (1997).</li><li>Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+mouse+cancer+models:+a+maze+of+opportunities+and+challenges.">Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges.</a> Cell. 163 (1), 39-53 (2015).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2019.">Cancer statistics, 2019.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. , (2019).</li><li>Bluemn, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+Receptor+Pathway-Independent+Prostate+Cancer+Is+Sustained+through+FGF+Signaling.">Androgen Receptor Pathway-Independent Prostate Cancer Is Sustained through FGF Signaling.</a> Cancer Cell. 32 (4), 474-489 (2017).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+of+p53+and+Rb+deficiency+in+a+conditional+mouse+model+for+metastatic+prostate+cancer.">Synergy of p53 and Rb deficiency in a conditional mouse model for metastatic prostate cancer.</a> Cancer Research. 66 (16), 7889-7898 (2006).</li><li>Ku, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rb1+and+Trp53+cooperate+to+suppress+prostate+cancer+lineage+plasticity,+metastasis,+and+antiandrogen+resistance.">Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance.</a> Science. 355 (6320), 78-83 (2017).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions.">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+cancer+models+in+tumor+biology.">Spherical cancer models in tumor biology.</a> Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li><li>Oliveira, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+prostate:+a+basic+anatomical+and+histological+guideline.">The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline.</a> Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).</li><li>Callis, G., Sterchi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decalcification+of+Bone:+Literature+Review+and+Practical+Study+of+Various+Decalcifying+Agents,+Methods,+and+Their+Effects+on+Bone+Histology.">Decalcification of Bone: Literature Review and Practical Study of Various Decalcifying Agents, Methods, and Their Effects on Bone Histology.</a> The Journal of Histotechnology. (21), 49-58 (1998).</li><li>Dardenne, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Myc+Induces+an+EZH2-Mediated+Transcriptional+Program+Driving+Neuroendocrine+Prostate+Cancer.">N-Myc Induces an EZH2-Mediated Transcriptional Program Driving Neuroendocrine Prostate Cancer.</a> Cancer Cell. 30 (4), 563-577 (2016).</li><li>Blattner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPOP+Mutation+Drives+Prostate+Tumorigenesis+In+Vivo+through+Coordinate+Regulation+of+PI3K/mTOR+and+AR+Signaling.">SPOP Mutation Drives Prostate Tumorigenesis In Vivo through Coordinate Regulation of PI3K/mTOR and AR Signaling.</a> Cancer Cell. 31 (3), 436-451 (2017).</li><li>Agarwal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Different+Classes+of+Luminal+Progenitor+Cells+within+Prostate+Tumors.">Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors.</a> Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).</li></ol>

Kritiske skritt i protokollen for prostata tumor disseksjon og organoid generasjon Fjerning av ikke-prostata vev og fine Disseksjon av musen prostata tumor er avgjørende for den optimale generasjonen av kreft organoids siden både ikke-prostata epitelceller og normal prostata epitelceller vil generere organoids. For solid prostata svulster spesielt, er det avgjørende å isolere områder av levedyktig svulst for å fjerne forurensning med nekrotisk vev som ville redusere antall levedyktige celler. Un...

Siden slutten av 1980-tallet, har evnen til å endre gener ved homologe rekombinasjon sterkt avanserte studiet av biologiske systemer1. Induserbart, vevs-, eller celle spesifikke Promotor systemer og områdespesifikke recombinases, slik som grobunn loxP, har avanserte genetiske studier ved å tilrettelegge kontroll over genetiske modifikasjoner både timelig og romlig2,3, firetil. Kombinasjonen av disse genetiske strategiene har skapt et bredt spekter av eksperimentelle modellsystemer5,6,7.
Genmodifiserte mus modeller (GEMMs) er et integrert verktøy for å vurdere hvordan enkelte gener eller grupper av gener påvirker pattedyr utvikling og sykdom. I pre-klinisk kreftforskning, GEMMs er den mest fysiologisk-relevant og streng metode for å studere kreftutvikling, progresjon, og behandling8. Vårt laboratorium har spesialisert seg på generering og karakteriserer av kreft GEMMs.
Den mest diagnostisert ikke-hud kreft blant menn i USA er prostatakreft (PCa). Flertallet av pasientene med PCa har lav risiko sykdom og høy sannsynlighet for overlevelse, men overlevelsesraten avtar drastisk når sykdommen diagnostiseres ved avanserte stadier, eller hvis målrettet hormonell behandling induserer progresjon til aggressiv, ikke-kureres PCa under typer9,10. Vårt laboratorium har utviklet GEMMs som utnytter floxed alleler av en eller flere tumor Suppressor gener. Rekombinasjon og tap av tumor Suppressor genuttrykk forekommer spesielt i prostata fordi vi har innført en transgene med grobunn recombinase nedstrøms av probasin arrangøren aktiveres bare i prostata epitelceller11, 12. we har også avlet vår GEMMs å inneholde en grobunn reporter transgene kalt mT/mG, som induserer tomat fluorescerende protein uttrykk i celler mangler grobunn og grønt fluorescerende protein (GFP) uttrykk i celler med grobunn13. Mens presentasjonen av denne metoden og våre representative resultater viser GEMMs vi studerer i laboratoriet vårt, kan denne protokollen brukes til å generere prostatakreft organoids fra alle musemodell. Men, som diskutert i detalj i våre representative resultater delen, har vi observert at visse tumor egenskaper er optimale for prostatakreft organoid generasjon.
I det siste tiåret har nye metoder for dyrking celler fra vev av epitel opprinnelse ført til betydelige fremskritt i vår evne til å modellere organsystemer i vitro14,15. Begrepet "3D cellekultur" har blitt tilskrevet teknikker involvert i etablering og vedlikehold organoids, som kan være generelt definert som strukturer består av celler som monterer sekundær arkitektur drevet av organ-spesifikk celle avstamning egenskaper16. Disse nye metodene er forskjellige fra klassisk 2D cellekultur i at cellene ikke krever transformasjon eller immortalization for langsiktig vekst; Dermed kan 3D-kulturer av normale celler sammenlignes med syke celler. Dette er spesielt verdifullt i kreftforskning hvor normal cellekontroll kulturer har vanligvis ikke vært tilgjengelig. I tillegg organoids spontant danne sekundære vev arkitekturer med riktig differensiert celletyper, noe som gjør dem til et bedre modell system for å forstå kreft in vitro enn 2D cellelinjer17. Vårt laboratorium har skapt 3D organoid linjer fra tumor problemet isolert fra vår PCa GEMMs å utfylle våre in vivo data og utføre eksperimenter som ikke ville være gjennomførbart i GEMMs.
I denne artikkelen presenterer vi skriftlige og visuelle protokoller for den komplette obduksjon av PCa GEMMs, inkludert Disseksjon av distinkte mus prostata fliker og metastatisk lesjoner. Vi beskriver og viser en trinnvis metode for å generere organoids fra mus prostata svulster basert på en protokoll tidligere utgitt av Drost et al. for avledet organoids fra normal mus prostata epitel vev18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:680px;" width="680">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">0.25 % Trypsin+2.21 mM EDTA</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-053</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">1 1/4 in, 23 gauge, disposable syringe needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">Z192430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">10 % neutral buffered formalin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">32 % paraformaldehyde</td>
			<td style="width:177px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">A83-01</td>
			<td style="width:177px;">MedChemExpress</td>
			<td style="width:119px;">HY-10432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Advanced DMEM/F12+++</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Analytical balance</td>
			<td style="width:177px;">Mettler Toledo</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30216623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">B27 (50X)</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Collagenase II</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Dissecting Board</td>
			<td style="width:177px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">36-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:217px;">EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10</td>
			<td style="width:177px;">Manufactured by Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory</td>
			<td style="width:167px;">Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">human recombinant Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:177px;">PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">N-Acetyl-L-Cysteine</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Precision balance</td>
			<td style="width:177px;">Mettler Toledo</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30216561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Scalpel #23</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">504176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Scalpel Handle #7, 16 cm</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">500238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Single-edge carbon razor blade</td>
			<td style="width:177px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">504489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Y-276632 (Rock Inhibitor)</td>
			<td style="width:177px;">APExBIO</td>
			<td style="width:119px;">A3008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of tumor organoids from genetically engineered mouse models of prostate cancer

Metoder basert på homologe rekombinasjon å modifisere gener har signifikant fremmet biologisk forskning. Genmodifiserte mus modeller (GEMMs) er en streng metode for å studere pattedyr utvikling og sykdom. Vårt laboratorium har utviklet flere GEMMs av prostatakreft (PCa) som mangler uttrykk for en eller flere tumor Suppressor gener ved hjelp av nettstedet-spesifikke grobunn-loxP recombinase system og en prostata-spesifikk promoter. I denne artikkelen beskriver vi vår metode for obduksjon av disse PCa GEMMs, primært med fokus på Disseksjon av mus prostata svulster. Nye metoder utviklet i løpet av det siste tiåret har muliggjort kulturen av epitel-avledet celler til modell organsystemer in vitro i tre dimensjoner. Vi har også detalj en 3D cellekultur metode for å generere tumor organoids fra musen PCa GEMMs. Pre-klinisk kreftforskning har vært dominert av 2D cellekultur og cellelinje-avledet eller pasient-avledet xenograft modeller. Disse metodene mangler tumor mikromiljøet, en begrensning av å bruke disse teknikkene i pre-kliniske studier. GEMMs er mer fysiologisk-relevant for å forstå tumorigenesis og kreft progresjon. Tumor organoid kultur er en in vitro modell system som viser tumor arkitektur og celle avstamning egenskaper. I tillegg 3D cellekultur metoder tillater vekst av normale celler for sammenligning til tumor cellekulturer, sjelden mulig å bruke 2D cellekultur teknikker. I kombinasjon, bruk av GEMMs og 3D cellekultur i pre-kliniske studier har potensial til å forbedre vår forståelse av kreft biologi.

Representative obduksjon bilder av en mus med en stor væske-fylt primære prostata svulst i fremre prostata regionen er vist i figur 2a. I kontrast, figur 2B, viser representative obduksjon bilder av en mus med en stor solid primære prostata svulst som enkelte prostata regioner er umulig å skille. Fluorescerende disseksjon bilder viser samme solide prostata svulst fra figur 2B ut...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer at JoVE.com

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Vi viser en metode for obduksjon og Disseksjon av mus prostata kreft modeller, med fokus på prostata svulst disseksjon. En steg-for-trinn protokoll for generering av mus prostata tumor organoids er også presentert.

Generering av tumor Organoids fra genetisk utviklet Mouse modeller av prostatakreft

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

Mus organoid kulturer ligner nærmere in vivo celle organisasjon enn tradisjonelle cellekulturer. I kreftforskning modellerer organoider den opprinnelige svulsten bedre enn 2D-cellelinjer og kan brukes til å teste potensielle kreftbehandlinger in vitro for å utvikle nye legemiddelbehandlinger. For en blokk ekstraksjon av den mannlige musen urogenital system gripe fett pad på hver side av blæren og trekke oppover for å avsløre testikkelen.Disseker forsiktig hver testikkel bort fra resten av urogenital regionen. Løft forsiktig blæren slik at urogenitalområdet heves sammen, og eksponerer urinrøret under. Mens du holder blæren, orienter saksen mot undersiden av dorsal prostata for å øke urinrøret.Hele urogenial regionen vil bli frigjort fra bukhulen. Etter fjerning av urogenitalsystemet, vil bekkenlymfeknuter plassert rett bak urogenitalsystemet og på hver side av ryggraden bli utsatt. For å fjerne lymfeknuter orientere rette tang under lymfevevet og trekke opp.Deretter griper du endetarmen med de rette tangene og kutter, trekker opp på endetarmen for å løse hele tykktarmen og tynntarmen for å lete etter metastatiske lesjoner i mesenteriske lymfeknuter. Når hele ilium er fjernet fortsetter å trekke på tolvfingertarmen for å avsløre magen. Kutt spiserøret for å fjerne magen helt.Hvis det observeres metastatiske lesjoner i lymfeknutene, disseker forsiktig disse nodene bort fra tarmen for lagring i PBS. Når magen er fjernet, kan milten høstes fra dorsalsiden av magen for lagring i 4% paraformaldehyd. Fjern leveren for oppbevaring i PBS.Fjern nyrene fra hver side av ryggraden sammen med eventuelle nyrelymfeknuter som inneholder metastatiske lesjoner. For å utsette thoraxhulen, kutt forsiktig membranen langs brystkassen. Det negative trykket som frigjøres i thoraxhulen vil utsette hjertet og lungene.Trekk opp på brystbenet for å åpne thoraxhulen videre. Skann det ventrale ansiktet i thoraxhulen langs brystkassen for metastatiske lesjoner i thoraxlymfeknuter for disseksjon hvis det er tilstede. Mens du fortsatt holder brystbenet, kutt bort ventralribbeburet for å få tilgang til hjertet og lungene og trekk opp på hjertet for å kutte under lungene.For å fullstendig fjerne hjertet og lungene en blokk kuttet alle fremre blodkar i luftrøret. Overfør forsiktig hjertet uten å skade lungevevet eller lungemetastatiske lesjoner til en beholder med PBS. For disseksjon av prostatasvulsten plasserer urogenital regionen under et disseksjonsmikroskop.Bruk et par rette tang og et par buede tang for å vende den urogenielle regionen på ryggoverflaten. Finn den proksimale prostataregionen som kan identifiseres av urinrørets rosa-røde farge. Grip urinrøret fast for å tillate manipulering av urogenitalt vev med de buede tangene.Finn bunnen av sædsiklene for å tillate forsiktig fjerning. Bruk deretter den buede siden av tangene til å fjerne vas deferensene og så mye fett og bindevev som mulig. Mens du fortsatt holder urinrøret og proksimal prostataområdet, bruk et par fine spisse saks for å fjerne blæren fra urinrøret.Holder proksimal prostata regionen og urinrøret fast med de rette tang gripe fremre prostata regionen med den buede siden av tang å fast trekke vevet bort fra blæren og resten av prostata. Plasser det fremre prostatavevet i PBS og finn ventral prostataområdet. Fjern ventral prostataregionen på samme måte.Hvis sideregionen kan skilles fra den dorsale regionen, fjern den laterale prostataregionen på begge sider. Fjern deretter dorsal prostataregionen og legg den proksimale prostataregionen i 4% paraformaldehyd. Etter hakking, legg svulstbitene i et 15-milliliter rør med fordøyelsesbuffer for en halv til en halv til to timers fordøyelse ved 37 grader Celsius.På slutten av fordøyelsen sedimenterer det fordøyde vevet ved sentrifugering og kast det overnaturante. Knips røret for å løsne cellepellet. Resuspend cellene i en milliliter forhåndsoppvarmet trypsin supplert med 10 mikromolar Y-27632 ROCK-hemmer i fem minutter ved 37 grader Celsius.På slutten av inkubasjonen triturate vevsslammen ganger med en standard P1000 pipettespiss. Returner røret til vannbadet i ytterligere fem minutters inkubasjon og triturasjon. For matrisekuppelplating vasker de fordøyde cellene i ni milliliter kaldt medium, og samler deretter cellene ved sentrifugering.Resuspend cellene i en milliliter frisk medium for telling. Og etter å ha talt, samle cellene ved sentrifugering igjen. Fortynn tumorcellene i riktig volum av matrise.Slipp forsiktig 200 mikroliter matrisecelleoppløsning i hver brønn på en 55 graders Celsius oppvarmet seksbrønnsplate. La kuplene stivne ved romtemperatur i to minutter før du plasserer platen opp ned i en 37 grader Celsius inkubator i 20 minutter. Når kuplene har fullt størknet legge to milliliter prostata organoid medium supplert med androgen R1881 og ROCK hemmer til hver brønn.Returner platen til cellekulturinkubatoren. Fluorescerende disseksjonsbilder avslører grønt fluorescerende protein, eller GFP-uttrykk, ved solide prostatasvulster, noe som indikerer at tumorcellene uttrykker Cre. Leveren og lungene fra samme dyr viser metastatiske svulster som uttrykker GFP som viser at disse svulstene stammer fra den primære prostatasvulsten.Bekkenlymfeknuten fra denne musen uttrykker GFP og ikke tomat, noe som indikerer at denne metastatiske svulsten har overtatt lymfeknuten og ingen normale vevsrester. På dag en av kulturen begynner små organoider generert fra en solid prostatasvulst å danne seg med både tomat- og GFP-uttrykkende celler tilstede i tumororganoidkulturen. På dag syv og utover når prostata tumor organoider har fullt dannet imidlertid, organoider uttrykke GFP, men ikke tomat, noe som tyder på at organoider har stammer fra Cre-uttrykkende tumorceller og ikke fra normale epitelceller.På dag en av kulturen av små organoider generert fra væskefylt prostata svulst både tomat og GFP-uttrykkende celler er til stede i organoidkulturen. Organoider fra væskefylte prostatasvulster uttrykker enten GFP eller tomat på dag syv og utover, noe som indikerer at organoidene dannet fra celler som ikke uttrykker Cre. For å holde seg orientert når du høster prostatavevet, vær oppmerksom på blære- og urinrørsposisjonene til enhver tid.Etter deres generasjon kan organoidene brukes i bildebehandlingsapplikasjoner, molekylærbiologianalyse og legemiddelskjermer.

Research

JoVE Journal

Genetics

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generasjon av innfødte Chromatin Immunoprecipitation sekvensering biblioteker til Nucleosome tetthet analyse

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generasjon av genomet hele Chromatin konformasjon fange biblioteker fra tett trinnvis tidlig Drosophila embryo

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

Samtidige Video-EEG-EKG overvåking for å identifisere Neurocardiac dysfunksjon i musen modeller av epilepsi

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identifikasjon av homologe rekombinasjon hendelser i mus embryonale stamceller Southern Blotting og polymerasekjedereaksjons

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Generering av kreft cellen kloner å visualisere Telomeric gjenta inneholder RNA TERRA uttrykt fra en enkelt Telomere i levende celler

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Intraventricular transplantasjon av konstruerte neuronal forløpere for in vivo Neuroarchitecture studier

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediert presis Genredigering av tube electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

Bruk av mus melke tumor celler i en in vitro Invasion analysen som et mål på kreftfremkallende Cell Behavior

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level

RNA neste generasjons sekvensering og en bioinformatikk rørledning for å identifisere uttrykt linje-1s på det geometriske-spesifikke nivået

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and ...