Name: generation of tumor organoids from genetically engineered mouse models of prostate cancer
Uploaded: 2019-06-13T14:00:00
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Os autores gostariam de agradecer ao laboratório Calvin Kuo na Universidade de Stanford por fornecer HEK293 células estavelmente transfected com ou HA-mouse Noggin-FC ou HA-mouse Rspo1-FC. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Dean Tang por nos permitir acessar o microscópio de dissecção fluorescente em seu laboratório. Este trabalho foi apoiado por CA179907 a D.W.G. do Instituto Nacional do cancro. Os recursos compartilhados no centro de câncer abrangente do Roswell Park foram apoiados pelo centro de apoio ao câncer do National Institutes of Health CA016056.

Os procedimentos animais aqui descritos foram realizados com a aprovação do Comitê institucional de cuidado e uso de animais (IACUC) no departamento de recursos de animais de laboratório, centro de câncer abrangente do Parque Roswell, Buffalo, Nova York.
Nota: Camundongos machos a serem dissecados para isolar proestados ou tumores de próstata para a geração de organóides devem ter pelo menos atingido a idade da maturidade sexual — cerca de 8-10 semanas de idade. Ida...

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	<li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altering+the+genome+by+homologous+recombination.">Altering the genome by homologous recombination.</a> Science. 244 (4910), 1288-1292 (1989).</li><li>Furth, P. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rb1+and+Trp53+cooperate+to+suppress+prostate+cancer+lineage+plasticity,+metastasis,+and+antiandrogen+resistance.">Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance.</a> Science. 355 (6320), 78-83 (2017).</li><li>Muzumdar, M. 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B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+cancer+models+in+tumor+biology.">Spherical cancer models in tumor biology.</a> Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li><li>Oliveira, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+prostate:+a+basic+anatomical+and+histological+guideline.">The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline.</a> Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).</li><li>Callis, G., Sterchi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decalcification+of+Bone:+Literature+Review+and+Practical+Study+of+Various+Decalcifying+Agents,+Methods,+and+Their+Effects+on+Bone+Histology.">Decalcification of Bone: Literature Review and Practical Study of Various Decalcifying Agents, Methods, and Their Effects on Bone Histology.</a> The Journal of Histotechnology. (21), 49-58 (1998).</li><li>Dardenne, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Myc+Induces+an+EZH2-Mediated+Transcriptional+Program+Driving+Neuroendocrine+Prostate+Cancer.">N-Myc Induces an EZH2-Mediated Transcriptional Program Driving Neuroendocrine Prostate Cancer.</a> Cancer Cell. 30 (4), 563-577 (2016).</li><li>Blattner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPOP+Mutation+Drives+Prostate+Tumorigenesis+In+Vivo+through+Coordinate+Regulation+of+PI3K/mTOR+and+AR+Signaling.">SPOP Mutation Drives Prostate Tumorigenesis In Vivo through Coordinate Regulation of PI3K/mTOR and AR Signaling.</a> Cancer Cell. 31 (3), 436-451 (2017).</li><li>Agarwal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Different+Classes+of+Luminal+Progenitor+Cells+within+Prostate+Tumors.">Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors.</a> Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).</li></ol>

Etapas críticas dentro do protocolo para a dissecção do tumor da próstata e a geração organoid A remoção do tecido da não-próstata e a dissecção fina do tumor da próstata do rato são cruciais para a geração óptima de organóides do cancro desde que as pilhas epithelial da não-próstata e as pilhas epithelial normais da próstata gerarão organóides. Para tumores de próstata sólidos especificamente, é crucial isolar áreas de tumor viável para remover a contaminação com tecido ...

Desde o final da década de 1980, a capacidade de alterar genes por recombinação homóloga tem avançado muito o estudo dos sistemas biológicos1. Os sistemas inducible, tissue-, ou Cell-specific do promotor e recombinases local-específicos, tais como CRE-loxp, têm estudos genéticos avançados facilitando o controle sobre modificações genéticas ambos temporally e espacialmente2,3, a 4. A combinação dessas estratégias genéticas criou uma ampla gama de sistemas experimentais de modelos5,6,7.
Modelos de mouse geneticamente modificados (GEMMs) são uma ferramenta integral para avaliar como genes individuais ou grupos de genes afetam o desenvolvimento de mamíferos e doenças. Na pesquisa pré-clínica de câncer, os GEMMs são o método mais rigoroso e fisiologicamente relevante para estudar o desenvolvimento, progressão e tratamento do câncer8. Nosso laboratório especializa-se em gerar e caracterizar GEMMs do cancro.
O câncer não-cutâneo mais altamente diagnosticado entre os homens nos Estados Unidos é o câncer de próstata (PCa). A maioria dos pacientes com PCa tem doença de baixo risco e alta probabilidade de sobrevida, mas as taxas de sobrevida diminuem drasticamente quando a doença é diagnosticada em estágios avançados ou se a terapia hormonal direcionada induz progressão a PCa agressivo, não curável subtipos9,10. Nosso laboratório desenvolveu GEMMs que utilizam alelos floxed de um ou mais genes supressores de tumor. Recombinação e perda da expressão gênica do supressor tumoral ocorre especificamente na próstata porque introduzimos um transgene com CRE recombinase downstream do promotor probasin ativado apenas em células epiteliais da próstata11, 12. We igualmente criaram nossos gemms para conter um transgene do repórter de CRE chamado MT/mg, que induz a expressão fluorescente da proteína do tomate nas pilhas que faltam CRE e a expressão fluorescente verde da proteína (GFP) nas pilhas com CRE13. Enquanto a apresentação deste método e nossos resultados representativos mostram GEMMs que estudamos em nosso laboratório, este protocolo pode ser usado para gerar organóides de câncer de próstata a partir de qualquer modelo de mouse. Entretanto, como discutido em detalhe em nossa seção representativa dos resultados, nós observamos que determinadas características do tumor são ideais para a geração do organoid do cancro de próstata.
Na última década, novos métodos de cultivo de células de tecidos de origem epitelial levaram a avanços significativos em nossa capacidade de modelar sistemas de órgãos in vitro14,15. O termo "cultura de células 3D" tem sido atribuído às técnicas envolvidas no estabelecimento e manutenção de organóides, que podem ser geralmente definidos como estruturas feitas de células que montam a arquitetura secundária impulsionada por linhagem de células específicas de órgãos características16. Estes novos métodos são distintos da cultura de células 2D clássicas em que as pilhas não necessitam de transformação ou imortalização para o crescimento a longo prazo; assim, as culturas 3D de pilhas normais podem ser comparadas às pilhas doentes. Isto é particularmente valioso na pesquisa do cancro onde as culturas normais do controle de pilha não estiveram tipicamente disponíveis. Além disso, organóides espontaneamente formam arquiteturas secundárias de tecidos com tipos de células adequadamente diferenciados, tornando-os um sistema de melhor modelo para entender o câncer in vitro do que as linhas de células 2D17. Nosso laboratório criou linhas organóides 3D da questão tumoral isolada de nossos PCa GEMMs para complementar nossos dados in vivo e realizar experimentos que não seriam viáveis em GEMMs.
Neste artigo, nós apresentamos protocolos escritos e visuais para o necropsia completo de gemms do PCA, incluindo a dissecção de lóbulos distintos da próstata do rato e de Lesões metastáticas. Nós descrevemos e mostramos um método passo a passo para gerar organóides dos tumores da próstata do rato baseados em um protocolo publicado previamente por Drost et al. para derivar organóides do tecido epithelial da próstata do rato normal18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:680px;" width="680">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">0.25 % Trypsin+2.21 mM EDTA</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-053</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">1 1/4 in, 23 gauge, disposable syringe needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">Z192430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">10 % neutral buffered formalin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">32 % paraformaldehyde</td>
			<td style="width:177px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">A83-01</td>
			<td style="width:177px;">MedChemExpress</td>
			<td style="width:119px;">HY-10432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Advanced DMEM/F12+++</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Analytical balance</td>
			<td style="width:177px;">Mettler Toledo</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30216623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">B27 (50X)</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Collagenase II</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Dissecting Board</td>
			<td style="width:177px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">36-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:217px;">EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10</td>
			<td style="width:177px;">Manufactured by Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory</td>
			<td style="width:167px;">Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">human recombinant Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:177px;">PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">N-Acetyl-L-Cysteine</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Precision balance</td>
			<td style="width:177px;">Mettler Toledo</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30216561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Scalpel #23</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">504176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Scalpel Handle #7, 16 cm</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">500238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Single-edge carbon razor blade</td>
			<td style="width:177px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">504489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Y-276632 (Rock Inhibitor)</td>
			<td style="width:177px;">APExBIO</td>
			<td style="width:119px;">A3008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of tumor organoids from genetically engineered mouse models of prostate cancer

Métodos baseados em recombinação homóloga para modificar genes têm promovido significativamente a pesquisa biológica. Modelos de rato geneticamente modificados (GEMMs) são um método rigoroso para estudar o desenvolvimento de mamíferos e doenças. Nosso laboratório desenvolveu vários GEMMs de câncer de próstata (PCa) que não possuem expressão de um ou vários genes supressores de tumor usando o sistema de recombinase CRE-loxP específico do site e um promotor específico da próstata. Neste artigo, nós descrevemos nosso método para o necropsia destes gemms do PCA, focalizando primeiramente na dissecção de tumores da próstata do rato. Novos métodos desenvolvidos ao longo da última década facilitaram a cultura de células derivadas de epitelial para modelar sistemas de órgãos in vitro em três dimensões. Nós igualmente detalham um método da cultura da pilha 3D para gerar organóides do tumor dos gemms do PCA do rato. A pesquisa de câncer pré-clínico tem sido dominada pela cultura de células 2D e por modelos de xenoenxertos derivados de células derivadas ou derivadas de pacientes. Estes métodos não têm microambiente tumoral, uma limitação do uso dessas técnicas em estudos pré-clínicos. Os GEMMs são mais fisiologicamente relevantes para a compreensão da tumorigênese e progressão do câncer. A cultura organóide tumoral é um sistema modelo in vitro que recapitula a arquitetura tumoral e as características da linhagem celular. Além, os métodos da cultura da pilha 3D permitem o crescimento de pilhas normais para a comparação às culturas da pilha do tumor, raramente possível usando técnicas da cultura da pilha 2D. Em combinação, o uso de GEMMs e cultura de células 3D em estudos pré-clínicos tem o potencial de melhorar a nossa compreensão da biologia do câncer.

As imagens representativas do necropsia de um rato com um grande tumor preliminar líquido-enchido da próstata na região anterior da próstata são mostradas na Figura 2a. Ao contrário, Figura 2B, mostra imagens representativas do necropsia de um rato com um grande tumor preliminar contínuo da próstata para que as regiões individuais da próstata sejam indistinguíveis. As imagens de dissecção fluorescente mostram o mesm...

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Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Nós mostramos um método para a necropsia e a dissecção de modelos do cancro da próstata do rato, focalizando na dissecção do tumor da próstata. Um protocolo passo a passo para a geração de organóides do tumor da próstata do rato é apresentado igualmente.

Geração de organóides tumorais de modelos de camundongo geneticamente modificados de câncer de próstata

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

Culturas organoides de camundongos se assemelham mais à organização de células in vivo do que as culturas celulares tradicionais. Na pesquisa sobre câncer, organoides modelam o tumor original melhor que as linhas celulares 2D e podem ser usados para testar potenciais terapias cancerígenas in vitro para desenvolver novos tratamentos medicamentosos. Para a extração em bloco do sistema urogenital do rato macho segure a almofada de gordura em ambos os lados da bexiga e puxe para cima para expor o testículo.Disseca cuidadosamente cada testículo longe do resto da região urogenital. Levante suavemente a bexiga para que a região urogenital seja elevada, expondo a uretra por baixo. Enquanto segura a bexiga, oriente a tesoura contra a parte inferior da próstata dorsal para incisar a uretra.Toda a região urogenital será liberada da cavidade abdominal. Após a remoção do sistema urogenital, os linfonodos pélvicos posicionados imediatamente atrás do sistema urogenital e em ambos os lados da coluna serão expostos. Para remover os linfonodos orientar fórceps retos sob o tecido linfático e puxar para cima.Em seguida, segure o reto com os fórceps retos e corte, puxando para cima no reto para desvendar todo o cólon e intestino delgado para procurar lesões metastáticas nos linfonodos mesentéricos. Quando todo o ípio tiver sido removido continue a puxar o duodeno para expor o estômago. Corte o esôfago para remover completamente o estômago.Se forem observadas lesões metastáticas nos linfonodos, disseca cuidadosamente esses nós longe do intestino para armazenamento em PBS. Quando o estômago foi removido, o baço pode ser colhido do lado dorsal do abdômen para armazenamento em 4% de paraformaldeído. Remova o fígado para armazenamento em PBS.Remova os rins de ambos os lados da coluna, juntamente com quaisquer linfonodos renais contendo lesões metastáticas. Para expor a cavidade torácica corte cuidadosamente o diafragma ao longo da caixa torácica. A pressão negativa liberada dentro da cavidade torácica exporá o coração e os pulmões.Puxe para cima no esterno para abrir ainda mais a cavidade torácica. Escaneie a face ventral da cavidade torácica ao longo da caixa torácica para lesões metastáticas nos linfonodos torácicos para dissecção, se presente. Enquanto ainda segura o esterno, corte a caixa torácica ventral para acessar o coração e os pulmões e puxe para cima no coração para cortar sob os pulmões.Para remover totalmente o coração e os pulmões em bloco cortar todos os vasos sanguíneos anteriores na traqueia. Transfira cuidadosamente o coração sem danificar o tecido pulmonar ou lesões metastáticas pulmonares em um recipiente de PBS. Para dissecção do tumor de próstata coloque a região urogenital sob um microscópio de dissecção.Use um par de fórceps retos e um par de fórceps curvos para virar a região urogenital em sua superfície dorsal. Localize a região da próstata proximal que pode ser identificada pela cor rosa-vermelha da uretra. Segure firmemente a uretra para permitir a manipulação do tecido urogenital com as fórceps curvas.Localize a base das vesículas seminais para permitir sua remoção cuidadosa. Em seguida, use o lado curvo dos fórceps para remover os adiamentos vas e o máximo de tecido gorduroso e conjuntivo possível. Enquanto ainda segura firmemente a uretra e a região da próstata proximal, use um par de tesouras pontiagudas finas para remover a bexiga da uretra.Segurando a região da próstata proximal e a uretra firmemente com os fórceps retos agarram a região da próstata anterior com o lado curvo dos fórceps para puxar firmemente o tecido para longe da bexiga e do resto da próstata. Coloque o tecido anterior da próstata na PBS e localize a região da próstata ventral. Remova a região da próstata ventral da mesma forma.Se a região lateral pode ser distinguida da região dorsal remova a região lateral da próstata em ambos os lados. Em seguida, remova a região da próstata dorsal e coloque a região da próstata proximal em 4% de paraformaldeído. Após a picar, coloque os pedaços do tumor em um tubo de 15 mililitros de tampão de digestão para uma digestão de uma hora e meia a duas horas a 37 graus Celsius.No final da digestão, sedimente o tecido digerido por centrifugação e descarte o sobrenante. Flick o tubo para soltar a pelota da célula. Resuspenque as células em um mililitro de trippsina pré-aquecida complementada com 10 micromolar Y-27632 FOD inibidor por cinco minutos a 37 graus Celsius.No final da incubação, triturar o chorume tecidual cinco vezes com uma ponta padrão de pipeta P1000. Devolva o tubo ao banho de água para uma incubação e trituração adicionais de cinco minutos. Para a cúpula matricial, lave as células digeridas em nove mililitros de meio frio, depois colete as células por centrifugação.Resuspend as células em um mililitro de meio fresco para contar. E depois de contar, colete as células por centrifugação mais uma vez. Diluir as células tumorais no volume apropriado da matriz.Solte cuidadosamente 200 microliters de solução de células matricitárias em cada poço de uma placa de seis poços aquecidas de 55 graus Celsius. Deixe as cúpulas solidificarem à temperatura ambiente por dois minutos antes de colocar a placa de cabeça para baixo em uma incubadora de 37 graus Celsius por 20 minutos. Quando as cúpulas tiverem solidificado, adicione dois mililitros de organoide de próstata suplementados com andrógeno R1881 e inibidor de ROCHA a cada poço.Devolva a placa à incubadora de cultura celular. Imagens de dissecção fluorescente revelam proteína fluorescente verde, ou expressão GFP, por tumores de próstata sólidos, indicando que as células tumorais expressam Cre. O fígado e os pulmões do mesmo animal apresentam tumores metastáticos expressando GFP demonstrando que esses tumores se originaram do tumor primário da próstata.O linfonodo pélvico deste camundongo expressa GFP e não Tomate, indicando que este tumor metastático ultrapassou o linfonodo e nenhum tecido normal permanece. No primeiro dia de cultura, pequenos organoides gerados a partir de um tumor de próstata sólido começam a se formar com células expressas de Tomate e GFP presentes na cultura organoide tumoral. No sétimo dia e além, quando os organoides tumorais da próstata se formaram totalmente, no entanto, os organoides expressam GFP, mas não tomate, sugerindo que os organoides se originaram de células tumorais que expressam Cre e não de células epiteliais normais.No primeiro dia de cultura de pequenos organoides gerados a partir de tumor de próstata cheio de fluidos, as células expressas pelo Tomate e GFP estão presentes dentro da cultura organoide. Organoides de tumores de próstata preenchidos com fluidos expressam gfp ou tomate no sétimo dia e além, no entanto, indicando que os organoides formados a partir de células que não expressam Cre. Para se manter orientado na colheita do tecido da próstata, fique atento às posições da bexiga e uretra o tempo todo.Após sua geração, os organoides podem ser usados em aplicações de imagem, análise de biologia molecular e telas de drogas.

Research

JoVE Journal

Genetics

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Geração de imunoprecipitação da cromatina nativa sequenciamento de bibliotecas para análise da densidade nucleossoma

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Genética

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Geração de todo o genoma da cromatina conformação captura bibliotecas de firmemente encenado embriões adiantados da drosófila

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

Simultânea vídeo-EEG-ECG de monitoramento para identificar a disfunção Neurocardiac em modelos de Mouse de epilepsia

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identificação de eventos de recombinação homóloga em células-tronco embrionárias de camundongo usando Southern Blotting e reação em cadeia da polimerase

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Geração de Clones de células câncer Visualizar oligospermia Repeat-contendo RNA TERRA expressado de um único dos telômeros em células vivas

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Transplante intraventricular de precursores neuronais projetados para estudos de Neuroarquitetura in vivo

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteína-mediada por Gene preciso de edição por tubo Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

O uso de células tumorais do rato mamário em um ensaio de invasão in vitro como medida de comportamento de células oncogênicas

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level

Sequenciamento de nova geração de RNA e um fluxo de análise de bioinformática para identificar expressão de LINE-1s a nível locus-específico

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and ...