Name: generation of tumor organoids from genetically engineered mouse models of prostate cancer
Uploaded: 2019-06-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить лабораторию Calvin Kuo в Стэнфордском университете за предоставление клеток HEK293, стабонетых либо HA-мышьNoggin-Fc или HA-mouse Rspo1-Fc. Мы также хотели бы поблагодарить доктора Дина Тан за предоставленную нам доступ к флуоресцентным рассеиванием микроскопа в его лаборатории. Эта работа была поддержана CA179907 d.W.G. от Национального института рака. Общие ресурсы в Розуэлл Парк Всеобъемлющий онкологический центр были поддержаны Национальными институтами здравоохранения онкологический центр поддержки Грант CA016056.

Процедуры для животных, описанные здесь, были выполнены с одобрения Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) в Департаменте лабораторных ресурсов животных, Розуэлл Парк Всеобъемлющий онкологический центр, Буффало, Нью-йорк.
ПРИМЕЧАНИЕ:</stro...

<ol>
	<li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altering+the+genome+by+homologous+recombination.">Altering the genome by homologous recombination.</a> Science. 244 (4910), 1288-1292 (1989).</li><li>Furth, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+control+of+gene+expression+in+transgenic+mice+by+a+tetracycline-responsive+promoter.">Temporal control of gene expression in transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (20), 9302-9306 (1994).</li><li>Aranda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+directionality+in+the+Cre-LoxP+site-specific+recombination+pathway.">Altered directionality in the Cre-LoxP site-specific recombination pathway.</a> Journal of Molecular Biology. 311 (3), 453-459 (2001).</li><li>Schwenk, F., Kuhn, R., Angrand, P. O., Rajewsky, K., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+and+spatially+regulated+somatic+mutagenesis+in+mice.">Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice.</a> Nucleic Acids Research. 26 (6), 1427-1432 (1998).</li><li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+mice.">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).</li><li>Goodrich, M. M., Talhouk, R., Zhang, X., Goodrich, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+approach+for+controlling+the+timing+and+order+of+engineered+mutations+in+mice.">An approach for controlling the timing and order of engineered mutations in mice.</a> Genesis. 56 (8), 23242 (2018).</li><li>Brocard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporally+controlled+site-specific+somatic+mutagenesis+in+the+mouse.">Spatio-temporally controlled site-specific somatic mutagenesis in the mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14559-14563 (1997).</li><li>Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+mouse+cancer+models:+a+maze+of+opportunities+and+challenges.">Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges.</a> Cell. 163 (1), 39-53 (2015).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2019.">Cancer statistics, 2019.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. , (2019).</li><li>Bluemn, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+Receptor+Pathway-Independent+Prostate+Cancer+Is+Sustained+through+FGF+Signaling.">Androgen Receptor Pathway-Independent Prostate Cancer Is Sustained through FGF Signaling.</a> Cancer Cell. 32 (4), 474-489 (2017).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+of+p53+and+Rb+deficiency+in+a+conditional+mouse+model+for+metastatic+prostate+cancer.">Synergy of p53 and Rb deficiency in a conditional mouse model for metastatic prostate cancer.</a> Cancer Research. 66 (16), 7889-7898 (2006).</li><li>Ku, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rb1+and+Trp53+cooperate+to+suppress+prostate+cancer+lineage+plasticity,+metastasis,+and+antiandrogen+resistance.">Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance.</a> Science. 355 (6320), 78-83 (2017).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions.">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+cancer+models+in+tumor+biology.">Spherical cancer models in tumor biology.</a> Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li><li>Oliveira, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+prostate:+a+basic+anatomical+and+histological+guideline.">The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline.</a> Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).</li><li>Callis, G., Sterchi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decalcification+of+Bone:+Literature+Review+and+Practical+Study+of+Various+Decalcifying+Agents,+Methods,+and+Their+Effects+on+Bone+Histology.">Decalcification of Bone: Literature Review and Practical Study of Various Decalcifying Agents, Methods, and Their Effects on Bone Histology.</a> The Journal of Histotechnology. (21), 49-58 (1998).</li><li>Dardenne, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Myc+Induces+an+EZH2-Mediated+Transcriptional+Program+Driving+Neuroendocrine+Prostate+Cancer.">N-Myc Induces an EZH2-Mediated Transcriptional Program Driving Neuroendocrine Prostate Cancer.</a> Cancer Cell. 30 (4), 563-577 (2016).</li><li>Blattner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPOP+Mutation+Drives+Prostate+Tumorigenesis+In+Vivo+through+Coordinate+Regulation+of+PI3K/mTOR+and+AR+Signaling.">SPOP Mutation Drives Prostate Tumorigenesis In Vivo through Coordinate Regulation of PI3K/mTOR and AR Signaling.</a> Cancer Cell. 31 (3), 436-451 (2017).</li><li>Agarwal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Different+Classes+of+Luminal+Progenitor+Cells+within+Prostate+Tumors.">Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors.</a> Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).</li></ol>

Критические шаги в рамках протокола для вскрытия опухоли предстательной железы и органоидного поколения Удаление непростастовой ткани и тонкое вскрытие опухоли простаты мыши имеет решающее значение для оптимального поколения раковых органоидов, так как как непростаэпиля...

С конца 1980-х годов способность изменять гены с помощью гомологичных рекомбинаций значительно продвинула изучение биологических систем1. Индуцированные, ткани- или клеточные промоторные системы и конкретные рекомбиназы, такие как Cre-loxP, продвинули генетические исследования, облегчая контроль над генетическими модификациями как в и временно, так и пространственно2,3, 4. Сочетание этих генетических стратегий создало широкийспектр экспериментальных модельных систем 5,6,7.
Генетически модифицированные модели мыши (GEMMs) являются неотъемлемым инструментом для оценки того, как отдельные гены или группы генов влияют на развитие млекопитающих и болезни. В доклинических исследований рака, GEMMs являются наиболее физиологически релевантных и строгий метод для изучения развития рака, прогрессирование, и лечение8. Наша лаборатория специализируется на генерации и характеристике гЕММ рака.
Наиболее диагностируется некочее рак среди мужчин в Соединенных Штатах является рак простаты (PCa). Большинство пациентов с PCa имеют низкий риск заболевания и высокую вероятность выживания, но выживаемость резко снижается, когда болезнь диагностируется на поздних стадиях или если целевая гормональная терапия вызывает прогрессирование к агрессивной, неизлечимой PCa подтипы9,10. Наша лаборатория разработала GEMMs, которые используют флоксированные аллели одного или нескольких генов супрессоров опухолей. Рекомбинация и потеря экспрессии гена супрессора опухоли происходит именно в предстательной железе, потому что мы ввели трансген с рекомбиназой Cre вниз по течению пробосин промотор активирован только в эпителиальных клетках простаты11, 12. Мы также разводили наши GEMMs содержать Cre репортер трансген называется mT/mG, который вызывает томатфлуалистое выражение белка в клетках, не хватает Cre и зеленый флуоресцентный белок (GFP) выражение в клетках с Cre13. В то время как презентация этого метода и наши репрезентативные результаты показывают, что GEMMs, которые мы изучаем в нашей лаборатории, этот протокол может быть использован для генерации органов рака простаты из любой модели мыши. Однако, как подробно обсуждается в нашем разделе репрезентативных результатов, мы заметили, что определенные характеристики опухоли являются оптимальными для генерации органов орака простаты.
В последнее десятилетие, новые методы культивирования клеток из тканей эпителиального происхождения привело к значительным достижениям в нашей способности моделировать системы органов в пробирке14,15. Термин "культура 3D клеток" был отнесен к методам, участвующим в создании и поддержании органоидов, которые могут быть определены как структуры, состоящие из клеток, которые собирают вторичную архитектуру, движимую органно-специфической линией клеток характеристики16. Эти новые методы отличаются от классической 2D-клеточной культуры в том, что клетки не требуют трансформации или увековечения для долгосрочного роста; таким образом, 3D культуры нормальных клеток можно сравнить с больными клетками. Это особенно ценно в исследованиях рака, где нормальные культуры контроля клеток, как правило, не были доступны. Кроме того, органоиды спонтанно образуют вторичные архитектуры тканей с соответствующим дифференцированным типом клеток, что делает их лучшей модельной системой для понимания рака в пробирке, чем 2D-клеточные линии17. Наша лаборатория создала 3D органоидные линии из опухолевого вопроса, изолированных от наших PCa GEMM, чтобы дополнить наши данные in vivo и проводить эксперименты, которые не были бы осуществимы в GEMMs.
В этой статье мы представляем письменные и визуальные протоколы для полной некропсии PCa GEMMs, включая вскрытие различных долей простаты мыши и метастатических поражений. Мы описываем и показываем пошаговой метод генерации органоидов из опухолей простаты мыши на основе протокола, ранее опубликованного Drost et al. для получения органоидов из нормальной эпителиальной ткани простаты мыши18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:680px;" width="680">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">0.25 % Trypsin+2.21 mM EDTA</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-053</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">1 1/4 in, 23 gauge, disposable syringe needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">Z192430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">10 % neutral buffered formalin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">32 % paraformaldehyde</td>
			<td style="width:177px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">A83-01</td>
			<td style="width:177px;">MedChemExpress</td>
			<td style="width:119px;">HY-10432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Advanced DMEM/F12+++</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Analytical balance</td>
			<td style="width:177px;">Mettler Toledo</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30216623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">B27 (50X)</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Collagenase II</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Dissecting Board</td>
			<td style="width:177px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">36-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:217px;">EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10</td>
			<td style="width:177px;">Manufactured by Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory</td>
			<td style="width:167px;">Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">human recombinant Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:177px;">PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">N-Acetyl-L-Cysteine</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Precision balance</td>
			<td style="width:177px;">Mettler Toledo</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30216561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Scalpel #23</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">504176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Scalpel Handle #7, 16 cm</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">500238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Single-edge carbon razor blade</td>
			<td style="width:177px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">504489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Y-276632 (Rock Inhibitor)</td>
			<td style="width:177px;">APExBIO</td>
			<td style="width:119px;">A3008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of tumor organoids from genetically engineered mouse models of prostate cancer

Методы, основанные на гомологионной рекомбинации для изменения генов, значительно способствовали биологическим исследованиям. Генетически модифицированные модели мыши (GEMMs) являются строгим методом для изучения развития млекопитающих и болезней. Наша лаборатория разработала несколько GEMMs рака предстательной железы (PCa), которые не имеют выражения одного или нескольких генов супрессора опухоли с помощью сайта конкретных Cre-loxP рекомбиназы системы и простаты конкретных промоутер. В этой статье мы описываем наш метод некропсии этих PCa GEMMs, в первую очередь упором на вскрытие опухолей простаты мыши. Новые методы, разработанные за последнее десятилетие, облегчили культуру клеток, полученных из эпителии, для моделирования систем органов в пробирке в трех измерениях. Мы также подробно 3D-метод культуры клеток для генерации опухолевых органоидов из мыши PCa GEMMs. Доклинические исследования рака были доминируют 2D-клеточной культуры и клеточной линии полученных или пациента полученных ксенотрансплантата моделей. Эти методы не хватает микроокружения опухоли, ограничение использования этих методов в доклинических исследованиях. ГЕМмы более физиологически значимы для понимания опухолевого и рака прогрессии. Опухолевая органоидная культура представляет собой систему модели in vitro, которая резюмирует архитектуру опухоли и характеристики клеточной линии. Кроме того, методы 3D-культуры клеток позволяют расти нормальных клеток для сравнения с культурами опухолевых клеток, редко возможно, используя методы 2D-клеточной культуры. В сочетании, использование GEMMs и 3D-клеточной культуры в доклинических исследованиях имеет потенциал для улучшения нашего понимания биологии рака.

Представитель некропсии изображения мыши с большой заполненной жидкостью первичной опухоли простаты в передней области простаты показаны на рисунке 2A. В отличие от этого, Рисунок 2B, показывает репрезентативные изображения некропсии ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer at JoVE.com

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Мы показываем метод для некропсии и вскрытия моделей рака простаты мыши, фокусируя на рассечении опухоли простаты. Также представлен пошаговой протокол для генерации органов опухоли предстательной железы мыши.

Поколение опухолевых органоидов из генетически модифицированных моделей мыши рака простаты

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

Мышиные органоидные культуры больше напоминают организацию клеток in vivo, чем традиционные клеточные культуры. В исследованиях рака, органоиды модели оригинальной опухоли лучше, чем 2D клеточных линий и могут быть использованы для тестирования потенциальных методов лечения рака в пробирке для разработки новых методов лечения наркотиков. Для ан блок извлечения мужской мыши урогенитальной системы захватить жир площадку по обе стороны мочевого пузыря и тянуть вверх, чтобы разоблачить яичко.Тщательно вскрыть каждое яичко от остальной части урогенитальной области. Аккуратно поднимите мочевой пузырь так, чтобы урогенитальная область была поднята вместе, обнажая уретру под ним. Удерживая мочевой пузырь, сориентировать ножницы против нижней части спинной простаты, чтобы склонить уретру.Вся урогенитальная область будет освобождена из брюшной полости. После удаления урогенитальной системы, тазовые лимфатические узлы расположены сразу за урогенитальной системы и по обе стороны позвоночника будут подвергаться. Для удаления лимфатических узлов ориентируются прямые миппы под лимфатическую ткань и подтягиваются.Далее, схватить прямую кишку с прямыми типсами и вырезать, потянув на прямой кишке, чтобы разгадать всю толстую кишку и тонкой кишки, чтобы искать метастатические поражения в мезентерио лимфатических узлов. Когда весь подвих был удален продолжают тянуть на двенадцатиперстной кости подвергать желудка. Вырезать пищевода, чтобы полностью удалить желудок.Если наблюдаются метастатические повреждения лимфатических узлов, тщательно рассекают эти узлы вдали от кишечника для хранения в PBS. Когда желудок был удален, селезенка может быть собрана из спинной стороны живота для хранения в 4%paraformaldehyde. Удалите печень для хранения в PBS.Удалите почки с обеих сторон позвоночника вместе с любыми почечных лимфатических узлов, содержащих метастатические поражения. Чтобы разоблачить грудной полости тщательно сократить диафрагму вдоль грудной клетки. Отрицательное давление, высвобождаемое в грудной полости, обнажит сердце и легкие.Поднимитесь на грудину, чтобы открыть грудную полость дальше. Сканирование брюшной полости грудной полости вдоль грудной клетки для метастатических поражений в грудных лимфатических узлах для вскрытия, если таковые имеются. В то же время держа грудину, отрезать брюшной грудной клетки для доступа к сердцу и легким и подтянуть на сердце, чтобы сократить под легкими.Для полного удаления сердца и легких ан блок сократить все передние кровеносные сосуды в трахее. Тщательно перенесите сердце, не повреждая легочную ткань или метастатические поражения легких в контейнер PBS. Для вскрытия опухоли предстательной железы поместите урогенитальный регион под микроскопом вскрытия.Используйте пару прямых типсов и пару изогнутых типсов, чтобы перевернуть урогенитальный регион на спинную поверхность. Найдите проксимальную область простаты, которая может быть идентифицирована по розово-красному цвету уретры. Возьмитесь за уретру крепко, чтобы позволить манипуляции урогенитальной ткани с изогнутыми типсами.Найдите основание семенных пузырьков, чтобы обеспечить их тщательное удаление. Затем используйте изогнутую сторону типсов, чтобы удалить ваз deferens и столько жирной и соединительной ткани, как это возможно. Хотя по-прежнему твердо проведения уретры и проксимальной области простаты, использовать пару тонкой отметил ножницы для удаления мочевого пузыря из уретры.Холдинг проксимальной области простаты и уретры твердо с прямыми типсами захватить передней области простаты с изогнутой стороны типсов твердо вытащить ткани от мочевого пузыря и остальной части простаты. Поместите переднюю ткань простаты в PBS и найдите область брюшной простаты. Удалите область брюшной простаты таким же образом.Если боковую область можно отличить от спинной области, удалите боковую область простаты с обеих сторон. Затем удалить спинной области простаты и место проксимальной области простаты в 4%paraformaldehyde. После заминки поместите кусочки опухоли в 15-миллилитровую трубку буфера пищеварения для полутора-двухчасового пищеварения при 37 градусах Цельсия.В конце пищеварения, осадок переваренной ткани центрифугации и отказаться от супернатанта. Флик трубки, чтобы ослабить ячейки гранулы. Повторное использование клеток в одном миллилитре предварительно разогретого трипсина, дополненного 10 микромоляном ингибитором Y-27632 ROCK в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия.В конце инкубации тритурат ткани суспензии пять раз со стандартным P1000 пипетки отзыв. Верните трубку на водяную баню еще на пять минут инкубации и тритурации. Для матричного купола покрытие мыть переваренные клетки в девять миллилитров холодной среды, а затем собирать клетки центрифугации.Переусепенить клетки в один миллилитр свежей среды для подсчета. И после подсчета, собирать клетки центрифугации еще раз. Разбавить опухолевые клетки в соответствующем объеме матрицы.Тщательно уронить 200 микролитров матричного клеточного раствора в каждую колодец 55 градусов по Цельсию, прогретую шести-хорошо пластиной. Разрешить купола затвердеть при комнатной температуре в течение двух минут, прежде чем поместить пластину вниз головой в 37 градусов по Цельсию инкубатор в течение 20 минут. Когда купола полностью затвердеют добавить два миллилитров простаты органоидной среды, дополненной андрогеном R1881 и ингибитором ROCK к каждому хорошо.Верните тарелку в инкубатор клеточной культуры. Флуоресцентные изображения вскрытия показывают зеленый флуоресцентный белок, или экспрессию GFP, твердыми опухолями простаты, что указывает на то, что опухолевые клетки выражают Cre. Печень и легкие одного и того же животного обладают метастатическими опухолями, выражают GFP, демонстрируя, что эти опухоли возникли из первичной опухоли простаты.Тазовый лимфатический узел от этой мыши выражает GFP, а не томат, указывая, что эта метастатическая опухоль обогнала лимфатический узел и не остается нормальной ткани. В первый день культуры небольшие органоиды, генерируемые из твердой опухоли предстательной железы начинают формироваться с помидорами и GFP-экспресс-экспрессии клеток, присутствующих в опухолевой органоидной культуры. На седьмой день и далее, когда органоиды опухоли предстательной железы полностью сформировались однако, органоиды выражают GFP, но не томат, предполагая, что органоиды возникли из Cre-экспрессии опухолевых клеток, а не из нормальных эпителиальных клеток.В первый день культуры малых органоидов, порожденных жидкостью заполненные опухоли предстательной железы как томат и GFP-экспрессинг клетки присутствуют в органоидной культуры. Органоиды из заполненных жидкостью опухолей предстательной железы выразить либо GFP или томат на седьмой день и за его пределами, однако, указывая, что органоиды образуются из клеток, которые не выражают Cre. Чтобы оставаться ориентированным при сборе ткани простаты, быть в курсе мочевого пузыря и уретры позиции во все времена.После их генерации органоиды могут быть использованы в визуализации приложений, молекулярной биологии анализа и наркотиков экранов.

Research

JoVE Journal

Genetics

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Поколения родной Chromatin иммунопреципитации секвенирования библиотек для анализа плотности нуклеосома

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Поколение генома общесистемной Chromatin конформации захвата библиотек из плотно поставил раннего дрозофилы эмбрионов

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

Одновременная видео ЭЭГ-мониторинг ЭКГ для выявления Neurocardiac дисфункции в моделях мыши эпилепсии

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Определение события гомологичная рекомбинация в мышиных эмбриональных стволовых клеток с использованием южный Blotting и цепной реакции полимеразы

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Поколение клоны клеток рака для визуализации Telomeric повтор содержащие РНК Терра выразил от одного теломер в живых клеток

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Внутрижелудочковая трансплантация инженерных нейронных прекурсоров для исследований нейроархитектуры In Vivo

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Рибонуклеопротеин-опосредовано Точное редактирование генов трубэлектрогенерации

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

Использование мыши молочных опухолевых клеток в in vitro Вторжение анализа в качестве меры онкогенной клеточной поведения

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level

РНК секвенирования следующего поколения и трубопровод биоинформатики для идентификации выраженных линий-1S на уровне Локус

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and ...