Name: generation of tumor organoids from genetically engineered mouse models of prostate cancer
Uploaded: 2019-06-13T14:00:00
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Los autores quieren agradecer al Laboratorio Calvin Kuo de la Universidad de Stanford por proporcionar células HEK293 establemente infectadas con Noggin-Fc o Rspo1-Fc de ratón HA. También nos gustaría dar las gracias al Dr. Dean Tang por permitirnos acceder al microscopio de disección fluorescente en su laboratorio. Este trabajo fue apoyado por CA179907 a D.W.G. del Instituto Nacional del Cáncer. Los recursos compartidos en Roswell Park Comprehensive Cancer Center fueron apoyados por los Institutos Nacionales de Apoyo al Centro de Cáncer de Salud CA016056.

Los procedimientos animales descritos aquí se realizaron con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Departamento de Recursos Animales de Laboratorio, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, Nueva York.
NOTA: Los ratones machos que se diseccionen para aislar la próstata o los tumores de próstata durante la generación de organoides deben haber alcanzado al menos la edad de madurez sexual, aproximadamente 8-10 semanas de...

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Pasos críticos dentro del protocolo para la disección tumoral de próstata y la generación de organoides La extirpación del tejido no prostático y la disección fina del tumor prostático del ratón es crucial para la generación óptima de organoides cancerosos, ya que tanto las células epiteliales no prostáticas como las células epiteliales normales de próstata generarán organoides. Para los tumores de próstata sólidos específicamente, es crucial aislar áreas de tumor viable para elimi...

Desde finales de la década de 1980, la capacidad de alterar genes mediante la recombinación homóloga ha avanzado en gran medida el estudio de los sistemas biológicos1. Los sistemas promotores inducibles, tisulares o celulares específicos y las recombinaciones específicas del sitio, como Cre-loxP, tienen estudios genéticos avanzados al facilitar el control de las modificaciones genéticas tanto temporal como espacialmente2,3, 4. La combinación de estas estrategias genéticasha creado una amplia gama de sistemas de modelos experimentales 5,6,7.
Los modelos de ratón de ingeniería genética (GEM) son una herramienta integral para evaluar cómo los genes individuales o grupos de genes afectan el desarrollo y la enfermedad de los mamíferos. En la investigación preclínica del cáncer, los GEMM son el método más fisiológicamente relevante y riguroso para estudiar el desarrollo, progresión y tratamiento del cáncer8. Nuestro laboratorio se especializa en la generación y caracterización de GEM DeNado sin cáncer.
El cáncer no cutáneo más altamente diagnosticado entre los hombres en los Estados Unidos es el cáncer de próstata (PCa). La mayoría de los pacientes con PCa tienen enfermedad de bajo riesgo y alta probabilidad de supervivencia, pero las tasas de supervivencia disminuyen drásticamente cuando la enfermedad se diagnostica en etapas avanzadas o si la terapia hormonal dirigida induce la progresión a la PCa agresiva y no curable subtipos9,10. Nuestro laboratorio ha desarrollado GEMMs que utilizan alelos floxed de uno o más genes supresores de tumores. La recombinación y la pérdida de la expresión génica supresora tumoral se produce específicamente en la próstata porque hemos introducido un transgén con Cre recombinase aguas abajo del promotor probasin activado sólo en las células epiteliales de próstata11, 12. También hemos criado nuestros GEMMs para contener un transgén de reportero Cre llamado mT/mG, que induce la expresión de proteína fluorescente de tomate en células que carecen de Cre y proteína fluorescente verde (GFP) expresión en células con Cre13. Si bien la presentación de este método y nuestros resultados representativos muestran GEMMs que estudiamos en nuestro laboratorio, este protocolo se puede utilizar para generar organoides de cáncer de próstata a partir de cualquier modelo de ratón. Sin embargo, como se discutió en detalle en nuestra sección de resultados representativos, hemos observado que ciertas características tumorales son óptimas para la generación de organoides de cáncer de próstata.
En la última década, nuevos métodos de cultivo de células de tejidos de origen epitelial han dado lugar a avances significativos en nuestra capacidad de modelar sistemas de órganos in vitro14,15. El término "cultivo celular 3D" se ha atribuido a las técnicas involucradas en el establecimiento y mantenimiento de organoides, que generalmente pueden definirse como estructuras compuestas por células que ensamblan arquitectura secundaria impulsada por el linaje celular específico de órganos características16. Estos nuevos métodos son distintos del cultivo celular 2D clásico en que las células no requieren transformación o inmortalización para el crecimiento a largo plazo; por lo tanto, los cultivos 3D de células normales se pueden comparar con las células enfermas. Esto es particularmente valioso en la investigación del cáncer donde los cultivos normales de control celular no han estado típicamente disponibles. Además, los organoides forman espontáneamente arquitecturas de tejidos secundarios con tipos celulares adecuadamente diferenciados, lo que los convierte en un mejor sistema modelo para entender el cáncer in vitro que las líneas celulares 2D17. Nuestro laboratorio ha creado líneas organoides 3D a partir de problemas tumorales aislados de nuestros GemM PCa para complementar nuestros datos in vivo y realizar experimentos que no serían factibles en GEMMs.
En este artículo, presentamos protocolos escritos y visuales para la necropsia completa de los GEM DeP PCa, incluyendo la disección de diferentes lóbulos de la próstata del ratón y lesiones metastásicas. Describimos y mostramos un método paso a paso para generar organoides a partir de tumores de próstata de ratón basado en un protocolo publicado previamente por Drost et al. para derivar organoides del tejido epitelial de próstata de ratón normal18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:680px;" width="680">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">0.25 % Trypsin+2.21 mM EDTA</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-053</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">1 1/4 in, 23 gauge, disposable syringe needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">Z192430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">10 % neutral buffered formalin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">32 % paraformaldehyde</td>
			<td style="width:177px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">A83-01</td>
			<td style="width:177px;">MedChemExpress</td>
			<td style="width:119px;">HY-10432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Advanced DMEM/F12+++</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Analytical balance</td>
			<td style="width:177px;">Mettler Toledo</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30216623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">B27 (50X)</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Collagenase II</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Dissecting Board</td>
			<td style="width:177px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">36-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:217px;">EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10</td>
			<td style="width:177px;">Manufactured by Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory</td>
			<td style="width:167px;">Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">human recombinant Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:177px;">PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">N-Acetyl-L-Cysteine</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Precision balance</td>
			<td style="width:177px;">Mettler Toledo</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30216561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Scalpel #23</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">504176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Scalpel Handle #7, 16 cm</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">500238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Single-edge carbon razor blade</td>
			<td style="width:177px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">504489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Y-276632 (Rock Inhibitor)</td>
			<td style="width:177px;">APExBIO</td>
			<td style="width:119px;">A3008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of tumor organoids from genetically engineered mouse models of prostate cancer

Los métodos basados en la recombinación homóloga para modificar genes han ido avanzando significativamente en la investigación biológica. Los modelos de ratón de ingeniería genética (GEMM) son un método riguroso para estudiar el desarrollo y la enfermedad de los mamíferos. Nuestro laboratorio ha desarrollado varios GEMMs de cáncer de próstata (PCa) que carecen de la expresión de uno o múltiples genes supresores de tumores utilizando el sistema de recombinas Cre-loxP específico del sitio y un promotor específico de la próstata. En este artículo, describimos nuestro método para la necropsia de estos GEM DeP PCa, centrándose principalmente en la disección de tumores de próstata de ratón. Los nuevos métodos desarrollados en la última década han facilitado el cultivo de células derivadas del epitelial para modelar sistemas de órganos in vitro en tres dimensiones. También detallamos un método de cultivo celular 3D para generar organoides tumorales a partir de GemM PCa de ratón. La investigación preclínica del cáncer ha estado dominada por el cultivo celular 2D y los modelos de xenoinjertos derivados de la línea celular o derivados del paciente. Estos métodos carecen de microambiente tumoral, una limitación del uso de estas técnicas en estudios preclínicos. Los GEMM son más fisiológicamente relevantes para entender la tumorigenesis y la progresión del cáncer. El cultivo organoide tumoral es un sistema modelo in vitro que recapitula la arquitectura tumoral y las características del linaje celular. Además, los métodos de cultivo celular 3D permiten el crecimiento de células normales para la comparación con los cultivos celulares tumorales, rara vez es posible utilizando técnicas de cultivo de células 2D. En combinación, el uso de GEMMs y cultivo de células 3D en estudios preclínicos tiene el potencial de mejorar nuestra comprensión de la biología del cáncer.

Las imágenes representativas de la necropsia de un ratón con un gran tumor de próstata primario lleno de líquido en la región anterior de la próstata se muestran en la Figura 2A. Por el contrario, la Figura 2B,muestra imágenes representativas de la necropsia de un ratón con un tumor de próstata primario sólido grande para el que las regiones de próstata individuales son indistinguibles. Las imágenes de disección flu...

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Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Mostramos un método para la necropsia y la disección de modelos de cáncer de próstata de ratón, centrándose en la disección tumoral de próstata. También se presenta un protocolo paso a paso para la generación de organoides tumorales de próstata de ratón.

Generación de organoides tumorales a partir de modelos de ratón de ingeniería genética del cáncer de próstata

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

Los cultivos organoides de ratón se asemejan más a la organización celular in vivo que a los cultivos celulares tradicionales. En la investigación del cáncer, los organoides modelan el tumor original mejor que las líneas celulares 2D y se pueden utilizar para probar posibles terapias oncológicas in vitro para desarrollar nuevos tratamientos farmacológicos. Para la extracción en bloque del sistema urogenital del ratón macho agarrar la almohadilla de grasa a cada lado de la vejiga y tirar hacia arriba para exponer el testículo.Diseccione cuidadosamente cada testículo lejos del resto de la región urogenital. Levante suavemente la vejiga para que la región urogenital esté elevada, exponiendo la uretra debajo. Mientras sostiene la vejiga, oriente las tijeras contra la parte inferior de la próstata dorsal para incitar a la uretra.Toda la región urogenital se liberará de la cavidad abdominal. Después de extirpar el sistema urogenital, los ganglios linfáticos pélvicos situados inmediatamente detrás del sistema urogenital y a ambos lados de la columna vertebral quedarán expuestos. Para extirpar los ganglios linfáticos, oriente los fórceps rectos debajo del tejido linfático y tire hacia arriba.A continuación, agarra el recto con los fórceps rectos y corta, tirando hacia arriba del recto para desentrañar todo el colon y el intestino delgado para buscar lesiones metastásicas en los ganglios linfáticos mesentéricos. Cuando se ha eliminado todo el ilion, continúe tirando del duodeno para exponer el estómago. Corte el esófago para extirpar completamente el estómago.Si se observan lesiones metastásicas en los ganglios linfáticos, disecciona cuidadosamente estos ganglios lejos del intestino para su almacenamiento en PBS. Cuando se ha extirpado el estómago, el bazo se puede cosechar del lado dorsal del abdomen para su almacenamiento en 4%paraformaldehído. Retire el hígado para su almacenamiento en PBS.Retire los riñones de cada lado de la columna vertebral junto con los ganglios linfáticos renales que contengan lesiones metastásicas. Para exponer la cavidad torácica cortar cuidadosamente el diafragma a lo largo de la caja torácica. La presión negativa liberada dentro de la cavidad torácica expondrá el corazón y los pulmones.Tire hacia arriba en el esternón para abrir aún más la cavidad torácica. Escanee la cara ventral de la cavidad torácica a lo largo de la caja torácica en busca de lesiones metastásicas en los ganglios linfáticos torácicos para la disección si está presente. Mientras mantiene el esternón, corte la caja torácica ventral para acceder al corazón y los pulmones y tire hacia arriba del corazón para cortar debajo de los pulmones.Para extirpar completamente el corazón y los pulmones en bloque cortar todos los vasos sanguíneos anteriores en la tráquea. Transfiera cuidadosamente el corazón sin dañar el tejido pulmonar o las lesiones metastásicas pulmonares a un recipiente de PBS. Para la disección del tumor de próstata coloque la región urogenital bajo un microscopio de disección.Usa un par de fórceps rectos y un par de fórceps curvos para voltear la región urogenital sobre su superficie dorsal. Localice la región proximal de la próstata que puede ser identificada por el color rosa-rojo de la uretra. Sujete la uretra firmemente para permitir la manipulación del tejido urogenital con los fórceps curvos.Localice la base de las vesículas seminales para permitir su cuidadosa eliminación. A continuación, utilice el lado curvo de los fórceps para eliminar los deferentes de los vasos y tanto tejido graso y conectivo como sea posible. Mientras mantiene firmemente la uretra y la región proximal de la próstata, usa un par de tijeras finas puntiagudas para extraer la vejiga de la uretra.Sosteniendo firmemente la región proximal de la próstata y la uretra con los fórceps rectos agarra la región prostática anterior con el lado curvo de los fórceps para alejar firmemente el tejido de la vejiga y el resto de la próstata. Coloque el tejido prostático anterior en PBS y localice la región de próstata ventral. Extirpar la región de próstata ventral de la misma manera.Si la región lateral se puede distinguir de la región dorsal, elimine la región de próstata lateral en ambos lados. Luego extirpa la región dorsal de la próstata y coloca la región proximal de la próstata en 4%paraformaldehído. Después de picar, coloque las piezas del tumor en un tubo de 15 mililitros de tampón de digestión para una digestión de una hora y media a dos horas a 37 grados centígrados.Al final de la digestión, sedimentar el tejido digerido por centrifugación y desechar el sobrenadante. Deslice el tubo para aflojar el pellet celular. Resuspender las células en un mililitro de trippsina precalentó suplementada con 10 micromolares Y-27632 inhibidor de ROCK durante cinco minutos a 37 grados Celsius.Al final de la incubación triturar la suspensión de tejido cinco veces con una punta de pipeta estándar P1000. Devuelva el tubo al baño de agua para una incubación adicional de cinco minutos y trituración. Para el revestimiento de la cúpula de matriz lavar las células digeridas en nueve mililitros de medio frío, a continuación, recoger las células por centrifugación.Resuspender las células en un mililitro de medio fresco para el conteo. Y después de contar, recoger las células por centrifugación una vez más. Diluir las células tumorales en el volumen adecuado de matriz.Deje caer cuidadosamente 200 microlitros de solución de células de matriz en cada pozo de una placa de seis pozos calentada de 55 grados Celsius. Deje que las cúpulas se solidificen a temperatura ambiente durante dos minutos antes de colocar la placa boca abajo en una incubadora de 37 grados Centígrados durante 20 minutos. Cuando las cúpulas han solidificado completamente añadir dos mililitros de medio organoides de próstata complementado con andrógeno R1881 e inhibidor de ROCK a cada pozo.Devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular. Las imágenes de disección fluorescente revelan proteína fluorescente verde, o expresión de GFP, por tumores sólidos de próstata, lo que indica que las células tumorales expresan Cre. El hígado y los pulmones del mismo animal presentan tumores metastásicos que expresan la GFP que demuestran que estos tumores se originaron a partir del tumor primario de próstata.El ganglio linfático pélvico de este ratón expresa la GFP y no el tomate, lo que indica que este tumor metastásico ha superado el ganglio linfático y no queda tejido normal. En el primer día, los pequeños organoides generados a partir de un tumor sólido de próstata comienzan a formarse con células que expresan el tomate y la GFP presentes en el cultivo organoides tumoral. Sin embargo, en el día siete y más allá, cuando los organoides del tumor de próstata se han formado completamente, los organoides expresan la GFP, pero no el tomate, lo que sugiere que los organoides se han originado a partir de células tumorales que expresan Cre y no de células epiteliales normales.En el primer día del cultivo de pequeños organoides generados a partir de tumor de próstata lleno de líquido, tanto el tomate como las células que expresan la GFP están presentes dentro del cultivo organoide. Sin embargo, los organoides de los tumores de próstata llenos de líquidos expresan GFP o Tomate en el día siete y más allá, lo que indica que los organoides se forman a partir de células que no expresan Cre. Para mantenerse orientado al cosechar el tejido prostático, tenga en cuenta las posiciones de la vejiga y la uretra en todo momento.Después de su generación, los organoides se pueden utilizar en aplicaciones de imágenes, análisis de biología molecular y pruebas de fármacos.

Research

JoVE Journal

Genetics

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generación de inmunoprecipitación de la cromatina nativa secuenciación bibliotecas para el análisis de densidad de nucleosoma

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Investigación

Genética

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

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