Name: generation of tumor organoids from genetically engineered mouse models of prostate cancer
Uploaded: 2019-06-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer at JoVE.com

Författarna skulle vilja tacka Calvin Kuo Laboratory vid Stanford University för att ge HEK293 celler stabilt transfekterade med antingen ha-Mouse noggin-FC eller ha-Mouse Rspo1-FC. Vi skulle också vilja tacka Dr Dean Tang för att ge oss tillgång till fluorescerande dissektion Mikroskop i hans laboratorium. Detta arbete stöddes av CA179907 till D.W.G. från National Cancer Institute. Delade resurser på Roswell Park omfattande Cancer Center stöddes av National Institutes of Health Cancer Center support Grant CA016056.

Djurförsök som beskrivs här utfördes med godkännande av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) vid Institutionen för laboratoriedjur resurser, Roswell Park omfattande Cancer Center, Buffalo, New York.
Anmärkning: Manliga möss att dissekeras för att isolera rad prostata eller prostatatumörer för generering av organoider bör ha åtminstone uppnått en ålder av sexuell mognad — om 8-10 veckors ålder. Specifika åldrar av möss kan varier...

<ol>
	<li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altering+the+genome+by+homologous+recombination.">Altering the genome by homologous recombination.</a> Science. 244 (4910), 1288-1292 (1989).</li><li>Furth, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+control+of+gene+expression+in+transgenic+mice+by+a+tetracycline-responsive+promoter.">Temporal control of gene expression in transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (20), 9302-9306 (1994).</li><li>Aranda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+directionality+in+the+Cre-LoxP+site-specific+recombination+pathway.">Altered directionality in the Cre-LoxP site-specific recombination pathway.</a> Journal of Molecular Biology. 311 (3), 453-459 (2001).</li><li>Schwenk, F., Kuhn, R., Angrand, P. O., Rajewsky, K., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+and+spatially+regulated+somatic+mutagenesis+in+mice.">Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice.</a> Nucleic Acids Research. 26 (6), 1427-1432 (1998).</li><li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+mice.">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).</li><li>Goodrich, M. M., Talhouk, R., Zhang, X., Goodrich, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+approach+for+controlling+the+timing+and+order+of+engineered+mutations+in+mice.">An approach for controlling the timing and order of engineered mutations in mice.</a> Genesis. 56 (8), 23242 (2018).</li><li>Brocard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporally+controlled+site-specific+somatic+mutagenesis+in+the+mouse.">Spatio-temporally controlled site-specific somatic mutagenesis in the mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14559-14563 (1997).</li><li>Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+mouse+cancer+models:+a+maze+of+opportunities+and+challenges.">Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges.</a> Cell. 163 (1), 39-53 (2015).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2019.">Cancer statistics, 2019.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. , (2019).</li><li>Bluemn, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+Receptor+Pathway-Independent+Prostate+Cancer+Is+Sustained+through+FGF+Signaling.">Androgen Receptor Pathway-Independent Prostate Cancer Is Sustained through FGF Signaling.</a> Cancer Cell. 32 (4), 474-489 (2017).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+of+p53+and+Rb+deficiency+in+a+conditional+mouse+model+for+metastatic+prostate+cancer.">Synergy of p53 and Rb deficiency in a conditional mouse model for metastatic prostate cancer.</a> Cancer Research. 66 (16), 7889-7898 (2006).</li><li>Ku, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rb1+and+Trp53+cooperate+to+suppress+prostate+cancer+lineage+plasticity,+metastasis,+and+antiandrogen+resistance.">Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance.</a> Science. 355 (6320), 78-83 (2017).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions.">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+cancer+models+in+tumor+biology.">Spherical cancer models in tumor biology.</a> Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li><li>Oliveira, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+prostate:+a+basic+anatomical+and+histological+guideline.">The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline.</a> Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).</li><li>Callis, G., Sterchi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decalcification+of+Bone:+Literature+Review+and+Practical+Study+of+Various+Decalcifying+Agents,+Methods,+and+Their+Effects+on+Bone+Histology.">Decalcification of Bone: Literature Review and Practical Study of Various Decalcifying Agents, Methods, and Their Effects on Bone Histology.</a> The Journal of Histotechnology. (21), 49-58 (1998).</li><li>Dardenne, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Myc+Induces+an+EZH2-Mediated+Transcriptional+Program+Driving+Neuroendocrine+Prostate+Cancer.">N-Myc Induces an EZH2-Mediated Transcriptional Program Driving Neuroendocrine Prostate Cancer.</a> Cancer Cell. 30 (4), 563-577 (2016).</li><li>Blattner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPOP+Mutation+Drives+Prostate+Tumorigenesis+In+Vivo+through+Coordinate+Regulation+of+PI3K/mTOR+and+AR+Signaling.">SPOP Mutation Drives Prostate Tumorigenesis In Vivo through Coordinate Regulation of PI3K/mTOR and AR Signaling.</a> Cancer Cell. 31 (3), 436-451 (2017).</li><li>Agarwal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Different+Classes+of+Luminal+Progenitor+Cells+within+Prostate+Tumors.">Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors.</a> Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).</li></ol>

Kritiska steg inom protokollet för prostata tumör dissektion och Organoid generation Avlägsnande av icke-prostatavävnad och fin dissektion av musen prostata tumör är avgörande för den optimala generationen av cancer organoider eftersom både icke-prostata epitelceller och normal prostata epitelceller kommer att generera organoider. För solida prostatatumörer specifikt, det är viktigt att isolera områden av livskraftiga tumör för att avlägsna kontaminering med nekrotisk vävnad som skull...

Sedan slutet av 1980-talet har förmågan att förändra gener genom homolog rekombination kraftigt Avancerat studiet av biologiska system1. Inducerbara, vävnads-eller cellspecifika promotor system och platsspecifika rekombinaser, såsom CRE-loxP, har avancerade genetiska studier genom att underlätta kontrollen över genetiska modifikationer både temporally och rumsligt2,3, 4. Kombinationen av dessa genetiska strategier har skapat ett brett spektrum av experimentella modellsystem5,6,7.
Genetiskt modifierade musmodeller (GEMMs) är ett integrerat verktyg för att bedöma hur enskilda gener eller grupper av gener påverkar utvecklingen av däggdjur och sjukdomar. I preklinisk cancerforskning, GEMMs är den mest fysiologiskt relevanta och rigorösa metod för att studera cancerutveckling, progression, och behandling8. Vårt laboratorium är specialiserat på att generera och karakterisera cancer GEMMs.
Den mest högt diagnostiserade icke-kutana cancer bland män i USA är prostatacancer (PCa). Majoriteten av patienter med PCa har låg risk sjukdom och hög sannolikhet för överlevnad, men överlevnaden sjunker drastiskt när sjukdomen diagnostiseras i framskridet stadium eller om riktad hormonell terapi inducerar progression till aggressiva, icke-botas PCa undertyper9,10. Vårt laboratorium har utvecklat gemms som utnyttjar floxed alleler av en eller flera tumör suppressor gener. Rekombination och förlust av tumör suppressor genuttryck förekommer specifikt i prostatan eftersom vi har infört en transgenens med CRE driver nedströms av probasin promotorn aktiveras endast i prostata epitelceller11, 12. vi har också fött upp våra gemms att innehålla en CRE reporter transgenens kallas MT/mg, som inducerar tomat fluorescerande proteinuttryck i celler som saknar CRE och grönt fluorescerande protein (GFP) uttryck i celler med CRE13. Medan presentationen av denna metod och våra representativa resultat visar GEMMs vi studerar i vårt laboratorium, kan detta protokoll användas för att generera prostatacancer organoider från någon musmodell. Men, som diskuteras i detalj i vår representativa resultat avsnitt, vi har observerat att vissa tumör egenskaper är optimala för prostatacancer Organoid generation.
Under det senaste decenniet, nya metoder för odling av celler från vävnader av epitelial ursprung har lett till betydande framsteg i vår förmåga att modellera organsystem in vitro-14,15. Termen "3D cellkultur" har tillskrivits de tekniker som är involverade i att etablera och underhålla organoider, som i allmänhet kan definieras som strukturer som består av celler som monterar sekundärarkitektur som drivs av organspecifika cell härstamning egenskaper16. Dessa nya metoder skiljer sig från klassisk 2D-cellkultur i att celler inte kräver omvandling eller i för långsiktig tillväxt; Sålunda, 3D-kulturer av normala celler kan jämföras med sjuka celler. Detta är särskilt värdefullt i cancerforskning där normala cell kontrollkulturer har vanligtvis inte varit tillgängliga. Dessutom bildar organoider spontant sekundära vävnads arkitekturer med lämpligt differentierade celltyper, vilket gör dem till ett bättre modellsystem för att förstå cancer in vitro än 2D-celllinjer17. Vårt laboratorium har skapat 3D Organoid linjer från tumör frågan isolerad från våra PCa GEMMs att komplettera våra in vivo data och utföra experiment som inte skulle vara möjligt i GEMMs.
I den här artikeln presenterar vi skriftliga och visuella protokoll för fullständig nekropsy av PCa GEMMs, inklusive dissektion av distinkta mus prostata lober och metastatiska lesioner. Vi beskriver och visar en steg-för-steg-metod för att generera organoider från mus prostatatumörer baserat på ett protokoll som tidigare publicerats av Drost et al. för att härleda organoider från normal mus prostata epitelial vävnad18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:680px;" width="680">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">0.25 % Trypsin+2.21 mM EDTA</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-053</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">1 1/4 in, 23 gauge, disposable syringe needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">Z192430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">10 % neutral buffered formalin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">32 % paraformaldehyde</td>
			<td style="width:177px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">A83-01</td>
			<td style="width:177px;">MedChemExpress</td>
			<td style="width:119px;">HY-10432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Advanced DMEM/F12+++</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Analytical balance</td>
			<td style="width:177px;">Mettler Toledo</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30216623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">B27 (50X)</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Collagenase II</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Dissecting Board</td>
			<td style="width:177px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">36-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:217px;">EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10</td>
			<td style="width:177px;">Manufactured by Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory</td>
			<td style="width:167px;">Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">human recombinant Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:177px;">PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">N-Acetyl-L-Cysteine</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Precision balance</td>
			<td style="width:177px;">Mettler Toledo</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30216561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Scalpel #23</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">504176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Scalpel Handle #7, 16 cm</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">500238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Single-edge carbon razor blade</td>
			<td style="width:177px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">504489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Y-276632 (Rock Inhibitor)</td>
			<td style="width:177px;">APExBIO</td>
			<td style="width:119px;">A3008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of tumor organoids from genetically engineered mouse models of prostate cancer

Metoder baserade på homolog rekombination för att modifiera gener har avsevärt främat biologisk forskning. Genetiskt modifierade musmodeller (GEMMs) är en rigorös metod för att studera utveckling och sjukdom hos däggdjur. Vårt laboratorium har utvecklat flera GEMMs av prostatacancer (PCa) som saknar uttryck för en eller flera tumör suppressor gener med hjälp av platsspecifika CRE-loxP driver system och en prostata-specifik promotor. I denna artikel, vi beskriver vår metod för obduktion av dessa PCa gemms, främst inriktad på dissektion av mus prostatatumörer. Nya metoder som utvecklats under det senaste decenniet har underlättat kulturen i epitelial-härledda celler för att modellera organsystem in vitro i tre dimensioner. Vi detalj också en 3D-cellkultur metod för att generera tumör organoider från mus PCa GEMMs. Preklinisk cancerforskning har dominerats av 2D-cellkultur och cellinsderived eller patient-härledda xenograft-modeller. Dessa metoder saknar tumör mikromiljö, en begränsning av att använda dessa tekniker i prekliniska studier. GEMMs är mer fysiologiskt-relevant för att förstå tumorigenes och cancer progression. Tumör Organoid kultur är en in vitro-modellsystem som recapitulates tumör arkitektur och cell härstamning egenskaper. Dessutom, 3D-cellkultur metoder möjliggör tillväxt av normala celler för jämförelse med tumör cellkulturer, sällan möjligt med hjälp av 2D cellkultur tekniker. I kombination, användning av GEMMs och 3D-cellkultur i prekliniska studier har potential att förbättra vår förståelse av cancerbiologi.

Representativa nekropsy bilder av en mus med en stor vätskefylld primär prostata tumör i den främre prostata regionen visas i figur 2a. I kontrast, bild 2B, visar representativa obduktion bilder av en mus med en stor solid primär prostata tumör för vilken enskilda prostata regioner är omöjlig att skilja. Fluorescerande dissektion bilder visar samma solida prostata tumör från figur 2<stron...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer at JoVE.com

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Vi visar en metod för nekropsy och dissektion av mus prostatacancer modeller, med fokus på prostata tumör dissektion. Ett steg-för-steg-protokoll för generering av mus prostata tumör organoider presenteras också.

Generering av tumör Organoider från genetiskt modifierade musmodeller av prostata cancer

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

Musorganoidkulturer liknar mer in vivo cell organisation än traditionella cellkulturer. I cancerforskning, organoider modell den ursprungliga tumören bättre än 2D cellinjer och kan användas för att testa potentiella cancerbehandlingar in vitro för att utveckla nya läkemedelsbehandlingar. För en bloc utvinning av den manliga musen urogenital systemet grepp fett pad på vardera sidan av urinblåsan och dra uppåt för att exponera testikeln.Dissekera noggrant varje testikel bort från resten av urogenitalregionen. Lyft försiktigt blåsan så att urogenital regionen är förhöjd tillsammans, utsätta urinröret under. Medan du håller i blåsan orientera du saxen mot undersidan av dorsala prostatan för att incise urinröret.Hela urogenital regionen kommer att släppas från bukhålan. Efter avlägsnande av urogenital systemet, bäcken lymfkörtlar placerade omedelbart bakom urogenital systemet och på vardera sidan av ryggraden kommer att exponeras. För att ta bort lymfkörtlarna orientera raka tång under lymfvävnaden och dra upp.Därefter greppa ändtarmen med den raka tång och skär, dra upp på ändtarmen att riva upp hela tjocktarmen och tunntarmen för att leta efter ögonbevarande skador i de mesenteriala lymfkörtlarna. När hela ilium har tagits bort fortsätta att dra på tolvfingertarmen för att exponera magen. Skär matstrupen för att helt ta bort magen.Om några ögonbevarande lesioner i lymfkörtlarna observeras, dissekerar noggrant dessa noder bort från tarmen för förvaring i PBS. När magen har tagits bort, kan mjälten skördas från ryggsidan av buken för förvaring i 4%paraformaldehyd. Ta bort levern för förvaring i PBS.Ta bort njurarna från vardera sidan av ryggraden tillsammans med eventuella njurlymfknutor som innehåller ögonbevarande lesioner. Att exponera brösthålan försiktigt skära membranet längs bröstkorgen. Det negativa trycket som frigörs inom brösthålan kommer att exponera hjärtat och lungorna.Dra upp på bröstbenet för att öppna brösthålan ytterligare. Scanna ventrala ansikte brösthålan längs bröstkorgen för ögonbevarande skador i bröst lymfkörtlar för dissektion om det finns. Medan du fortfarande håller bröstbenet, skär bort den ventrala bröstkorgen för att komma åt hjärta och lungor och dra upp på hjärtat för att skära under lungorna.För att helt ta bort hjärta och lungor en bloc skära alla främre blodkärl i luftstrupen. Överför försiktigt hjärtat utan att skada lungvävnaden eller lungmetastatiska lesioner till en behållare med PBS. För dissekering av prostatatumör placera urogenital regionen under en dissekering mikroskop.Använd ett par raka tångar och ett par böjda tångar för att vända urogenitalregionen på ryggytan. Lokalisera den proximala prostataregionen som kan identifieras med urinrörets rosaröda färg. Ta tag i urinröret ordentligt för att tillåta manipulering av urogenitalvävnaden med de böjda tlyktorna.Lokalisera basen av sädesblåsorna för att tillåta deras noggranna avlägsnande. Använd sedan den böjda sidan av tången för att ta bort vas deferens och så mycket fet och bindväv som möjligt. Medan fortfarande stadigt hålla urinröret och proximala prostata regionen, använd ett par fina spetsiga saxar för att ta bort urinblåsan från urinröret.Hålla proximala prostata regionen och urinröret stadigt med den raka tång greppa främre prostata regionen med den böjda sidan av tången att stadigt dra vävnaden bort från urinblåsan och resten av prostata. Placera den främre prostatavävnaden i PBS och lokalisera den ventrala prostataregionen. Ta bort den ventrala prostataregionen på samma sätt.Om den laterala regionen kan skiljas från dorsala regionen bort den laterala prostata regionen på båda sidor. Ta sedan bort regionen dorsala prostata och placera den proximala prostataregionen i 4%paraformaldehyd. Efter malning, placera tumörbitarna i en 15-milliliter slang av matsmältningsbuffert för en en och en halv till två timmars matsmältning vid 37 grader Celsius.Vid slutet av matsmältningen sedimentera den smälta vävnaden genom centrifugeringen och kasserar supernatanten. Snärta röret för att lossa cellpelleten. Resuspend cellerna i en milliliter av förvörd trypsin kompletteras med 10 mikromolar Y-27632 ROCK-hämmare i fem minuter vid 37 grader Celsius.I slutet av inkubationen triturate vävnadsslammen fem gånger med en standard P1000 pipett spets. Återför röret till vattenbadet i ytterligare fem minuters inkubation och trituration. För matriskupolplätering tvätta de smälta cellerna i nio milliliter kallt medium, samla sedan cellerna genom centrifugering.Resuspend cellerna i en milliliter av färskt medium för räkning. Och efter att ha räknat, samla in cellerna genom centrifugeringen återigen. Späd tumörcellerna i lämplig volym av matris.Försiktigt släppa 200 mikroliter av matris celllösning i varje brunn av en 55 grader Celsius värms sex-väl platta. Låt kupolerna stelna i rumstemperatur i två minuter innan du placerar plattan upp och ner i en 37 grader Celsius inkubator i 20 minuter. När kupolerna har helt stelnat lägga till två milliliter av prostata organoid medium kompletteras med androgen R1881 och ROCK-hämmare till varje brunn.Returnera plattan till cellkulturinkubatorn. Fluorescerande dissektion bilder avslöjar gröna fluorescerande protein, eller GFP uttryck, av fasta prostata tumörer, vilket tyder på att tumörcellerna uttrycka Cre. Levern och lungor från samma djur uppvisar ögonbevarande tumörer uttrycker GFP visar att dessa tumörer härstammar från den primära prostata tumör.Bäckenhålorna lymfkörteln från denna mus uttrycker GFP och inte Tomat, vilket indikerar att denna ögonbevarande tumör har gått om lymfkörteln och ingen normal vävnad kvarstår. På dag ett av kultur små organoider som genereras från en solid prostata tumör börjar bildas med både Tomat och GFP-uttrycker celler som finns i tumören organoid kultur. Vid dag sju och därefter när prostata tumör organoider har fullt bildats dock de organoider uttrycka GFP, men inte Tomat, vilket tyder på att organoiderna har sitt ursprung från Cre-uttryck tumörceller och inte från normala epitelceller.Dag ett av kultur av små organoider som genereras från vätskefyllda prostata tumör både Tomat och GFP-uttrycker celler är närvarande inom den organoida kulturen. Organoider från vätskefyllda prostatatumörer uttrycker antingen GFP eller Tomat vid dag sju och därefter dock, vilket indikerar att de organoider som bildas från celler som inte uttrycker Cre. Att hålla sig orienterad när skörden av prostatavävnaden, vara medveten om urinblåsan och urinröret positioner hela tiden.Efter deras generation kan organoiderna användas i bildframställningsapplikationer, molekylärbiologisk analys och läkemedelsskärmar.

Research

JoVE Journal

Genetics

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generation av infödda kromatin Immunoprecipitation sekvensering bibliotek för Nucleosome densitet analys

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation av Genome-wide kromatin konformation fånga bibliotek från tätt stegvis tidiga Drosophila embryon

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

Samtidiga Video-EEG-EKG-övervakning för att identifiera Neurocardiac dysfunktion i musmodeller av epilepsi

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identifiering av homolog rekombination händelser i mus embryonala stamceller med södra Blotting och Polymerase Chain Reaction

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Generation av Cancer Cell kloner att visualisera Telomeric Repeat-innehållande RNA TERRA uttryckt från en enda telomeren i levande celler

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Intraventrikulär transplantation av konstruerade neuronala prekursorer för in vivo Neuroarkitekturstudier

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-medierad exakt gen redigering av Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

Användningen av mus mammary tumörceller i en in vitro-invasion analys som ett mått på onkogena cell beteende

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level

RNA nästa generations sekvensering och en bioinformatik pipeline för att identifiera uttryckta LINE-1s på Locus-specifik nivå

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and ...