Name: generation of tumor organoids from genetically engineered mouse models of prostate cancer
Uploaded: 2019-06-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer at JoVE.com

Yazarlar, Stanford Üniversitesi 'ndeki Calvin Kuo Laboratuvarı 'na, HA-Mouse noggin-FC ya da HA-Mouse Rspo1-FC ile HEK293 hücrelerin stabil bir şekilde transfükresini sağlamak için teşekkür etmek istiyor. Ayrıca Dr. Dean Tang 'a laboratuvarında floresan Diseksiyon mikroskobu erişmemize izin verdiği için teşekkür etmek istiyoruz. Bu iş Ulusal Kanser Enstitüsü CA179907 tarafından D.W.G. tarafından destekleniyordu. Roswell Park kapsamlı Kanser Merkezi 'nde paylaşılan kaynaklar sağlık kanser merkezi destek Grant CA016056 Ulusal Enstitüleri tarafından desteklenmektedir.

Burada açıklanan hayvan prosedürleri, laboratuvar hayvansal kaynaklar bölümü 'nde kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi 'nin (ıABUC) onayı ile, Roswell Park kapsamlı Kanser Merkezi, Buffalo, New York 'ta yapıldı.
Not: Organoidlerin nesil için Ayrıca birlikte prostat veya prostat tümörlerinin yalıtmak için disseke erkek fareler en az cinsel olgunluk yaşına ulaşmalıdır-yaklaşık 8-10 hafta yaş. Belirli yaş fareleri çalışmalar arasında farkl?...

<ol>
	<li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altering+the+genome+by+homologous+recombination.">Altering the genome by homologous recombination.</a> Science. 244 (4910), 1288-1292 (1989).</li><li>Furth, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+control+of+gene+expression+in+transgenic+mice+by+a+tetracycline-responsive+promoter.">Temporal control of gene expression in transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (20), 9302-9306 (1994).</li><li>Aranda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+directionality+in+the+Cre-LoxP+site-specific+recombination+pathway.">Altered directionality in the Cre-LoxP site-specific recombination pathway.</a> Journal of Molecular Biology. 311 (3), 453-459 (2001).</li><li>Schwenk, F., Kuhn, R., Angrand, P. O., Rajewsky, K., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+and+spatially+regulated+somatic+mutagenesis+in+mice.">Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice.</a> Nucleic Acids Research. 26 (6), 1427-1432 (1998).</li><li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+mice.">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).</li><li>Goodrich, M. M., Talhouk, R., Zhang, X., Goodrich, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+approach+for+controlling+the+timing+and+order+of+engineered+mutations+in+mice.">An approach for controlling the timing and order of engineered mutations in mice.</a> Genesis. 56 (8), 23242 (2018).</li><li>Brocard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporally+controlled+site-specific+somatic+mutagenesis+in+the+mouse.">Spatio-temporally controlled site-specific somatic mutagenesis in the mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14559-14563 (1997).</li><li>Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+mouse+cancer+models:+a+maze+of+opportunities+and+challenges.">Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges.</a> Cell. 163 (1), 39-53 (2015).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2019.">Cancer statistics, 2019.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. , (2019).</li><li>Bluemn, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+Receptor+Pathway-Independent+Prostate+Cancer+Is+Sustained+through+FGF+Signaling.">Androgen Receptor Pathway-Independent Prostate Cancer Is Sustained through FGF Signaling.</a> Cancer Cell. 32 (4), 474-489 (2017).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+of+p53+and+Rb+deficiency+in+a+conditional+mouse+model+for+metastatic+prostate+cancer.">Synergy of p53 and Rb deficiency in a conditional mouse model for metastatic prostate cancer.</a> Cancer Research. 66 (16), 7889-7898 (2006).</li><li>Ku, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rb1+and+Trp53+cooperate+to+suppress+prostate+cancer+lineage+plasticity,+metastasis,+and+antiandrogen+resistance.">Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance.</a> Science. 355 (6320), 78-83 (2017).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions.">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+cancer+models+in+tumor+biology.">Spherical cancer models in tumor biology.</a> Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li><li>Oliveira, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+prostate:+a+basic+anatomical+and+histological+guideline.">The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline.</a> Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).</li><li>Callis, G., Sterchi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decalcification+of+Bone:+Literature+Review+and+Practical+Study+of+Various+Decalcifying+Agents,+Methods,+and+Their+Effects+on+Bone+Histology.">Decalcification of Bone: Literature Review and Practical Study of Various Decalcifying Agents, Methods, and Their Effects on Bone Histology.</a> The Journal of Histotechnology. (21), 49-58 (1998).</li><li>Dardenne, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Myc+Induces+an+EZH2-Mediated+Transcriptional+Program+Driving+Neuroendocrine+Prostate+Cancer.">N-Myc Induces an EZH2-Mediated Transcriptional Program Driving Neuroendocrine Prostate Cancer.</a> Cancer Cell. 30 (4), 563-577 (2016).</li><li>Blattner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPOP+Mutation+Drives+Prostate+Tumorigenesis+In+Vivo+through+Coordinate+Regulation+of+PI3K/mTOR+and+AR+Signaling.">SPOP Mutation Drives Prostate Tumorigenesis In Vivo through Coordinate Regulation of PI3K/mTOR and AR Signaling.</a> Cancer Cell. 31 (3), 436-451 (2017).</li><li>Agarwal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Different+Classes+of+Luminal+Progenitor+Cells+within+Prostate+Tumors.">Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors.</a> Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).</li></ol>

Prostat tümörü diseksiyonu ve nevuslardır üretimi için protokol içinde kritik adımlar Prostat dışı doku ve fare prostat tümörünün ince diseksiyonu kaldırılması hem prostat olmayan epitelyal hücreler ve normal prostat epitelyal hücreler organoidler oluşturacaktır beri kanser organoidlerin optimum nesil için çok önemlidir. Katı prostat tümörlerinde özellikle, uygun hücrelerin sayısını azaltacak nekrotik doku ile kontaminasyon kaldırmak için uygun tümör alanlarını i...

1980 ' lerin sonlarında, Homolog rekombinasyon tarafından genler değiştirmek için yeteneği büyük ölçüde biyolojik sistemlerin çalışma Gelişmiş1. İndüklenebilir, doku veya hücreye özgü promotor sistemleri ve CRE-loxp gibi siteye özgü rekombinazlar, hem geçici olarak hem de uzamsal olarak2,3, genetik modifikasyonlar üzerinde kontrol kolaylaştırarak genetik çalışmalar gelişmiş 4' ü yapın. Bu genetik stratejilerin kombinasyonu deneysel model sistemleri5,6,7geniş bir dizi yarattı.
Genetik olarak tasarlanan fare modelleri (GEMMs), bireysel genler veya genler gruplarının memelin gelişimini ve hastalığı nasıl etkilediğini değerlendirmek için ayrılmaz bir araçtır. Klinik öncesi kanser araştırmalarında, GEMMs kanser gelişimi, progresyon ve tedavi8' i incelemek için en fizyolojik olarak alakalı ve titiz bir yöntemdir. Bizim laboratuar üreten ve kanser GEMMs karakterize uzmanlaşmıştır.
Amerika Birleşik Devletleri 'nde erkekler arasında en yüksek tanısı olmayan kutanöz kanser prostat kanseri (PCa). PCa olan hastaların çoğunluğu düşük riskli hastalık ve yüksek hayatta kalma olasılığı vardır, ancak hastalık ileri aşamalarında teşhis edildiğinde ya da hedeflenen hormonal tedavi agresif, non-tedavi edilemez PCa ilerlemesi indükler ise hayatta kalma oranları büyük ölçüde düşüş alt türler9,10. Laboratuvarımız bir veya daha fazla tümör bastırıcı genlerin floxed alleni kullanan GEMMs geliştirdi. Yeniden kombinasyon ve tümör bastırıcı gen ifade kaybı özellikle prostat oluşur çünkü biz CRE Rekombinaz aşağı aşağı probasin organizatör ile bir transgeni tanıtıldı sadece prostat epitelyal hücrelerde aktive11, 12. biz de bir CRE muhabiri transgene MT/mg denilen içeren bizim gemms yetiştirilen var, CRE ve yeşil floresan protein (Gfp) hücre içinde c-13Ile hücrelerde eksik hücrelerde domates floresan protein ifadesi indükler. Bu yöntemin sunumu ve temsilcimiz, laboratuvarımızda çalışmamızda GEMMs 'i gösterirken, bu protokol herhangi bir fare modelinden prostat kanseri organoidleri oluşturmak için kullanılabilir. Ancak, temsili sonuçlar bölümünde ayrıntılı olarak tartışıldığı gibi, bazı tümör özelliklerinin prostat kanseri nevuslardır üretimi için optimum olduğunu gözlemledik.
Son on yıl içinde, epitelyal orijinli dokulardan oluşan yeni kültür hücreleri yöntemleri, org sistemleri içinde vitro14,15modellik yeteneğimizde önemli gelişmelere yol açmıştır. "3D hücre kültürü" terimi, organoidlerin kurulması ve sürdürülmesinde yer alan tekniklere atfedilmiştir, bu da genellikle Organ-spesifik hücre sırlarıyla tahrik edilen ikincil mimarisi birleştiren hücrelerden oluşan yapılar olarak tanımlanabilir. özellikleri16. Bu yeni yöntemler, hücrelerin uzun vadeli büyüme için dönüşüm veya ölümsüzleştirme gerektirmeyen klasik 2D hücre kültüründen farklıdır; Böylece, normal hücrelerin 3D kültürler hastalıklı hücrelere kıyasla olabilir. Bu özellikle normal hücre kontrol kültürlerinin genellikle mevcut olmadığı kanser araştırmalarında değerlidir. Buna ek olarak, organoids kendiliğinden uygun farklılaşan hücre türleri ile ikincil doku mimarileri oluşturmak, onları daha iyi bir model sistemi 2D hücre hatları17daha kanser anlamak için yapmak. Laboratuvarımız bizim PCA gemms izole tümör sorunu 3D nevuslardır hatları yarattı bizim in vivo veri tamamlamak ve gemms mümkün olmayacaktır deneyler gerçekleştirmek için.
Bu yazıda, farklı fare prostat lobları ve metastatik lezyonların diseksiyonu da dahil olmak üzere PCA gemms tam otopsi için yazılı ve görsel protokoller sunuyoruz. Daha önce Drost ve Al tarafından yayınlanan bir protokol temelinde fare prostat tümörlerinden organoidler oluşturmak için adım adım bir yöntem tarif ve gösteriyoruz. normal fare prostat epitelyal dokusundan organoidler türetmek için18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:680px;" width="680">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">0.25 % Trypsin+2.21 mM EDTA</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-053</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">1 1/4 in, 23 gauge, disposable syringe needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">Z192430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">10 % neutral buffered formalin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">32 % paraformaldehyde</td>
			<td style="width:177px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">A83-01</td>
			<td style="width:177px;">MedChemExpress</td>
			<td style="width:119px;">HY-10432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Advanced DMEM/F12+++</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Analytical balance</td>
			<td style="width:177px;">Mettler Toledo</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30216623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">B27 (50X)</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Collagenase II</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Dissecting Board</td>
			<td style="width:177px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">36-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:217px;">EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10</td>
			<td style="width:177px;">Manufactured by Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory</td>
			<td style="width:167px;">Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">human recombinant Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:177px;">PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">N-Acetyl-L-Cysteine</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Precision balance</td>
			<td style="width:177px;">Mettler Toledo</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30216561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Scalpel #23</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">504176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Scalpel Handle #7, 16 cm</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">500238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Single-edge carbon razor blade</td>
			<td style="width:177px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">504489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Y-276632 (Rock Inhibitor)</td>
			<td style="width:177px;">APExBIO</td>
			<td style="width:119px;">A3008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of tumor organoids from genetically engineered mouse models of prostate cancer

Genleri değiştirmek için Homolog rekombinasyon dayalı Yöntemler önemli ölçüde biyolojik araştırma ilerletti. Genetiği değiştirilmiş fare modelleri (GEMMs) memeli gelişimi ve hastalığı okumak için titiz bir yöntemdir. Laboratuvarımız, siteye özel CRE-loxP Rekombinaz sistemi ve prostat spesifik promotör kullanılarak bir veya birden fazla tümör bastırıcı genlerin ifadesinin bulunmadığı prostat kanseri (PCa) çeşitli GEMMs geliştirdi. Bu yazıda, öncelikle fare prostat tümörlerinin diseksiyonu üzerinde duruluyor, bu PCA gemms otopsi için yöntemi açıklanmaktadır. Son on yıl içinde geliştirilen yeni yöntemler, üç boyutta organ sistemlerine model olarak epitelyal türev hücrelerin kültürünü kolaylaştırmış durumdadır. Biz de detay bir 3D hücre kültürü yöntemi fare PCa GEMMs tümör organoids oluşturmak için. Klinik öncesi kanser araştırması 2B hücre kültürü ve hücre çizgisinin türetildiği veya hasta tarafından türetilen xenograft modellerinin hakimiyetindedir. Bu yöntemler tümör mikroçevre eksikliği, klinik öncesi çalışmalarda bu teknikleri kullanarak bir sınırlama. GEMMs daha fizyolojik-tümör ve kanser ilerlemesini anlamak için ilgilidir. Tümör nevuslardır kültürü, tümör mimarisini ve hücre soy özelliklerini tekrar eden bir in vitro model sistemidir. Ayrıca, 3D hücre kültürü yöntemleri tümör hücresi kültürlerine kıyasla normal hücrelerin büyümesini sağlar, 2D hücre kültürü tekniklerini kullanarak nadiren mümkündür. Kombinasyon halinde, ön klinik çalışmalarda GEMMs ve 3D hücre kültürünün kullanımı kanser biyolojisi anlayışımızı iyileştirmek için potansiyele sahiptir.

Ön prostat bölgesinde büyük bir sıvı dolu primer prostat tümörü olan bir fare temsili otopsi görüntüler Şekil 2agösterilir. Buna karşılık, Şekil 2B, bireysel prostat bölgeleri ayırt edilemez büyük bir katı primer prostat tümörü olan bir fare temsili nekropsy görüntüleri gösterir. Floresan diseksiyon görüntüleri aynı katı prostat tümörü gösterir Şekil 2...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer at JoVE.com

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Biz prostat tümörü diseksiyon odaklanmak, fare prostat kanseri modellerinin otopsi ve diseksiyon için bir yöntem göstermektedir. Fare prostat tümörü organoidlerin oluşturulması için adım adım bir protokol de sunulmaktadır.

Prostat kanseri genetiği Işlenmiş fare modelleri tümör Organoids üretimi

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

Fare organoid kültürleri geleneksel hücre kültürlerine göre in vivo hücre organizasyonuna daha çok benzer. Kanser araştırmalarında, organoidler orijinal tümörü 2D hücre çizgilerinden daha iyi modeller ler ve yeni ilaç tedavileri geliştirmek için potansiyel kanser tedavilerini in vitro test etmek için kullanılabilirler. Erkek fare ürogenital sistemin en blok çıkarma için mesane her iki tarafında yağ yastığı kavramak ve testis ortaya çıkarmak için yukarı çekin.Her testisi ürogenital bölgenin geri kalanından dikkatlice inceleyin. Mesaneyi yavaşça kaldırın, böylece ürogenital bölge birlikte yükselmiş ve altındaki üretrayı açığa çıkar. Mesane tutarken, üretra incise dorsal prostatın alt karşı makas yönlendirmek.Tüm ürogenital bölge karın boşluğundan salınacak. Ürogenital sistem çıkarıldıktan sonra, ürogenital sistemin hemen arkasında ve omurganın her iki tarafında konumlandırılmış pelvik lenf düğümleri maruz kalacaktır. Lenf düğümleri kaldırmak için lenf dokusunun altında düz forseps yönlendirmek ve yukarı çekin.Sonra, düz forseps ve kesme ile rektum kavramak, mezenterik lenf düğümlerinde metastatik lezyonlar aramak için tüm kolon ve ince bağırsak çözmek için rektum yukarı çekerek. Tüm ilium çıkarıldığında mide maruz kalmak için duodenum çekmeye devam edin. Tamamen mide kaldırmak için yemek borusu kesin.Lenf düğümlerinde herhangi bir metastatik lezyon gözlenirse, PBS'de depolanması için bu düğümleri bağırsaktan dikkatlice inceleyin. Mide çıkarıldığında, dalak% 4 paraformaldehit depolama için karın sırt tarafında hasat edilebilir. PBS depolama için karaciğer çıkarın.Metastatik lezyonlar içeren herhangi bir böbrek lenf düğümleri ile birlikte omurganın her iki tarafında böbrekler çıkarın. Göğüs boşluğu ortaya çıkarmak için dikkatle göğüs kafesi boyunca diyafram kesti. Göğüs boşluğunda salınan negatif basınç kalp ve akciğerleri ortaya çıkaracaktır.Göğüs kafesini daha da açmak için göğüs kafesini yukarı çekin. Varsa diseksiyon için göğüs kafesi boyunca torasik kavitenin ventral yüzünü torasik lenf düğümlerinde metastatik lezyonlar için tarayın. Hala göğüs kafesi tutarken, kalp ve akciğerlere erişmek için ventral göğüs kafesi kesip ve akciğerlerin altında kesmek için kalp çekin.Kalp ve akciğerleri tamamen çıkarmak için tüm ön kan damarlarını kesip trakea. Akciğer dokusuna veya akciğer metastatik lezyonlarına zarar vermeden kalbi pbs kabına dikkatlice aktarın. Prostat tümörü diseksiyon için bir diseksiyon mikroskobu altında ürogenital bölge yerleştirin.Ürogenital bölgeyi sırt yüzeyine çevirmek için bir çift düz forceps ve bir çift kavisli forceps kullanın. Üretranın pembe-kırmızı rengi ile tanımlanabilecek proksimal prostat bölgesini bulun. Eğri forceps ile ürogenital dokunun manipülasyon izin vermek için üretra sıkıca tutun.Onların dikkatli kaldırılmasına izin vermek için seminal veziküllerin tabanını bulun. Sonra vas deferens ve mümkün olduğunca çok yağlı ve bağ dokusu kaldırmak için çalgılar kavisli tarafı kullanın. Hala sıkıca üretra ve proksimal prostat bölgesi tutarken, üretra dan mesane kaldırmak için ince sivri makas bir çift kullanın.Proksimal prostat bölgesini ve üretrayı düz çalgılarla sıkıca tutarak ön prostat bölgesini, keterlerin kavisli tarafıyla sıkıca tutarak dokuyu mesaneden ve prostatın geri kalanından sıkıca çeker. Ön prostat dokusunu PBS'ye yerleştirin ve ventral prostat bölgesini bulun. Ventral prostat bölgesini de aynı şekilde çıkarın.Lateral bölge dorsal bölgeden ayırt edilebilir ise her iki tarafta lateral prostat bölgesi ni çıkarın. Daha sonra dorsal prostat bölgesini çıkarın ve proksimal prostat bölgesini %4 paraformaldehite yerleştirin. Kıyma sonra, 37 santigrat derece bir buçuk-iki saat sindirim için sindirim tampon 15 mililitrelik tüp içine tümör parçaları yerleştirin.Sindirim sonunda, santrifüj ile sindirilmiş doku tortu ve supernatant atın. Hücre peletini gevşetmek için tüpü hafifçe kaydırın. Önceden ısıtılmış tripsin bir mililitre hücreleri resuspend 10 mikromolar Y-27632 ROCK inhibitörü ile takviye 37 santigrat derece beş dakika.Kuluçka sonunda standart bir P1000 pipet ucu ile doku bulamaç beş kez triturate. Ek bir beş dakika kuluçka ve trituration için su banyosu için tüp dönün. Matris kubbe kaplama için soğuk ortamda dokuz mililitre sindirilmiş hücreleri yıkayın, sonra santrifüj ile hücreleri toplamak.Saymak için taze orta bir mililitre hücreleri resuspend. Ve sayma sonra, bir kez daha santrifüj ile hücreleri toplamak. Tümör hücrelerini uygun matris hacminde seyreltin.Dikkatle 55 derece santigrat her kuyuiçine matris hücre çözeltisi 200 mikrolitre damla altı kuyu plaka ısıtılır. Kubbelerin oda sıcaklığında iki dakika katılaşmasına izin verin ve tabağı 37 derecelik bir kuluçka makinesine 20 dakika baş aşağı yerleştirin. Kubbeler tamamen katılaşmış zaman her kuyuya androjen R1881 ve ROCK inhibitörü ile takviye prostat organoid orta iki mililitre ekleyin.Plakayı hücre kültürü kuluçka makinesine geri ver. Floresan diseksiyon görüntüleri, katı prostat tümörleri tarafından yeşil floresan protein veya GFP ekspresyonu ortaya, tümör hücrelerinin Cre ifade gösteren. Aynı hayvanın karaciğer ve akciğerleri, bu tümörlerin primer prostat tümöründen kaynaklandığını gösteren GFP'yi ifade eden metastatik tümörler sergilemektadır.Bu fareden pelvik lenf düğümü GFP değil, Domates ifade eder, Bu metastatik tümör lenf düğümü geçti ve normal doku kalır belirten. Katı prostat tümöründen üretilen küçük organoidler kültürün ilk gününde tümör organoid kültüründe bulunan domates ve GFP ifade eden hücrelerle oluşmaya başlar. Yedinci gün ve ötesinde prostat tümör organoidleri tam olarak oluşmuş ancak, organoidler GFP ifade, ama Domates değil, organoidler Cre-ifade tümör hücrelerinden değil, normal epitel hücrelerinden kaynaklandığını düşündürmektedir.Sıvı dolu prostat tümöründen üretilen küçük organoidlerin kültürünün birinci gününde hem Domates hem de GFP ifade eden hücreler organoid kültürü içinde mevcuttur. Sıvı dolu prostat tümörlerinden organoidler yedinci gün ve ötesinde GFP veya Domates ifade, organoidler Cre ifade etmez hücrelerden oluşan belirten. Prostat dokusuhasalırken odaklı kalmak için, mesane ve üretra pozisyonları her zaman farkında olun.Organoidler kendi nesilden sonra görüntüleme uygulamalarında, moleküler biyoloji analizinde ve ilaç ekranlarında kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Genetics

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Nucleosome yoğunluk analiz için kitaplıklarına sıralama yerli Kromatin Immunoprecipitation nesil

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Genom çapında kromatin Conformation yakalama kitaplıklardan sıkıca aşamalı erken Drosophila embriyo nesil

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

Eş zamanlı Video-EEG-EKG Neurocardiac disfonksiyon epilepsi fare modelleri tanımlamak için izleme

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Fare embriyonik kök hücre kullanarak Southern blot ve polimeraz zincir reaksiyonu Homolog rekombinasyon olaylar tanımlaması

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Canlı hücreler içinde tek bir telomer üzerinden ifade Telomeric tekrar içeren RNA TERRA görselleştirmek için kanser hücre klonlar nesil

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

In vivo Nöromimarlık çalışmaları için tasarlanan nöronal öncülerin intraventriküler nakli

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-boru Elektroporasyon tarafından aracılı hassas gen düzenleme

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

Onkojenik hücre davranışının bir ölçüsü olarak bir In vitro Invazif tahlil içinde Mouse mammary tümör hücrelerinin kullanımı

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level

RNA yeni nesil sıralamayı ve Biyoinformatik boru hattını Locus 'a özgü düzeyde Ifade eden SATıRı-1s tanımlamak için

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and ...