Name: using zebrafish larvae to study the pathological consequences of hemorrhagic stroke
Uploaded: 2019-06-05T15:00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Zebrafish Larvae to Study the Pathological Consequences of Hemorrhagic Stroke at JoVE.com

Wij willen bedanken Dr David spiller en de Universiteit van Manchester Systems microscopie core faciliteit voor het gebruik van de apparatuur, Prof. Richard Bobo voor het gebruik van DanioVision en Dr. Jack Rivers-Auty voor statistisch overleg. De BBH lijn werd vriendelijk gedeeld door Nicole Munsie van het lab van Dr. Sarah Child aan de Universiteit van Calgary. Wij danken ook Prof. Stephen Renshaw, Dr. Adam Hurlstone, Dr. Andrew Beune en Dr. Helen Young voor Fish Lines en equipment.
Deze studie werd ondersteund door de NC3Rs (NC/N002598/1), Stroke Association (TSA LECT 2017/02), ERA-NET NEURON (de heer/M501803/1) en de British Heart Foundation (FS/15/67/32038). We zijn ook bijzonder dankbaar voor de Natalie Kate Moss Trust en de Universiteit van Manchester faculteit biologie, geneeskunde en gezondheid voor hun voortdurende financiële steun.

Zebravis werden opgeheven en werden gehandhaafd bij de Universiteit van Manchester biologische diensten eenheid onder standaard voorwaarden zoals eerder beschreven21. Adult zebravis veeteelt werd goedgekeurd door de Universiteit van Manchester dierenwelzijn en ethische Review Board. Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met U.K. Home Office Regulations (PPL: P132EB6D7).
Opmerking: transgene lijnen die in deze studie worden gebruikt omvatten macrofagen-specifieke Lineage MPEG1:mCherry (gebouwd in-House zoals eerder beschreven22), neutrofiele-specifieke MPO:GFP23,erythroid-specifieke gata1: dsRed24 en alomtegenwoordige:secAnnexinV-mVenus, een verslaggever voor celdood (re-afgeleid in huis25)op wild-type, parelmoer (mitfaW2/W2) en Mutant (BBHm292) achtergronden. Figuur 1 toont de experimentele tijdlijn.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> Figuur 1 : Afbeelding van experimentele tijdlijn om hersenletsel, bewegings en neuroinflammatory uitkomsten te karakteriseren. ICH, intracerebrale bloeding; BBH, bubblehead. Figuur is gereproduceerd uit Crilly et al.20 met toestemming onder een Creative Commons licentie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a> 
1. dag 0: productie en inzameling van eieren
<ol><li>Verzamel bevruchte embryo's van natuurlijke paaien in kweek dozen, geproduceerd uit 1 mannelijke en 1-2 vrouwelijke volwassen zebravis. Opmerking: voor Atorvastatine protocol alle wild type/transgene dieren kunnen worden gebruikt echter bloeding verschillen enigszins tussen de stammen.</li>
	<li>Incubeer 100 embryo's bij 28 °C in standaard E3 embryo medium per Petri schaaltje en fase volgens standaard richtlijnen26.</li>
	<li>Op ~ 6 uur na de bevruchting (HPF) verwijderen van dode en onbevruchte embryo's van de schotel met behulp van een Pasteur pipet.</li>
</ol>2. dag 1: Atorvastatine behandeling op 24 HPF
<ol><li>Dechorionate embryo's voor Atorvastatine behandeling met behulp van scherpe ultra dunne dissectie Tang27. Nummers die nodig zijn voor experimenten kunnen dienovereenkomstig worden aangepast.</li>
	<li>Voeg 30 mL E3 embryo medium toe aan twee schone Petri schalen. Gebruik een schotel voor 100 embryo's. Opmerking: als platen zijn ontworpen voor de cel cultuur, dechorionated zebravis in dit vroege stadium vaak vasthouden aan de bodem. Om dit te voorkomen, spoel de platen grondig in schoon water voor gebruik.</li>
	<li>Verwijder 60 µ L van het embryo water van de behandelings plaat en voeg 60 µ L van 0,5 mM atorvastatin (ATV) toe. Op een 0,5 mM voorraad concentratie, de bovenstaande verdunning zal resulteren in een definitieve concentratie van 1 µ M, die zal resulteren in ~ 20% van de larven niet-hemorragische (ICH-) en ~ 80% van de larven bloedde (ICH +). Gebruik de andere plaat voor onbehandelde controles Opmerking: Atorvastatine is solubilized in gedistilleerd water (3 mg in 10 mL) om een 0,5 mM voorraad oplossing te maken. Incubeer overnachting bij kamertemperatuur in het donker met agitatie als oplosbaar maken duurt enige tijd. Volledige oplosbaar maken kan tot 1 week duren. Gebruik geen DMSO. Oplossing wordt gepaard en opgeslagen bij-20 °C. Ontdooi niet bevriezen.</li>
	<li>Met behulp van een Pasteur Pipet, Transfer 100 embryo's in zo weinig mogelijk water naar de behandeling platen.</li>
	<li>Incubeer de platen bij 28 °C. Opmerking: ICH treedt op tussen 33 en 48 HPF. Atorvastatine hoeft niet te worden verwijderd als incubatie langer dan 24 h veroorzaakt geen verdere ontwikkelingsproblemen.</li>
</ol>3. dag 2: het scheiden van ICH-en ICH + populaties op 50 HPF
<ol><li>Aparte ICH + Fish van ICH-populaties en transfer naar nieuwe gerechten voor het gemak.<ol>
<li>Als het gebruik van de ATV-model op een concentratie van 1 µ M, 75-100% van de larven zal vertonen bloeding (ICH +) op dit moment punt. Nota: de reactie van de larven verschilt tussen spanningen, als de larven niet bij de gewenste frequenties bloeden, een verse partij van Atorvastatine of een hogere concentratie gebruiken. Als larven niet hebben tentoongesteld bloeding door 48 HPF dan beschouwen ze ICH-.</li>
		<li>Bij gebruik van de BBH model, zullen alle homozygous mutanten vertonen bloeding door 48 HPF. Als het gebruik van een zygoot incross, de ICH-zygoot en wild type broers en zussen kunnen worden gebruikt als controledieren voor experimenten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Indien nodig, anaesthetize de larven door toevoeging van 0,02% MS222 aan de E3 media. Met behulp van een Pasteur Pipet, Sorteer de larven voor de aanwezigheid van bloed in het hoofd in verse E3 media. Zie Figuur 2. Opmerking: bloed in het hoofd kan verschijnen in de voorgrond, mid of achterhersenen of in combinatie, en bloeden volume kan variëren tussen dieren. In de BBH mutanten, ICH wordt vaak geassocieerd met ernstige oedeem herkenbaar door grotere hoofden, bredere ruimte tussen de ogen en een meer diffuse bloeden. Nochtans niet alle ICH + BBH larven tentoongesteld voorwerp oedeem.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig2.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> Figuur 2 : Ich + hersenbloeding fenotypes. Voorbeelden van larvale ICH fenotypes gehandhaafd op een transgene gata1: DsRed reporter parelmoer achtergrond waargenomen met een helderveld stereomicroscoop (top panelen) en fluorescentie (onderste paneel) op ~ 48 h post-fertilisatie. Er werden geen bloedingen waargenomen in ICH-larven (linkse panelen). Een duidelijke accumulatie van rode bloedcellen in de forebrain en achterhersenen (pijlen) werden waargenomen in ICH + larven (rechter panelen). Schaal balken vertegenwoordigen 250 µm. figuur is overgenomen uit Crilly et al.20 met toestemming onder een Creative Commons licentie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a> 
4. dag 3: celdood en leukocyten analyse op 72 HPF
<ol><li>Het scherm van de larven met behulp van een fluorescentiemicroscoop om de expressie van fluorescerende eiwitten te waarborgen. Opmerking: in deze studie, transgene alomtegenwoordige: SecAnnexinV-mVenus larven werden gebruikt om de hersenen celdood en dubbele transgene MPOrapport: GFP; MPEG1: mCherry of alomtegenwoordige: secAnnexinV-mVenus; MPEG1: mCherry gebruikt voor leukocyten analyse.</li>
	<li>Vul de lightsheet montagekamer met E3 media met 0,02% MS222.</li>
	<li>Anaesthetize de larven met behulp van 0,02% MS222. Breng de larven voor montage (n = 1-6) naar een droge Petri schaal oppervlak in één druppel. Verwijder zo veel mogelijk vloeistof. Nota: 1,5% lage smelting agarose wordt voorbereid gebruikend 0,15 g van lage smelting agarose opgelost in 10 mL van E3 middel zonder methyleenblauw in een microgolf en gehouden bij 45 °C tot gebruik.</li>
	<li>Voeg een druppel van 1,5% laag-smelt agarose (gehandhaafd als vloeistof in een 45 °C warmte blok) aan de larven en met behulp van een 800 µm montage capillaire, en trek de larven omhoog hoofd eerst. Als het plaatsen niet nauwkeurig is kunnen de larven van agarose worden verdreven en opnieuw worden opgezet. Laat het capillair afkoelen voordat u in de lightsheet kamer. Opmerking: als alternatief kan een confocale Microscoop worden gebruikt voor deze procedure. Voor dit, zouden de larven lateraal in agarose op een glasbodem schotel moeten worden opgezet.</li>
	<li>Verwerven z-stack beelden van het hoofd tussen de ogen lenzen (~ 300 µm) en het proces om maximale intensiteit projectie beeld.<ol>
<li>Analyseer hersen regio van beelden verzameld voor het totale aantal fluorescentie cellen en de totale intensiteit fluorescentie20.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Maak een time lapse video van meerdere projectie composieten meer dan 18-24 h te volgen leukocyten mobiliteit en interactie met stervende cellen. Nota: als de lange termijn levende weergave wordt uitgevoerd, wordt slechts één larve opgezet in het capillair.</li>
	<li>Wanneer de beeldvorming is voltooid verdrijven de larven van de montage capillaire in een dodelijke overdosis van 4% MS222 tot euthanaseren.</li>
</ol>5. dag 3: het selecteren van larven voor beweeglijkheid assay op 72 HPF
<ol><li>Anaesthetize larven in de petrischalen met 0,02% MS222.</li>
	<li>Kies willekeurig n = 24 larven voor beweeglijkheid assay en overdracht in verse E3 media en laat dieren om te herstellen van verdoving. Opmerking: verdoving op dit punt verwijdert selectie bias voor langzame zwemmers die gemakkelijk te vangen.</li>
</ol>6. dag 3-5: het testen van motoriek bij 72, 96 en 120 HPF
<ol><li>Transfer larven geselecteerd op 72 HPF in E3 medium zonder methyleenblauw. Opmerking: voor het testen op 3 DPF kunnen de larven ruime tijd om te herstellen van verdoving (> 1 uur).</li>
	<li>Plaat een larve in 1 mL per put van een 24-goed plaat met behulp van een pipet. Opmerking: Knip het uiteinde van de pipet-tip om beschadiging van de larven te voorkomen. De grootte van de plaat kan volgens experimenteel ontwerp worden veranderd.</li>
	<li>Laad platen in de camera kamer en assay beweging voor 10 min met behulp van een wit licht schrikken routine om spontane zwemmen te verhogen. Opmerking: zwemmen gedrag werd bijgehouden met behulp van een camera kamer en tracking software (Zie de tabel van de materialen).</li>
	<li>Herhaal experiment met dezelfde larven op 96 en 120 HPF. Verplaats larven van individuele huisvesting in assay plaat naar een Petri schaaltje en Incubeer bij 28 °C tussen de assays.</li>
	<li>Bij assay voltooiing, euthanaseren larven in een dodelijke overdosis van 4% MS222.</li>
</ol>

<ol>
	<li>An, S. J., Kim, T. J., Epidemiology Yoon, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology,+risk+factors,+and+clinical+features+of+intracerebral+hemorrhage:+an+update.">Epidemiology, risk factors, and clinical features of intracerebral hemorrhage: an update.</a> Journal of stroke. 19 (1), 3 (2017).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The top 10 causes of death. , (2017).</li><li>Casals, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+animal+models+for+stroke+research:+a+review.">The use of animal models for stroke research: a review.</a> Comparative medicine. 61 (4), 305-313 (2011).</li><li>Kellner, C. P., Connolly, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+Strategies+for+Intracerebral+Hemorrhage+Trials+and+Translation.">Neuroprotective Strategies for Intracerebral Hemorrhage Trials and Translation.</a> Stroke. 41 (10 Suppl 1), S99-S102 (2010).</li><li>Kirkman, M. A., Allan, S. M., Parry-Jones, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+intracerebral+hemorrhage:+avoiding+pitfalls+in+translational+research.">Experimental intracerebral hemorrhage: avoiding pitfalls in translational research.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (11), 2135-2151 (2011).</li><li>ASPA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 1986 amendments. , (2012).</li><li>Butler, M. G., Gore, A. V., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in cell biology. 105, 137-161 (2011).</li><li>Walcott, B. P., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+of+cerebrovascular+disease.">Zebrafish models of cerebrovascular disease.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 34 (4), 571-577 (2014).</li><li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+mediate+the+repair+of+brain+vascular+rupture+through+direct+physical+adhesion+and+mechanical+traction.">Macrophages mediate the repair of brain vascular rupture through direct physical adhesion and mechanical traction.</a> Immunity. 44 (5), 1162-1176 (2016).</li><li>Kasher, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+samhd1+morphant+zebrafish+recapitulates+features+of+the+human+type+I+interferonopathy+Aicardi-Goutieres+syndrome.">Characterization of samhd1 morphant zebrafish recapitulates features of the human type I interferonopathy Aicardi-Goutieres syndrome.</a> The Journal of Immunology. 194 (6), 2819-2825 (2015).</li><li>Wen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+rnf213a+by+TALEN+causes+abnormal+angiogenesis+and+circulation+defects+in+zebrafish.">Mutation of rnf213a by TALEN causes abnormal angiogenesis and circulation defects in zebrafish.</a> Brain research. 1644, 70-78 (2016).</li><li>Eisa-Beygi, S., Rezaei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etiology+of+intracerebral+hemorrhage+(ICH):+novel+insights+from+Zebrafish+embryos.">Etiology of intracerebral hemorrhage (ICH): novel insights from Zebrafish embryos.</a> International Journal of Developmental Biology. 60 (4-5-6), 119-126 (2016).</li><li>Mracsko, E., Veltkamp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation+after+intracerebral+hemorrhage.">Neuroinflammation after intracerebral hemorrhage.</a> Frontiers in cellular neuroscience. 8, 388 (2014).</li><li>Eisa-Beygi, S., Hatch, G., Noble, S., Ekker, M., Moon, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA+reductase+(HMGCR)+pathway+regulates+developmental+cerebral-vascular+stability+via+prenylation-dependent+signalling+pathway.">The 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (HMGCR) pathway regulates developmental cerebral-vascular stability via prenylation-dependent signalling pathway.</a> Developmental biology. 373 (2), 258-266 (2013).</li><li>Shen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+Rho-kinase+inhibitors+by+docking-based+virtual+screening.">Discovery of Rho-kinase inhibitors by docking-based virtual screening.</a> Molecular BioSystems. 9 (6), 1511-1521 (2013).</li><li>Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tanshinone+I+prevents+atorvastatin-induced+cerebral+hemorrhage+in+zebrafish+and+stabilizes+endothelial+cell-cell+adhesion+by+inhibiting+VE-cadherin+internalization+and+actin-myosin+contractility.">Tanshinone I prevents atorvastatin-induced cerebral hemorrhage in zebrafish and stabilizes endothelial cell-cell adhesion by inhibiting VE-cadherin internalization and actin-myosin contractility.</a> Pharmacological research. , (2017).</li><li>Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+ROCK+inhibitor,+FPND,+which+prevents+cerebral+hemorrhage+through+maintaining+vascular+integrity+by+interference+with+VE-cadherin.">Discovery of a ROCK inhibitor, FPND, which prevents cerebral hemorrhage through maintaining vascular integrity by interference with VE-cadherin.</a> Cell death discovery. 3, 17051 (2017).</li><li>Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&#946;Pix-Pak2a+signaling+pathway+regulates+cerebral+vascular+stability+in+zebrafish.">A &#946;Pix-Pak2a signaling pathway regulates cerebral vascular stability in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (35), 13990-13995 (2007).</li><li>ten Klooster, P. J., Jaffer, Z. M., Chernoff, J., Hordijk, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+and+activation+of+Rac1+are+mediated+by+the+exchange+factor+&#946;-Pix.">Targeting and activation of Rac1 are mediated by the exchange factor &#946;-Pix.</a> The Journal of cell biology. 172 (5), 759-769 (2006).</li><li>Crilly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+zebrafish+larval+models+to+study+brain+injury,+locomotor+and+neuroinflammatory+outcomes+following+intracerebral+haemorrhage.">Using zebrafish larval models to study brain injury, locomotor and neuroinflammatory outcomes following intracerebral haemorrhage.</a> F1000Research. 7, (2018).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish. , (2000).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).</li><li>Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li><li>Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants.">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nature immunology. 4 (12), 1238 (2003).</li><li>Morsch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+microglial+engulfment+of+dying+neurons+in+the+zebrafish+spinal+cord.">In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord.</a> Frontiers in cellular neuroscience. 9, (2015).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Liang, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish in the Classroom. , (2011).</li><li>Yang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miconazole+protects+blood+vessels+from+MMP9-dependent+rupture+and+hemorrhage.">Miconazole protects blood vessels from MMP9-dependent rupture and hemorrhage.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 10 (3), 337-348 (2017).</li><li>Andaluz, N., Zuccarello, M., Wagner, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+animal+models+of+intracerebral+hemorrhage.">Experimental animal models of intracerebral hemorrhage.</a> Neurosurgery Clinics of North America. 13 (3), 385-393 (2002).</li><li>Rosenberg, G. A., Mun-Bryce, S., Wesley, M., Kornfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagenase-induced+intracerebral+hemorrhage+in+rats.">Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats.</a> Stroke. 21 (5), 801-807 (1990).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Deze studie toont aan dat ICH in zebravis larven induceert een hersenletsel reactie die recapituleert belangrijke aspecten van de menselijke conditie die systematisch kan worden getest en gekwantificeerd. Zebravis bieden een consistente en reproduceerbare model van spontane ich die zal helpen met de toekomstige drugs interventiestudies gericht op het richten van bloed-geïnduceerde hersenletsel, in plaats van het voorkomen van schipbreuk17,28. Inderdaad, gezien de snelle aard van de ziekte begin verwant aan de klinische situatie, een dergelijke aanpak biedt spannende perspectieven voor een succesvolle vertaling in de toekomst.
Sommige beperkingen worden geassocieerd met het gebruik van zebravis larven, zoals het gebruik van een ontwikkelingssysteem en taxonomische rang, maar de praktische en wetenschappelijke voordelen van dit model moet worden beschouwd om nieuwe inzichten te bieden in ICH. Er is geen operatie nodig om een bloeding te initiëren of om cellulaire processen gedurende langere perioden na verwonding te monitoren. Hoge Fecundity van zebravis paringen genereren gemakkelijk toegankelijke en grote steekproefgrootten, en wegens de snelle ontwikkeling van de larven wordt de experimentele chronologie beduidend verminderd in vergelijking met knaagdieren studies29,30.
Momenteel zijn deze modellen geschikt om te gebruiken voor het ophelderen van de onmiddellijke pathologische en immunologische reactie op spontane ICH in de hersenen van levende intacte dieren. Potentieel kan dit model worden aangepast voor middellange-High throughput drug schermen voor ICH therapieën, of preventief of herstel bevorderen. Als zodanig vormen de post-ICH-pathologieën die in deze studie worden voorgesteld een alternatief, complementair platform voor preklinisch ICH-onderzoek.

Intracerebrale bloeding (ICH) is de meest ernstige sub-type beroerte geassocieerd met spontane cerebrale schip scheuren en bloeden in de parenchym leidt tot hersenbeschadiging, lichamelijke handicap en vaak de dood1. Ondanks de hoge sterfte en morbiditeit in verband met ICH2, is het begrip van de onderbouwde etiologie en post-bloeding pathologie nog steeds ontbreekt. Als dusdanig, zijn er geen specifieke behandelingen om ICH te verhinderen of geduldige resultaten te verbeteren. De meeste van ons begrip van de ziekte biologie is afkomstig van pre-klinische knaagdieren modellen vanich3, maar studies to-date in deze modellen hebben nagelaten om een succesvolle therapeutische vertalen naar de kliniek4,5. Deze mislukking kan deels te wijten zijn aan een aantal beperkingen van deze preklinische modellen, met inbegrip van het onvermogen om gemakkelijk recapituleren de spontane aard van de menselijke ziekte en de eis voor invasieve chirurgie om de modellen te genereren in zoogdieren6. Bovendien, knaagdieren poseren praktische problemen met betrekking tot het observeren van de snelle aanvang van cellulaire reacties op ICH in intact weefsel. Gezien het ontbreken van de vertaling van knaagdieren modellen, het ontwikkelen van alternatieve modellen van spontane ICH is noodzakelijk als we deze praktische problemen te overwinnen en helpen bij het identificeren nieuwe drug targets.
De moleculaire mechanismen van vasculaire ontwikkeling zijn goed geconserveerd onder gewervelde dieren met inbegrip van zebravis (Danio rerio)7. Als dusdanig, wordt de goedkeuring van dit modelorganisme een steeds nuttigere mechanistische strategie voor het bestuderen van cerebrovasculaire ziekte8. Een aantal zebravis modellen zijn gegenereerd die recapituleren fenotypes geassocieerd met Stroke-gerelateerde voorwaarden9,10,11,12. Het gebruik van zebravis larven om ziekte pathogenese te onderzoeken biedt zowel praktische als wetenschappelijke voordelen ten opzichte van zoogdier modellen8. Dit omvat hoge reproductie tarieven, snelle ontwikkeling en larvale transparantie die het mogelijk maakt voor intravital Imaging zonder de invasieve beperkingen in verband met knaagdieren. Koppeling van deze voordelen met het brede scala van transgene reporter lijnen beschikbaar binnen de zebravis onderzoekgemeenschap bedraagt een krachtige in vivo aanpak voor het bestuderen van de ziekte biologie, nog niet gebruikt voor het bestuderen van de pathologische gevolgen van ICH.
De verwondings reactie op bloed in de hersenen is bifasische13; de primaire belediging veroorzaakt neuronale dood en cel necrose, die vervolgens initieert een secundaire Golf van schade die wordt veroorzaakt door ingeboren immuunsysteem activering. De tweede fase van hersenletsel, in het bijzonder de neuroinflammatory component, wordt beschouwd als een realistische doelstelling voor de toekomstige behandeling van drugs13. Spontane en cerebrale-specifieke bloedingen zijn beschreven in zebravis larven eerder14,15,16,17,18,19. Twee van dergelijke modellen zijn het gebruik van Atorvastatine (ATV) op 24 h post-fertilisatie (HPF) om de HMGCR pathway en cholesterol biosynthese14remmen, en een bubblehead (BBH) mutant die een hypomorphic mutatie in het arhgef7 gen, βpix te uiten, en remt vervolgens actine remodeling voor strakke endovasculaire verbindingen18. Deze modellen vertonen spontane cerebrale-specifieke bloedvaten scheuren bij het begin van de circulatie (~ 33 HPF). Onlangs hebben we gekenmerkt deze modellen verder te onthullen dat de belangrijkste aspecten van de hersenletsel reactie is geconserveerd tussen de mens en zebravis larven20. Deze studie toont de methodologie die nodig is om spontane hersenbloedingen te verkrijgen en te visualiseren in zebravis larven en hoe hersenletsel te kwantificeren, en bewegings en neuroinflammatory fenotypes die betrekking hebben op de menselijke conditie. Deze gegevens en technieken ondersteunen het gebruik van deze modelsoorten als een waardevol complementair systeem voor pre-klinisch ICH-onderzoek.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1159px;" width="1160">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">24 well plates</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">CLS3527</td>
			<td style="width:441px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">28 &#176;C incubator</td>
			<td style="width:227px;">LMS</td>
			<td align="right" style="width:165px;">210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Atorvastatin</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">PZ0001-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Breeding boxes</td>
			<td style="width:227px;">Thoren Aquatics systems</td>
			<td align="right" style="width:165px;">10011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Daniovision observation chamber</td>
			<td style="width:227px;">Noldus</td>
			<td style="width:165px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">E3 medium 1x</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:165px;"></td>
			<td>4% Instant Ocean, 500 &#181;L methylene blue in 1 L dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">EthoVision XT software</td>
			<td style="width:227px;">Noldus</td>
			<td style="width:165px;">version 11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heat block</td>
			<td style="width:227px;">Grant-Bio</td>
			<td>PHMT-PSC18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Instant ocean</td>
			<td style="width:227px;">Instant Ocean</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Lightsheet microscope</td>
			<td style="width:227px;">Zeiss</td>
			<td style="width:165px;">Z.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lightsheet microscope mounting capillary</td>
			<td style="width:227px;">Zeiss</td>
			<td>402100-9320-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Low melt agarose</td>
			<td style="width:227px;">Promega</td>
			<td style="width:165px;">V2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Methylene Blue</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">319112-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Microscope&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Leica</td>
			<td style="width:165px;">MZ95</td>
			<td>dissection microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Microscope</td>
			<td style="width:227px;">Leica</td>
			<td>M165FC</td>
			<td>fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;">MS222</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td></td>
			<td>4g tricaine powder, 500 mL of dH2O, 10 mL of 1 M Tris (pH 9). Adjust pH to ~7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P1000 pipette</td>
			<td style="width:227px;">Gilson</td>
			<td>F144059M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">P1000 pipette tips</td>
			<td style="width:227px;">Starlab</td>
			<td style="width:165px;">S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pasteur pipettes</td>
			<td style="width:227px;">Starlab</td>
			<td style="width:165px;">E1414-0300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dishes&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Corning</td>
			<td style="width:165px;">101VR20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipetboy</td>
			<td style="width:227px;">Integra Biosciences</td>
			<td style="width:165px;">PIPETBOY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Stripette 25ml</td>
			<td style="width:227px;">Corning</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Tricaine powder</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">A5040-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Base</td>
			<td style="width:227px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:165px;">BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra fine dissection forceps</td>
			<td style="width:227px;">Agar scientific</td>
			<td style="width:165px;">AGT502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Zen software</td>
			<td style="width:227px;">Zeiss</td>
			<td style="width:165px;">version 2.3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using zebrafish larvae to study the pathological consequences of hemorrhagic stroke

Ondanks het feit dat de meest ernstige subtype van een beroerte met een hoge wereldwijde sterfte, is er geen specifieke behandeling voor patiënten met intracerebrale bloeding (ICH). Modellering ICH pre-klinisch heeft bewezen moeilijk, en de huidige knaagdieren modellen slecht recapituleren de spontane karakter van de menselijke ICH. Daarom is er dringend behoefte aan alternatieve preklinische methodologieën voor de studie van ziektemechanismen in ICH en voor mogelijke drugs ontdekking.
Het gebruik van zebravis vertegenwoordigt een steeds populairder wordende benadering voor translationeel onderzoek, hoofdzakelijk wegens een aantal voordelen die zij over zoogdier modellen van ziekte hebben bezitten, met inbegrip van productieve reproductie tarieven en larvale transparantie toestaand voor levende Imaging. Andere groepen hebben vastgesteld dat zebravis larven kunnen spontane ICH vertonen na genetische of chemische verstoring van cerebrovasculaire ontwikkeling. Het doel van deze methodologie is om dergelijke modellen te gebruiken om de pathologische gevolgen van hersenbloeding te bestuderen, in het kader van pre-klinisch ICH-onderzoek. Door het gebruik van Live Imaging en beweeglijkheid assays, hersenbeschadiging, neuroinflammation en bewegings functie na ICH kan worden beoordeeld en gekwantificeerd.
Deze studie toont aan dat de belangrijkste pathologische gevolgen van hersenbloeding bij de mens worden bewaard in zebravis larven markeren het modelorganisme als een waardevol in vivo systeem voor pre-klinisch onderzoek van ICH. Het doel van deze methodologie is om de pre-klinische beroerte Gemeenschap om de zebravis larvale model in dienst als een alternatief complementair modelsysteem voor knaagdieren.

Beoordeling van hersen celdood met behulp van transgene alomtegenwoordige:SecAnnexinV-mVenus resulteert in duidelijke definitieve clusters van stervende cellen in ich + larven in zowel ATV als BBH modellen die afwezig zijn in alle ich-larven (Figuur 3). Clusters wijken voor 96 HPF. Door middel van beeldanalyse, bloeden wordt geassocieerd met een significante twee-voudige toename van de totale intensiteit van de fluorescentie-signaal in de hersenen, met vermelding van gemarkeerde celdood.
Een neuroinflammatory reactie wordt geïdentificeerd in ICH + larven door significant toegenomen aantallen MPEG1 positieve macrofagen cellen in de hersenen. Het aantal van de totale MPO positieve neutrofiele cellen ook verhoogd maar dit bereikte geen statistische significantie (Figuur 4). De morfologie van het MPEG1 positieve macrofagen kan ook worden gezien om te veranderen in ich + larven als de cellen nemen een actieve, afgerond, amoeboid vorm. Deze geactiveerde afgeronde cellen kunnen ook in de loop van de tijd worden bewaakt om een verhoogde fagocyterende reactie van de alomtegenwoordige te tonen :SecAnnexinV-mVenus uitdrukken van stervende cellen in ich + larven (Figuur 5). MPEG1 positieve macrofagen exposeren vertakte processen werden gecategoriseerd als inactief.
Hersenbloeding wordt geassocieerd met een significante daling van de beweeglijkheid op 72 en 96 HPF in vergelijking met ICH-sibling controles in zowel BBH en ATV modellen (Figuur 6). De beweeglijkheid bij 120 HPF herstelt aan dichtbijgelegen basislijn niveaus. Er zijn vaak verschillen in Baseline beweeglijkheid tussen ei klauwen en stammen en dus vergelijking moet worden gemaakt om ICH-controles elke keer.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig3.jpg"> Figuur 3 : Intracerebrale bloeding (ich) in zebravis larven resulteert in een kwantificeerbare hersenletsel. (A) representatieve beelden van het hersenletsel fenotype in ich + larven (rechter panelen), in vergelijking met ich-broers en zussen (linker panelen), op 72 HPF. Helderveld beelden (onderste panelen, schaalbalk = 250 µm) tonen de aanwezigheid van hersenbloedingen (pijlen) in ICH + larven. Fluorescente microscopie werd uitgevoerd om celdood in de alomtegenwoordige te visualiseren :SecAnnexinV-mVenus verslaggever lijn (hoogste panelen, schaal staaf = 100 µm). Clusters van stervende cellen werden waargenomen in peri-hematomal regio's. De beelden werden bijgesneden aan hersenen-slechts gebieden en werden geanalyseerd voor totale groene fluorescentie intensiteit in ronde deeltjes groter dan 30 pixel in diameter (witte lijn) gebruikend de macro in supplementair dossier 1. Bkwantificering van het fluorescentie signaal in de hersenen van onbehandelde, ich-en ich + larven verkregen via het ATV-model (n = 12 per groep; 3 onafhankelijke repliceert) op 72 HPF. Significante verschillen werden waargenomen bij het vergelijken van ICH + met onbehandeld (* * p = 0,004) en met ICH-(* p = 0,03) broers en zussen. Ckwantificering van het fluorescentie signaal als voorgelezen voor annexinV binding in de hersenen van ich-en ich + larven verkregen via het bubblehead (BBH) model (n = 12 per groep; 2 onafhankelijke repliceert) op 72 HPF. Grafieken tonen SD van het gemiddelde. Een significant verschil in mVenus fluorescentie werd waargenomen tussen ICH + en ICH-Age-matched broers en zussen (* * p = 0,002). Figuur is gereproduceerd uit Crilly et al.20 met toestemming onder een Creative Commons licentie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig4.jpg"> Figuur 4 : Intracerebrale bloeding (ich) initieert een aangeboren cellulaire immuunrespons in de zebravis larvale hersenen. Aantallen leukocyten gekwantificeerd in de hersengebieden eerder beschreven voor MPO: GFP; MPEG1: dsRed dubbele transgene larven (n = 8 per groep; 2 onafhankelijke repliceert) op 72 HPF onthult een significante toename van de macrofagen (* p = 0,01), maar niet neutrofielen (p = 0,5), in antwoord op ICH. Figuur is gereproduceerd uit Crilly et al.20 met toestemming onder een Creative Commons licentie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a> 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig5.jpg"> Figuur 5 : Geactiveerde macrofagen cellen tonen een fagocyterende reactie op de hersenletsel. (A) representatieve time-lapse Stills20 waaruit een vertakte patrouilleren macrofagen migreren naar een annexinV positieve cel (i-VI). Stills zijn verkregen uit een reeks van beelden genomen van de hele hersenen met behulp van een 20x doelstelling. Schaalbalk vertegenwoordigt 50 µm. De macrofagen verwierf een amoeboid morfologie (v) voor phagocytosing de annexinV-positieve cel (VI, VII). Na fagocytose hervat de macrofagen een vertakte morfologie en migreert weg en de annexinV-positieve cel kan niet meer gezien worden (VIII). Vertakte macrofagen (#), annexinV positive Cell (pijl), amoeboid macrofagen (*) zijn geïndiceerd. (B) representatieve beelden van MPEG1-positieve cellen in de ich-en ich + larvale hersenen exposeren amoeboid en vertakte morfologie. Schaal balken vertegenwoordigen 50 µm.ceen verhoogd aandeel van amoeboid (fagocyterende) en een verlaagd aandeel van vertakte (inactieve) macrofagen werd WAARGENOMEN in ich + Brains in vergelijking met ich-broers en zussen. Figuur is gereproduceerd uit Crilly et al.20 met toestemming onder een Creative Commons licentie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a> 
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig6.jpg"> Figuur 6 : Ich-geïnduceerd hersenletsel resulteert in een kwantificeerbare bewegings tekort in zebravis larven. (A) representatieve voorbeelden van de zwemmende sporen in ich-en ich + BBH larven bij 72, 96 en 120 HPF. (B) Ich + larven tentoongesteld een significante daling van de cumulatieve tijd besteed mobiel tijdens de 10 min opnameperiode op zowel 72 en 96 HPF. Significantie werd verloren op de 120 HPF tijdpunt potentieel zinspeelde op herstel van hersenletsel (n = 24 larven per groep; 3 onafhankelijke repliceert; * * * * p = 0,00006; * * p = 0,003; NS: p = 0,08). Ckwantificering van de cumulatieve tijd die is besteed aan het verplaatsen van onbehandelde en ATV-behandelde ich-en ich + larven op 120 HPF. ICH + larven tentoongesteld een significante daling van de cumulatieve tijd besteed mobiele tijdens de 10 min opnameperiode. Drie technische replica's (n = 24 larven per groep) werden gebruikt om SD te berekenen van het gemiddelde (* * * p = 0,00004, * * p = 0,0003). Figuur is gereproduceerd uit Crilly et al.20 met toestemming onder een Creative Commons licentie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a> 
Supplementair dossier 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/Supplementary_File_1-Macro.docx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using Zebrafish Larvae to Study the Pathological Consequences of Hemorrhagic Stroke at JoVE.com

Using Zebrafish Larvae to Study the Pathological Consequences of Hemorrhagic Stroke

Hier presenteren we een protocol om hersenletsel te kwantificeren, bewegings tekorten en neuroinflammation na bloeden in de hersenen in zebravis larven, in de context van de menselijke intracerebrale bloeding (ICH).

Met behulp van zebravis larven om de pathologische gevolgen van hemorragische beroerte studie

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage ...

Deze methode biedt een gratis preklinische benadering voor het bestuderen van de onmiddellijke cellulaire reactie op bloed in de hersenen na een hemorragische beroerte, een zeer ernstige aandoening waarvoor we geen specifieke medicijnen beschikbaar hebben voor patiënten. In tegenstelling tot knaagdiermodellen, stellen de transparantie van zebravissenlarven ons in staat om cellulaire reacties in de hersenen van levende intacte dieren in realtime te observeren met behulp van fluorescerende microscopie. Om te beginnen, gebruik maken van een thee zeef om alle bevruchte embryo's te verzamelen van natuurlijke paaien in fokdozen geproduceerd uit een mannelijke en een tot twee vrouwelijke volwassen zebravissen.Breng 100 embryo's over naar elk petrischaaltje met standaard E3 embryomedium. Incubeer bij 28 graden Celsius en stadium volgens de standaard richtlijnen. Verwijder na zes uur bevruchting dode en onbevruchte embryo's uit de schaal met behulp van een Pasteur pipet en zet de gerechten terug in de couveuse.Gebruik na 24 uur na de bevruchting, onder een helderveldstereoscoop, scherpe ultradunne dissectie-tangen om embryo's te decorioneren voor de behandeling met Atorvastatine. Voeg vervolgens 30 milliliter E3-embryomedium toe aan twee schone petrischaaltjes, een voor behandeling en de andere voor controle. Verwijder 60 microliter embryowater uit de behandelingsschaal en voeg 60 microliter van 0,5 millimolar Atorvastatine toe om 80% van de larven te krijgen.Breng met behulp van een Pasteur pipet 100 embryo's in zo min mogelijk water naar elk gerecht. Broed de twee gerechten op 28 graden Celsius. Op elk moment na 50 uur na de bevruchting, onder de microscoop gebruik maken van een Pasteur pipet om zorgvuldig te scheiden bloedingen vis van niet-bloedingen populaties en de overdracht van de larven naar nieuwe gerechten met verse E3 media.Om het gemakkelijker te maken om bloedingspositieve larven te scheiden, u vis gebruiken zonder pigment of vis die fluorescerend eiwit in rode bloedcellen uitdrukken. Op de derde dag, onder een fluorescerende microscoop scherm de larven om de expressie van fluorescerend eiwit te garanderen. Vul vervolgens de lichtplaatmontagekamer met E3-media met 0,2% MS-222 voor verdovening.Breng met behulp van een Pasteur pipet een enkele druppel met één tot zes larven over op een droog petrischaaloppervlak voor montage. Gebruik een pipet om zoveel mogelijk vloeistof te verwijderen. Voeg een druppel van 1,5% lage smelt toe van het 45 graden Celsius warmteblok aan de larven en gebruik een 800 micrometer montagecapillaire om de larven eerst het hoofd omhoog te trekken.Als de positionering niet nauwkeurig is, verdrijft u de larven uit de agarose en zet u opnieuw op. Laat de capillaire afkoelen en steek vervolgens in de lichtplaatkamer. Druk op de ZEN-beeldsoftware continu om de larven te oriënteren en druk op het verwerven van z-stack beelden van het hoofd tussen de ooglenzen.Genereer op het tabblad verwerking een maximale intensiteitsprojectieafbeelding van elke z-stack. Om willekeurig te selecteren voor beweeglijkheidstest, breng 24 larven na anesthesie over in verse E3-media en laat de dieren herstellen van anesthesie. Nadat larven volledig hersteld zijn van anesthesie, met behulp van een pipet met de eindsnijoverdracht herstelde larven in E3-medium zonder methyleenblauw.Plaat een larve in een milliliter per put van een 24 put plaat. Laad de plaat in de camerakamer. Pas in de EthoVision XT tracking software de experimentinstellingen aan om een witte lichtge schrikroutine in te stellen om spontaan zwemmen te verhogen en beweging gedurende 10 minuten te testen.Herhaal de voortbeweging test op 96 en 120 uur post-fertilizatine. Beoordeling van de dood van hersencellen met behulp van een transgene alomtegenwoordige bijlage in V M veneuze reporter lijn resulteert in duidelijke duidelijke clusters van stervende cellen in bloedingen larven die afwezig zijn in alle niet-bloedinglarven aangegeven door groene fluorescentie Bright-field beelden tonen de aanwezigheid van hersenbloedingen. Stervende cellen werden waargenomen in zowel Atorvastatine en bubble head modellen voor bloedingen larven.De morfologie van de MPEG1 positieve macrofagen veranderingen in intracerebrale bloeding positieve larven als de cellen vast te stellen in actieve afgeronde amoeboid vorm. Deze geactiveerde afgeronde cellen werden na verloop van tijd gecontroleerd om een verhoogde fagocytische respons van de alomtegenwoordige annexin afgescheiden Annexin V M veneuze uitdrukken stervende cellen in intracerebrale bloeding positieve larven te tonen. Hersenbloeding wordt geassocieerd met een significante afname van de beweeglijkheid op 72 en 96 uur na de bevruchting in vergelijking met intracerebrale bloeding negatieve broer of zus controles.Beweeglijkheid op 120 uur na de bevruchting herstelt tot in de buurt van baseline niveaus. Het belangrijkste aspect van deze procedure is om er zeker van te zijn dat de larven grondig worden onderzocht op de aanwezigheid of afwezigheid van hersenbloedingen voordat u overgaat tot de fenotyperingstesten. Dit model kan ook worden gebruikt voor screening van geneesmiddelen om te bepalen of fenotype ernst kan worden verbeterd na een bloeding, een aanpak die ons kan leiden tot het identificeren van nieuwe kandidaat-geneesmiddelen in de toekomst.Deze techniek stelt ons in staat om de cellulaire reacties onmiddellijk na een bloeding in de hersenen te verkennen tijdens een tijdspunt dat is zo berucht moeilijk om te studeren voor nu. Hoewel geen van de in dit protocol beschreven reagentia of instrumenten specifiek gevaarlijk is, moeten standaardzorg en voorzorgsmaatregelen overal worden genomen wanneer u chemische stoffen, scherpe stoffen of lasers gebruikt.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualisatie van proprioceptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven en poppen

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Lichte voorkeur Assay om Aangeboren en Circadiaanse Gereglementeerde Photobehavior studeren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

Geautomatiseerde High-throughput Behavioral Analyses in zebravis Larven

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

Afleiden van de Time Cursus van Glutamaat Clearance met een Deconvolutie Analyse van astrocyten Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

Electroretinogram Analyse van de Visual Response in zebravis Larven

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

Utilizing 3D Printing Technology to Merge MRI with Histology: A Protocol for Brain Sectioning

Met behulp van 3D-printtechnologie om samenvoegen MRI met de histologie: A Protocol for Brain Snijden

Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Tijdafhankelijke toename in het netwerkrespons bij de stimulatie van neuronale celculturen op micro-elektrode arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

Ablatie van een neuronale bevolking met behulp van een twee-foton Laser en haar beoordeling met Calcium Imaging en gedrags opname in Zebrafish larven

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

In vivo beeldvorming van volledig actief hersenweefsel in wakkere zebravislarven en juvenielen door schedel- en huidverwijdering

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...