Name: using zebrafish larvae to study the pathological consequences of hemorrhagic stroke
Uploaded: 2019-06-05T15:00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Zebrafish Larvae to Study the Pathological Consequences of Hemorrhagic Stroke at JoVE.com

हम डॉ डेविड स्पेलर और उपकरण के उपयोग के लिए मैनचेस्टर सिस्टम्स Microscopy कोर सुविधा के विश्वविद्यालय का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, प्रो रिचर्ड Baines के उपयोग के लिए DanioVision और डॉ जैक नदियों-सांख्यिकी परामर्श के लिए Auty. Bbh लाइन कृपया डॉ सारा बच्चे की प्रयोगशाला से निकोल Munsie द्वारा कैलगरी विश्वविद्यालय में साझा किया गया । हम प्रो स्टीफन रेनशॉ, डॉ एडम हुल्स्टोन, डॉ एंड्रयू बडरॉक और डॉ हेलेन यंग को फिश लाइंस और इक्विपमेंट के लिए भी धन्यवाद देते हैं ।
इस अध्ययन NC3Rs द्वारा समर्थित किया गया था (नेकां/N002598/1), स्ट्रोक एसोसिएशन (TSA LECT 2017/02), युग नेट ंयूरॉन (श्री/M501803/ हम भी विशेष रूप से नेटली केट मॉस ट्रस्ट और उनके जारी वित्तीय सहायता के लिए जीव विज्ञान, चिकित्सा और स्वास्थ्य के मैनचेस्टर संकाय के विश्वविद्यालय के लिए आभारी हैं ।

<ol>
	<li>An, S. J., Kim, T. J., Epidemiology Yoon, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology,+risk+factors,+and+clinical+features+of+intracerebral+hemorrhage:+an+update.">Epidemiology, risk factors, and clinical features of intracerebral hemorrhage: an update.</a> Journal of stroke. 19 (1), 3 (2017).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The top 10 causes of death. , (2017).</li><li>Casals, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+animal+models+for+stroke+research:+a+review.">The use of animal models for stroke research: a review.</a> Comparative medicine. 61 (4), 305-313 (2011).</li><li>Kellner, C. P., Connolly, E. 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B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Liang, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish in the Classroom. , (2011).</li><li>Yang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miconazole+protects+blood+vessels+from+MMP9-dependent+rupture+and+hemorrhage.">Miconazole protects blood vessels from MMP9-dependent rupture and hemorrhage.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 10 (3), 337-348 (2017).</li><li>Andaluz, N., Zuccarello, M., Wagner, K. 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लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

इस अध्ययन से पता चलता है कि zebrafish लार्वा में आईसीएच मस्तिष्क चोट प्रतिक्रिया लाती है कि मानव की स्थिति है कि व्यवस्थित रूप से assayed और मात्रा की जा सकती है के प्रमुख पहलुओं recapitulates । Zebrafish सहज, जो भविष्य में दवा हस्तक्षेप अध्ययन रक्त प्रेरित मस्तिष्क चोट को लक्षित करने पर ध्यान केंद्रित के बजाय पोत टूटना रोकने के17,28के साथ सहायता करेगा की एक सुसंगत और reproducible मॉडल प्रदान करते हैं । वास्तव में, रोग शुरुआत नैदानिक स्थिति के समान की तेजी से प्रकृति को देखते हुए, इस तरह के एक दृष्टिकोण भविष्य में सफल अनुवाद के लिए रोमांचक संभावनाएं प्रदान करता है ।
कुछ सीमाएं zebrafish लार्वा के उपयोग के साथ जुड़े रहे हैं, जैसे एक विकासशील प्रणाली और वर्गीकरण रैंक के उपयोग के रूप में, लेकिन इस मॉडल के व्यावहारिक और वैज्ञानिक लाभ आईसीएच में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए विचार किया जाना चाहिए । नकसीर शुरू करने के लिए या चोट के बाद समय की विस्तारित अवधि में सेलुलर प्रक्रियाओं की निगरानी करने के लिए कोई सर्जरी की आवश्यकता है । Zebrafish pairings के उच्च उर्वरता आसानी से सुलभ और बड़े नमूना आकार उत्पंन करते हैं, और लार्वा के तेजी से विकास के कारण प्रयोगात्मक समयरेखा रोहताश अध्ययन29,30की तुलना में काफी कम है ।
वर्तमान में इन मॉडलों के लिए तत्काल रोग और जीवित बरकरार जानवरों के मस्तिष्क में सहज आईसीइयूलॉजिकल प्रतिक्रिया elucidating के लिए उपयोग करने के लिए फिट हैं । संभवतः, इस मॉडल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है मध्यम उच्च throughput दवा स्क्रीन के लिए ICH चिकित्सा, चाहे preventative या वसूली को बढ़ावा देने । इस प्रकार, इस अध्ययन में प्रस्तुत की पोस्ट-च विकृतियों पूर्व नैदानिक आईसीएच अनुसंधान के लिए एक वैकल्पिक, पूरक मंच का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

Intracerebral नकसीर (आईसीएच) के सबसे गंभीर उप प्रकार के स्ट्रोक के सहज मस्तिष्क पोत टूटना और मस्तिष्क क्षति, शारीरिक विकलांगता और अक्सर1मौत के लिए अग्रणी पैरेंकाइमा में खून बह रहा है के साथ जुड़े । आईसीएच2के साथ उच्च मृत्यु दर और रुग्णता दरों से जुड़े होने के बावजूद अंडरपिनिंग एटियलजी और पोस्ट-हेमरेज पैथोलॉजी की समझ अभी भी कमी है । जैसे, वहां कोई विशेष उपचार के लिए आईसीएच को रोकने या रोगी परिणामों में सुधार कर रहे हैं । रोग जीवविज्ञान की हमारी समझ के अधिकांश पूर्व से आया है,3के नैदानिक कृंतक मॉडल, लेकिन अध्ययन करने के लिए इन मॉडलों में तिथि करने के लिए क्लिनिक4,5के लिए किसी भी सफल चिकित्सकीय अनुवाद करने में विफल रहा है । इस असफलता के भाग में कारण हो सकता है, इन पूर्व नैदानिक मॉडल की कुछ सीमाओं को आसानी से मानव रोग की सहज प्रकृति और इनवेसिव सर्जरी के लिए आवश्यकता के लिए स्तनधारियों6में मॉडल उत्पंन करने के लिए संक्षेप अक्षमता सहित, । इसके अतिरिक्त, कृंतकों के साथ व्यावहारिक समस्याओं मुद्रा को बरकरार ऊतक में आईसीएच के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं की तेजी से शुरुआत देख के संबंध है । कृंतक मॉडलों से अनुवाद की कमी को देखते हुए, सहज ICH के वैकल्पिक मॉडल का विकास जरूरी है अगर हम इन व्यावहारिक समस्याओं को दूर करने और मदद उपंयास दवा लक्ष्य की पहचान कर रहे हैं ।
संवहनी विकास के आणविक तंत्र अच्छी तरह से zebrafish सहित कशेरुकी के बीच संरक्षित कर रहे है (danio rerio)7। इस प्रकार, इस आदर्श जीव को अपनाना मस्तिष्कवाहिकीय रोग8के अध्ययन के लिए एक और अधिक उपयोगी यंत्रवादी कार्यनीति बन रहा है । Zebrafish मॉडल की एक संख्या उत्पंन किया गया है जो स्ट्रोक से संबंधित फीनोटाइप9,10,11,12से जुड़े संक्षेप । रोग रोगजनन की जांच करने के लिए zebrafish लार्वा का उपयोग स्तनधारी मॉडल8से अधिक व्यावहारिक और वैज्ञानिक लाभ प्रदान करता है । यह उच्च प्रजनन दर, तेजी से विकास और लार्वा पारदर्शिता कि इनवेसिव कृंतकों के साथ जुड़े बाधाओं के बिना intravital इमेजिंग के लिए अनुमति देता है शामिल हैं। युग्मन zebrafish अनुसंधान समुदाय के भीतर उपलब्ध ट्रांसजेनिक रिपोर्टर लाइनों की विस्तृत श्रृंखला के साथ ये लाभ रोग जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए vivo दृष्टिकोण में एक शक्तिशाली करने के लिए मात्रा, रोग का अध्ययन करने के लिए अभी तक उपयोग नहीं आईसीएच के परिणाम ।
मस्तिष्क में रक्त के लिए चोट प्रतिक्रिया13बिफेसिक है; प्राथमिक अपमान न्यूरोनल मौत और कोशिका परिगलन, जो तब नुकसान की एक माध्यमिक लहर है कि जंमजात प्रतिरक्षा सक्रियण द्वारा प्रेरित है शुरू होता है । मस्तिष्क की चोट का दूसरा चरण, विशेष रूप से neuroप्रदाहक घटक, भविष्य में दवा उपचार के लिए एक यथार्थवादी लक्ष्य माना जाता है13. Zebrafish लार्वा पहले14,15,16,17,18,19में वर्णित किया गया है सहज और मस्तिष्क विशिष्ट हेमोरेज । इस तरह के दो मॉडलों में अटोरवस्टैन (एटीवी) का उपयोग कर रहे है 24 एच पोस्ट निषेचन (hpf) को बाधित hmgcr मार्ग और कोलेस्ट्रॉल जैवसंश्लेषण14, और एक bubblehead (bbh) उत्परिवर्ती जो arhgef7 जीन में एक hypomorphic उत्परिवर्तन व्यक्त, βpix, और बाद में तंग अंतर्वाहिकी जंक्शनों18के लिए actin remodeling रोकता है । इन मॉडलों संचलन की शुरुआत में सहज मस्तिष्क विशिष्ट रक्त वाहिका टूटना प्रदर्शन (~ ३३ hpf) । हाल ही में, हम इन मॉडलों की विशेषता है और पता चलता है कि मस्तिष्क चोट प्रतिक्रिया के प्रमुख पहलुओं मनुष्यों और zebrafish लार्वा20के बीच संरक्षित है । इस अध्ययन को प्राप्त करने के लिए और zebrafish लार्वा में सहज मस्तिष्क हेमोरेज कल्पना और कैसे मस्तिष्क की चोट, और चलन और neuroinflammatory फीनोटाइप कि मानव की स्थिति से संबंधित मात्रा करने के लिए आवश्यक कार्यप्रणाली को दर्शाता है । ये डेटा और तकनीक पूर्व नैदानिक आईसीएच अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान पूरक प्रणाली के रूप में इस मॉडल प्रजातियों के उपयोग का समर्थन ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1159px;" width="1160">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">24 well plates</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">CLS3527</td>
			<td style="width:441px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">28 &#176;C incubator</td>
			<td style="width:227px;">LMS</td>
			<td align="right" style="width:165px;">210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Atorvastatin</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">PZ0001-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Breeding boxes</td>
			<td style="width:227px;">Thoren Aquatics systems</td>
			<td align="right" style="width:165px;">10011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Daniovision observation chamber</td>
			<td style="width:227px;">Noldus</td>
			<td style="width:165px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">E3 medium 1x</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:165px;"></td>
			<td>4% Instant Ocean, 500 &#181;L methylene blue in 1 L dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">EthoVision XT software</td>
			<td style="width:227px;">Noldus</td>
			<td style="width:165px;">version 11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heat block</td>
			<td style="width:227px;">Grant-Bio</td>
			<td>PHMT-PSC18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Instant ocean</td>
			<td style="width:227px;">Instant Ocean</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Lightsheet microscope</td>
			<td style="width:227px;">Zeiss</td>
			<td style="width:165px;">Z.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lightsheet microscope mounting capillary</td>
			<td style="width:227px;">Zeiss</td>
			<td>402100-9320-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Low melt agarose</td>
			<td style="width:227px;">Promega</td>
			<td style="width:165px;">V2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Methylene Blue</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">319112-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Microscope&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Leica</td>
			<td style="width:165px;">MZ95</td>
			<td>dissection microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Microscope</td>
			<td style="width:227px;">Leica</td>
			<td>M165FC</td>
			<td>fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;">MS222</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td></td>
			<td>4g tricaine powder, 500 mL of dH2O, 10 mL of 1 M Tris (pH 9). Adjust pH to ~7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P1000 pipette</td>
			<td style="width:227px;">Gilson</td>
			<td>F144059M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">P1000 pipette tips</td>
			<td style="width:227px;">Starlab</td>
			<td style="width:165px;">S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pasteur pipettes</td>
			<td style="width:227px;">Starlab</td>
			<td style="width:165px;">E1414-0300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dishes&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Corning</td>
			<td style="width:165px;">101VR20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipetboy</td>
			<td style="width:227px;">Integra Biosciences</td>
			<td style="width:165px;">PIPETBOY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Stripette 25ml</td>
			<td style="width:227px;">Corning</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Tricaine powder</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">A5040-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Base</td>
			<td style="width:227px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:165px;">BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra fine dissection forceps</td>
			<td style="width:227px;">Agar scientific</td>
			<td style="width:165px;">AGT502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Zen software</td>
			<td style="width:227px;">Zeiss</td>
			<td style="width:165px;">version 2.3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using zebrafish larvae to study the pathological consequences of hemorrhagic stroke

उच्च वैश्विक मृत्यु दर के साथ स्ट्रोक के सबसे गंभीर उपप्रकार होने के बावजूद, इंट्रा नकसीर (ICH) के साथ रोगियों के लिए कोई विशिष्ट उपचार है । मॉडलिंग ICH पूर्व चिकित्सकीय मुश्किल साबित किया है, और वर्तमान कृंतक मॉडल खराब मानव ICH के सहज प्रकृति संक्षेप । अत इस रोग तंत्र के अध्ययन के लिए और संभावित औषध खोज के लिए वैकल्पिक पूर्व नैदानिक पद्धतियों की तत्काल आवश्यकता है ।
Zebrafish का उपयोग ट्रांसलेशनल अनुसंधान के लिए एक तेजी से लोकप्रिय दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है, मुख्य रूप से लाभ की एक संख्या के कारण वे रोग के स्तनधारी मॉडल पर अधिकारी, विपुल प्रजनन दर और लार्वा पारदर्शिता सहित जीने के लिए अनुमति इमेजिंग. अंय समूहों की स्थापना की है कि zebrafish लार्वे आनुवंशिक या मस्तिष्कवाहिकीय विकास के रासायनिक विघटन के बाद सहज च प्रदर्शन कर सकते हैं । इस पद्धति का उद्देश्य प्री-क्लीनिकल आईसीएच अनुसंधान के संदर्भ में ब्रेन हेमरेज के रोग परिणामों का अध्ययन करने के लिए इस तरह के मॉडलों का उपयोग करना है । जी इमेजिंग और गतिशीलता का उपयोग करके assays हैं, मस्तिष्क क्षति, तंत्रिका सूजन और गतिकारक समारोह के बाद आईसीएच का आकलन किया जा सकता है और मात्रा ।
इस अध्ययन से पता चलता है कि मनुष्यों में ब्रेन हेमरेज के प्रमुख रोग परिणामों को zebrafish लार्वा में संरक्षित किया जाता है जो मॉडल जीव को हाइलाइट करता है, जो कि वीवो प्रणाली में एक मूल्यवान है । इस पद्धति का उद्देश्य प्री-क्लीनिकल स्ट्रोक समुदाय को कृंतकों के लिए एक वैकल्पिक पूरक मॉडल प्रणाली के रूप में जेब्राफिश लार्वा मॉडल को नियोजित करने में सक्षम बनाना है ।

मस्तिष्क कोशिका मृत्यु का मूल्यांकन ट्रांसजेनिक यूबीक्यू का उपयोग करना :secannexinv-mvenus सभी ich-लार्वा में अनुपस्थित रहे हैं कि दोनों एटीवी और bbh मॉडल में, आईसीएच + लार्वा में मर कोशिकाओं के स्पष्ट निश्चित समूहों में परिणाम (चित्रा 3). क्लस्टर ९६ hpf से पहले हो जाता है । छवि विश्लेषण के माध्यम से, रक्तस्राव मस्तिष्क में प्रतिदीप्ति संकेत की कुल तीव्रता में एक महत्वपूर्ण दो गुना वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है, जो चिह्नित कोशिका मृत्यु का संकेत है ।
एक neuroinflammatory प्रतिक्रिया आईसीएच में पहचाना + लार्वा मस्तिष्क में mpeg1 सकारात्मक महाविभोजी कोशिकाओं की काफी वृद्धि की संख्या से है । कुल mpo सकारात्मक न्युट्रोफिल कोशिकाओं की संख्या भी वृद्धि हुई लेकिन यह सांख्यिकीय महत्व तक पहुंच नहीं था (चित्रा 4) । Mpeg1 सकारात्मक मैक्रोफेज के आकारिकी भी एक सक्रिय, गोल, अमीबीय आकार को अपनाने के रूप में आईसीई + लार्वा में बदलने के लिए देखा जा सकता है । इन सक्रिय गोल कोशिकाओं को भी समय के साथ मॉनिटर किया जा सकता है कि यूबिक़ की बढ़ी हुई फैगोसाइटिक प्रतिक्रिया दिखाएं: secannexinv-शुक्र ,ICH + लार्वा में मर कोशिकाओं को व्यक्त (चित्रा 5) । (क) क्या यह सही है कि इस पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा है;
ब्रेन हेमरेज, दोनों bbh और एटीवी मॉडल में ICH-सहोदर नियंत्रण की तुलना में ७२ और ९६ एचपीएफ में गतिशीलता में एक महत्वपूर्ण कमी के साथ जुड़ा हुआ है (चित्रा 6) । गतिशीलता १२० एचपीएफ पर आधार रेखा के स्तर के पास करने के लिए ठीक हो । वहां अक्सर अंडे चंगुल और उपभेदों के बीच आधारभूत गतिशीलता में मतभेद है और इसलिए तुलना आईसीएच को बनाया जाना चाहिए हर बार नियंत्रित करता है ।
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig3.jpg"> चित्रा 3 : Intracerebral नकसीर (ICH) zebrafish लार्वा में एक quantifiable मस्तिष्क चोट में परिणाम । (क) आईसीएच-सहोदर (बाएं पैनलों) की तुलना में, ७२ एचपीएफ में मस्तिष्क की चोट के फेनोटाइप, ich + लार्वा (दाहिने पैनलों) की प्रतिनिधि छवियां । ब्राइटफील्ड छवियां (बॉटम पैनल्स, स्केल बार = २५० μm) आईसीएच + लार्वा में मस्तिष्क bleeds (तीर) की उपस्थिति का प्रदर्शन । प्रतिदीप्त माइक्रोस्कोपी में सेल मौत कल्पना करने के लिए किया गया था ubiq:secannexinv-mvenus रिपोर्टर लाइन (शीर्ष पैनलों, स्केल बार = १०० μm). मर कोशिकाओं के समूहों peri-रक्तगुगल क्षेत्रों में मनाया गया । छवियाँ केवल मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए फसली थे और पूरक फ़ाइल 1में मैक्रो का उपयोग कर व्यास (सफेद रेखा) में 30 पिक्सल से बड़ा दौर कणों में कुल हरी प्रतिदीप्ति तीव्रता के लिए विश्लेषण किया. (ख) अनुपचारित, आईसीएच और आईसीएच + के दिमाग में फ्लोरेसेंस सिगनल का परिमाणीकरण, एटीवी मॉडल (एन = 12 प्रति समूह; 3 स्वतंत्र प्रतिकृति) के माध्यम से ७२ एचपीएफ पर प्राप्त होता है । काफी अंतर पाया गया जब आईसीएच की तुलना इलाज के साथ (* * p = ०.००४) और आईसीएच के साथ-(* p = ०.०३) भाई बहन । (ग) ७२ एचपीएफ पर bubblehead (बीबीएच) मॉडल (एन = 12 प्रति समूह; 2 स्वतंत्र प्रतिकृति) के माध्यम से प्राप्त किए गए आईआईसीईसीवी के दिमाग में बाध्यकारी के रूप में प्रतिदीप्ति सिगनल का परिमाणन । रेखांकन मतलब से एसडी दिखाओ । MVenus प्रतिदीप्ति में एक महत्वपूर्ण अंतर आईसीएच के बीच मनाया गया + और ICH-आयु-मिलान भाई बहन (* * p = ०.००२) । चित्रा Crilly एट अल20 से एक क्रिएटिव कॉमंस लाइसेंस के तहत अनुमति के साथ reproduced किया गया है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig3large.jpg" target="_blank">इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig4.jpg"> चित्रा 4 : Intracerebral नकसीर (आईसीएच) zebrafish लार्वा मस्तिष्क में एक सहज सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया शुरू होता है । पहले mpo के लिए वर्णित मस्तिष्क क्षेत्रों के भीतर मात्रा निर्धारित ल्यूकोसाइट्स की संख्या: gfp; mpeg1: dsred डबल ट्रांसजेनिक लार्वा (n = 8 प्रति समूह; 2 स्वतंत्र replicates) पर ७२ एचपीएफ मैक्रोफेज में एक महत्वपूर्ण वृद्धि का पता चलता है (* p = ०.०१), लेकिन नहीं न्यूट्रोफिल (p = ०.५), आईसीएच के जवाब में । चित्रा Crilly एट अल20 से एक क्रिएटिव कॉमंस लाइसेंस के तहत अनुमति के साथ reproduced किया गया है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig4large.jpg" target="_blank">इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।</a> 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig5.jpg"> चित्रा 5 : सक्रियित मैक्रोफेज कोशिकाएं मस्तिष्क के घावों के लिए एक फैगोसाइटिक प्रतिक्रिया दिखाती हैं । (क) प्रतिनिधिक समय-चूक पोस्टरों20 में एक शारिष्ट पैट्रोलिंग मैक्रोफेज को दर्शाया गया है जो एनेसिफाइड पॉजिटिव सेल (आई-6) की ओर पलायन कर रहा है । Stills एक 20x उद्देश्य का उपयोग कर पूरे मस्तिष्क की लिया छवियों की एक श्रृंखला से प्राप्त कर रहे हैं । स्केल बार ५० μm का प्रतिनिधित्व करता है । बृहत्विभोजी ने एनेन्सवी-पॉजिटिव सेल (vi, vii) को फैगोसाइटोज करने से पहले एक अमीबाइड आकारिकी (v) का अधिग्रहण किया । फागोसाइटोसिस के बाद मैक्रोफेज एक शारिकृत आकारिकी को फिर से शुरू करता है और दूर ले जाता है और annexinV-positive सेल अब नहीं देखा जा सकता है (viii) । शाखाकृत मैक्रोफेज (#), एनेइनव पॉजिटिव सेल (तीर), अमीबाभ मैक्रोफेज (*) संकेत दिए गए हैं । (ख) इच- और च + लार्वा मस्तिष्क में ए. एच. आई-पॉजिटिव कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवियां जो अमीबोइड और शाखित मॉर्पोलोजी का प्रदर्शन कर रही हैं । स्केल पट्टियां ५० μm का प्रतिनिधित्व करती हैं । (ग) इच-सहोदर की तुलना में अमीबोइड (फैगोसाइटिक) का एक बढ़ा हुआ अनुपात और शाखित (निष्क्रिय) मैक्रोफेज का अनुपात कम पाया गया । चित्रा Crilly एट अल20 से एक क्रिएटिव कॉमंस लाइसेंस के तहत अनुमति के साथ reproduced किया गया है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig5large.jpg" target="_blank">इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।</a> 
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig6.jpg"> चित्रा 6 : आईसीएच प्रेरित मस्तिष्क चोट zebrafish लार्वा में एक quantifiable चलन में कमी का परिणाम है । (क) आईसीएच-और आईसीए + बी के लार्वा में तैराकी पटरियों के ७२, ९६ और १२० एचपीएफ के प्रतिनिधि उदाहरण । (ख) आईसीएच + लार्वा ने 10 मिनट की रिकॉर्डिंग अवधि के दौरान ७२ और ९६ दोनों एचपीएफ पर संचित समय में काफी कमी दर्शाई है । महत्व १२० एचपीएफ समय बिंदु पर खो गया था संभावित मस्तिष्क चोट से वसूली के लिए alluding (n = 24 लार्वा प्रति समूह; 3 स्वतंत्र प्रतिकृति; * * * * p = ०.००००६; * * p = ०.००३; ns: p = ०.०८) । (ग) अशोधित और एटीवी-उपचारित आईसीएच और आईसीएच + १२० एचपीएफ पर लार्वा में चलने वाले संचयी समय का परिमाणीकरण । ICH + लार्वा 10 मिनट रिकॉर्डिंग अवधि के दौरान खर्च मोबाइल संचई समय में एक महत्वपूर्ण कमी प्रदर्शित । तीन तकनीकी प्रतिकृति (n = 24 लार्वा प्रति समूह) मतलब से एसडी की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया (* * * p = ०.००००४, * * p = ०.०००३) । चित्रा Crilly एट अल20 से एक क्रिएटिव कॉमंस लाइसेंस के तहत अनुमति के साथ reproduced किया गया है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig6large.jpg" target="_blank">इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।</a> 
अनुपूरक फाइल 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/Supplementary_File_1-Macro.docx" target="_blank">कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>

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Using Zebrafish Larvae to Study the Pathological Consequences of Hemorrhagic Stroke

यहां हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करने के लिए मस्तिष्क चोट, गतिकीय घाटे और neuroinflammation के बाद zebrafish लार्वा में मस्तिष्क में खून बह रहा है, मानव इंट्रा नकसीर के संदर्भ में (ICH) ।

रक्तस्रावी स्ट्रोक के रोग परिणामों का अध्ययन करने के लिए Zebrafish लार्वा का उपयोग

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage ...

यह विधि रक्तस्रावी स्ट्रोक के बाद मस्तिष्क में रक्त के लिए तत्काल सेलुलर प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक मानार्थ पूर्व-नैदानिक दृष्टिकोण प्रदान करती है, एक बहुत ही गंभीर स्थिति जिसके लिए हमारे पास रोगियों के लिए कोई विशिष्ट दवाएं उपलब्ध नहीं हैं। कृंतक मॉडल के विपरीत, जेब्राफिश लार्वा की पारदर्शिता हमें फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके वास्तविक समय में जीवित बरकरार जानवरों के दिमाग के भीतर सेलुलर प्रतिक्रियाओं का निरीक्षण करने की अनुमति देती है। शुरू करने के लिए, एक चाय छलनी का उपयोग करने के लिए एक पुरुष और एक से दो महिला वयस्क जेब्राफिश से उत्पादित प्रजनन बक्से में प्राकृतिक अंडे से सभी निषेचित भ्रूण इकट्ठा ।मानक E3 भ्रूण माध्यम युक्त प्रत्येक पेट्री डिश के लिए १०० भ्रूण हस्तांतरण । मानक दिशा-निर्देशों के अनुसार 28 डिग्री सेल्सियस और मंच पर इनक्यूबेट । निषेचन के बाद छह घंटे में, एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर पकवान से मृत और निषेचित भ्रूण को हटा दें और व्यंजनों को वापस इनक्यूबेटर में डाल दें।निषेचन के बाद 24 घंटे में, एक उज्ज्वल क्षेत्र स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत, Atorvastatin उपचार के लिए भ्रूण सजावट के लिए तेज अल्ट्रा पतली विच्छेदन संदंश का उपयोग करें । फिर दो साफ पेट्री व्यंजन, उपचार के लिए एक और नियंत्रण के लिए दूसरे के लिए E3 भ्रूण माध्यम के 30 मिलीलीटर जोड़ें । उपचार डिश से भ्रूण के पानी के 60 माइक्रोलीटर निकालें और 80% लार्वा रक्तस्राव प्राप्त करने के लिए 0.5 मिलीमोलर एटोरवास्टिन के 60 माइक्रोलीटर जोड़ें।एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करना, प्रत्येक पकवान के लिए संभव के रूप में कम पानी में १०० भ्रूण हस्तांतरण । दोनों व्यंजनों को 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें । निषेचन के बाद 50 घंटे के बाद किसी भी समय, माइक्रोस्कोप के तहत गैर-रक्तस्रावी आबादी से रक्तस्रावी मछली को सावधानीपूर्वक अलग करने के लिए एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करें और लार्वा को ताजा E3 मीडिया वाले नए व्यंजनों में स्थानांतरित करें।नकसीर सकारात्मक लार्वा को अलग करना आसान बनाने के लिए, आप वर्णक या मछली के बिना मछली का उपयोग कर सकते हैं जो लाल रक्त कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करते हैं। तीसरे दिन, फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप स्क्रीन के तहत फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए लार्वा स्क्रीन करें। फिर एनेस्थेटाइजेशन के लिए 0.2% एमएस-222 वाले ई 3 मीडिया के साथ लाइट शीट माउंटिंग चैंबर भरें।एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, बढ़ते के लिए एक सूखी पेट्री डिश सतह पर एक से छह लार्वा युक्त एक बूंद स्थानांतरित करें। जितना संभव हो उतना तरल निकालने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें। लार्वा के लिए 45 डिग्री सेल्सियस हीट ब्लॉक से 1.5% कम पिघल agarose की एक बूंद जोड़ें और लार्वा को पहले सिर को आकर्षित करने के लिए एक 800 माइक्रोमीटर बढ़ते केशिका का उपयोग करें।यदि स्थिति सही नहीं है, तो लार्वा को एगर उठे से निष्कासित करें और फिर से माउंट करें। शांत करने के लिए केशिका छोड़ दें और फिर प्रकाश शीट कक्ष में डालें। ज़ेन इमेजिंग सॉफ्टवेयर पर, लार्वा को उन्मुख करने के लिए निरंतर दबाएं और आंखों के लेंस के बीच सिर की जेड-स्टैक छवियों को प्राप्त करने के लिए प्रेस प्राप्त करें।प्रोसेसिंग टैब में, प्रत्येक जेड-स्टैक से अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण छवि उत्पन्न करें। गतिशीलता परख के लिए बेतरतीब ढंग से चयन करने के लिए, संज्ञाहरण के बाद 24 लार्वा को ताजा E3 मीडिया में स्थानांतरित करें और जानवरों को संज्ञाहरण से उबरने की अनुमति दें। लार्वा के बाद संज्ञाहरण से पूरी तरह से बरामद किया गया है, अंत कट हस्तांतरण के साथ एक पिपेट का उपयोग करके मेथिलीन नीले रंग के बिना ई 3 माध्यम में लार्वा बरामद किया गया।प्लेट एक 24 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से एक मिलीलीटर में एक लार्वा । प्लेट को कैमरा चैंबर में लोड करें। EthoVision XT ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर में, प्रयोग सेटिंग्स को समायोजित करने के लिए एक सफेद प्रकाश चौंक दिनचर्या स्थापित करने के लिए 10 मिनट के लिए सहज तैराकी और परख गति बढ़ाने के लिए ।लोकोमोशन परख को 96 और 120 घंटे बाद फर्टिलाइजर पर दोहराएं। ट्रांसजेनिक सर्वव्यापकता स्रावित एनेक्सटिन वी एम वेनस रिपोर्टर लाइन का उपयोग करके मस्तिष्क कोशिका मृत्यु का आकलन करने से रक्तस्राव लार्वा में मरने वाली कोशिकाओं के स्पष्ट निश्चित समूहों में परिणाम होता है जो हरे फ्लोरोसेंस ब्राइट-फील्ड छवियों द्वारा इंगित सभी गैर-रक्तस्राव लार्वा में अनुपस्थित हैं। रक्तस्राव लार्वा के लिए एटोरवास्टिन और बबल हेड मॉडल दोनों में मरने वाली कोशिकाओं को देखा गया।एमपीईजी1 सकारात्मक मैक्रोफेज की आकृतियां इंट्रासर्जल हेमरेज सकारात्मक लार्वा में बदलती हैं क्योंकि कोशिकाएं सक्रिय गोल अमॉएबल आकार में अपनाती हैं। इन सक्रिय गोल कोशिकाओं को समय के साथ निगरानी की गई ताकि सर्वव्यापी स्कैमेंटिन स्कैमेंटलिन की बढ़ी हुई फैगोसाइटिक प्रतिक्रिया दिखाई जा सके जो इंट्रासैरेब्रल हेमरेज सकारात्मक लार्वा में मरने वाली कोशिकाओं को व्यक्त करते हैं। मस्तिष्क नकसीर इंट्रासैरेब्रल हेमरेज नकारात्मक सहोदर नियंत्रण की तुलना में 72 और 96 घंटे बाद निषेचन में गतिशीलता में एक महत्वपूर्ण कमी के साथ जुड़ा हुआ है।निषेचन के बाद 120 घंटे में गतिशीलता बेसलाइन स्तर के पास ठीक हो जाता है। इस प्रक्रिया का सबसे महत्वपूर्ण पहलू फेनोटाइपिंग परखों पर आगे बढ़ने से पहले मस्तिष्क रक्तस्राव की उपस्थिति या अनुपस्थिति के लिए लार्वा की अच्छी तरह से जांच करना सुनिश्चित करना है। इस मॉडल का उपयोग दवा स्क्रीनिंग के लिए भी किया जा सकता है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि क्या एक खून के बाद फेनोटाइप गंभीरता में सुधार किया जा सकता है, एक ऐसा दृष्टिकोण जो हमें भविष्य में नई दवा उम्मीदवारों की पहचान करने के लिए नेतृत्व कर सकता है ।इस तकनीक हमें एक समय बिंदु है जो इतना बेहद अब से पहले अध्ययन करने के लिए मुश्किल हो गया है के दौरान मस्तिष्क में एक खून के बाद तुरंत सेलुलर प्रतिक्रियाओं का पता लगाने के लिए अनुमति देता है । यद्यपि इस प्रोटोकॉल के भीतर वर्णित कोई भी अभिकर्मक या उपकरण विशेष रूप से खतरनाक नहीं हैं, लेकिन रसायनों, शार्प्स या लेजर का उपयोग करते समय पूरी तरह से मानक देखभाल और सावधानियां बरती जानी चाहिए।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

में Proprioceptors का विज़ुअलाइज़ेशन<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; लार्वा और pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

में सहज और Circadian नियमित Photobehavior अध्ययन करने के लिए लाइट पसंद परख<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; लार्वा

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

Zebrafish लार्वा में स्वचालित उच्च throughput व्यवहार विश्लेषण

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

Astrocytic ट्रांसपोर्टर धाराओं के एक Deconvolution विश्लेषण के साथ ग्लूटामेट क्लीयरेंस का टाइम कोर्स पाने

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

Zebrafish लार्वा में दृश्य प्रतिक्रिया के Electroretinogram विश्लेषण

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

Utilizing 3D Printing Technology to Merge MRI with Histology: A Protocol for Brain Sectioning

उपयोग 3 डी प्रिंटिंग तकनीक ऊतक विज्ञान के साथ एमआरआई मर्ज करने के लिए: मस्तिष्क के लिए एक प्रोटोकॉल सेक्शनिंग

Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

माइक्रो-इलेक्ट्रोड एरेज़ पर न्यूरोनल सेल संस्कृतियों की उत्तेजना के लिए नेटवर्क रिस्पांस में समय पर निर्भर वृद्धि

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

Zebrafish लार्वा में कैल्शियम इमेजिंग और व्यवहार रिकॉर्डिंग का उपयोग करके एक दो-फोटॉन लेज़र और उसके मूल्यांकन का उपयोग करके एक न्यूरॉन जनसंख्या का पृथक

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

जाग ज़ेब्राफिश लार्वा और खोपड़ी और त्वचा हटाने द्वारा किशोरों में पूरी तरह से सक्रिय मस्तिष्क ऊतक के वीवो इमेजिंग में

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...