Name: using zebrafish larvae to study the pathological consequences of hemorrhagic stroke
Uploaded: 2019-06-05T15:00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Zebrafish Larvae to Study the Pathological Consequences of Hemorrhagic Stroke at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Dr David spiller og University of Manchester Systems mikroskopi Core Facility for bruk av utstyret, Prof Richard Baines for bruk av DanioVision og Dr. Jack elver-auty for statistisk konsultasjon. Den BBH linjen ble vennlig deles av Nicole Munsie fra Dr. Sarah Child ' s Lab ved University of Calgary. Vi takker også Prof Stephen Renshaw, Dr. Adam Hurlstone, Dr. Andrew Badrock og Dr. Helen Young for fisk linjer og utstyr.
Denne studien ble støttet av NC3Rs (NC/N002598/1), Stroke Association (TSA UTOMATISK 2017/02), ERA-NET NEVRON (MR/M501803/1) og British Heart Foundation (FS/15/67/32038). Vi er også spesielt takknemlige for The Natalie Kate Moss Trust og University of Manchester fakultet for biologi, medisin og helse for deres fortsatte økonomisk støtte.

Sebrafisk ble reist og vedlikeholdt ved University of Manchester Biological Services Unit under standard forhold som tidligere beskrevet21. Voksen sebrafisk husdyrhold ble godkjent av University of Manchester Animal Welfare og etisk gjennomgang Board. Alle eksperimenter ble utført i samsvar med Storbritannias hjemmekontor forskrifter (PPL: P132EB6D7).
Merk: transgene linjer som brukes i denne studien inkluderer macrophage-spesifikk avstamning MPEG1:mCherry (konstruert i huset som tidligere beskrevet22), nøytrofile-spesifikke MPO:GFP23,erytroide-spesifikke gata1: dsRed24 og Ubiq:secAnnexinV-mVenus, en reporter for celle død (re-avledet i huset25)på Wild-type, Nacre (mitfaW2/W2) og mutant (BBHm292) bakgrunner. Figur 1 viser den eksperimentelle tidslinjen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> Figur 1 : Grafisk av eksperimentell tidslinje for å karakterisere hjerneskade, Locomotor og neuroinflammatory utfall. ICH, intracerebrale blødning; BBH, rotehode. Figuren er gjengitt fra Crilly et al.20 med tillatelse under en Creative Commons-lisens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> 
1. dag 0: produksjon og Oppsamling av egg
<ol><li>Samle befruktet embryo fra naturlig gyting i avl bokser produsert fra 1 mannlig og 1-2 kvinnelig voksen sebrafisk. Merk: for Atorvastatin protokoll kan alle wildtype/transgene-dyr brukes, men blødning ratene avviker litt mellom stammene.</li>
	<li>Ruge 100 embryo ved 28 ° c i standard E3 embryo medium per Petri parabol og scene i henhold til standard retningslinjer26.</li>
	<li>På ~ 6 timer post befruktning (hpf) fjerne døde og ubefruktede embryo fra fatet ved hjelp av en Pasteur pipette.</li>
</ol>2. dag 1: Atorvastatin behandling ved 24 hpf
<ol><li>Dechorionate embryo for Atorvastatin behandling ved hjelp av skarpe ultra tynne disseksjon tang27. Tall som kreves for eksperimentering kan justeres tilsvarende.</li>
	<li>Legg til 30 mL av E3 embryo medium til to rene Petri retter. Bruk en tallerken for 100 embryo. Merk: Hvis platene er laget for cellekultur, dechorionated sebrafisk på dette tidlige stadiet ofte holde seg til bunnen. For å unngå dette, skyll platene grundig i rent vann før bruk.</li>
	<li>Fjern 60 μL av embryo vann fra behandlings platen og tilsett 60 μL av 0,5 mM Atorvastatin (ATV). Ved en 0,5 mM lager konsentrasjon, vil den ovennevnte fortynning resultere i en endelig konsentrasjon av 1 μM som vil resultere i ~ 20% av Larvene ikke-hemorrhaged (ICH-) og ~ 80% av Larvene hemorrhaged (ICH +). Bruk den andre platen for ubehandlede kontroller Merk: Atorvastatin er solubilized i destillert vann (3 mg til 10 mL) for å lage en 0,5 mM lagerløsning. Ruge overnatter ved romtemperatur i mørket med agitasjon som oppløseliggjøringen tar litt tid. Komplett oppløseliggjøringen kan ta opp til 1 uke. Ikke bruk DMSO. Løsningen er aliquoted og oppbevares ved-20 ° c. Ikke Frys tine.</li>
	<li>Ved hjelp av en pipette, overføre 100 embryo i så lite vann som mulig til behandling platene.</li>
	<li>Ruge platene ved 28 ° c. NOTE: ICH ville finnes imellom 33 og 48 hpf. Atorvastatin trenger ikke å bli fjernet som inkubasjons lenger enn 24 h ikke medfører noen ytterligere utviklingsmessige problemer.</li>
</ol>3. dag 2: skille ICH-og ICH + befolkninger på 50 hpf
<ol><li>Separat ICH + fisken fra ICH-befolkninger og forflytning å ny retter for lette.<ol>
<li>Hvis du bruker ATV-modellen ved en konsentrasjon på 1 μM, vil 75-100% av Larvene vise blødning (ICH +) på dette tidspunktet. Merk: responsen fra Larvene er forskjellig mellom stammene, hvis Larvene ikke hemorrhaging ved de ønskede frekvensene, bruk en fersk gruppe med Atorvastatin eller en høyere konsentrasjon. Hvis Larvene ikke har utstilt blødning av 48 hpf deretter vurdere dem ICH-.</li>
		<li>Hvis du bruker BBH modellen, vil alle homozygote mutanter viser blødning ved 48 hpf. Hvis benytter en heterozygot incross, det ICH-heterozygot og wildtype søsken kan brukes idet administrere dyrene for eksperimenter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Om nødvendig, dop Larvene ved å legge 0,02% MS222 til E3 Media. Bruke en Pasteur pipette, sortere Larvene for tilstedeværelse av blod i hodet til friske E3 Media. Se figur 2. Merk: blod i hodet kan vises i forgrunnen, midten eller hindbrain eller i kombinasjon, og utfalls volumet kan variere mellom dyr. I BBH mutanter, er ICH ofte assosiert med alvorlig ødem gjenkjennelig med større hoder, bredere plass mellom øynene og en mer diffus blø. Men ikke alle ICH + BBH larver viser ødem.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig2.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> Figur 2 : ICH + hjerneblødning fenotyper. Eksempler på larvestadiet ICH fenotyper opprettholdt på en transgene gata1: DsRed reporter Nacre bakgrunn observert med en brightfield stereomikroskopet (Top paneler) og fluorescens (nederste panel) på ~ 48 h post-befruktning. Ingen blødninger ble observert i ICH-larver (venstre panel). En distinkt opphopning av røde blodlegemer i forebrain og hindbrain (piler) ble observert i ICH + larver (høyre panel). Vektstenger representerer 250 μm. figuren er gjengitt fra Crilly et al.20 med tillatelse under en Creative Commons-lisens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> 
4. dag 3: Cell død og leukocytter analyse på 72 hpf
<ol><li>Skjermen Larvene bruker et fluorescens mikroskop for å sikre uttrykk for fluorescerende protein. Merk: i denne studien ble transgene Ubiq: SecAnnexinV-mVenus larver brukt til å rapportere hjernecelledød og doble transgene MPO: GFP; MPEG1: mCherry eller Ubiq: secAnnexinV-mVenus; MPEG1: mCherry brukes til leukocytter analyse.</li>
	<li>Fyll lightsheet monterings kammer med E3 medier som inneholder 0,02% MS222.</li>
	<li>Dop Larvene bruker 0,02% MS222. Overføring larver for montering (n = 1-6) til en tørr Petri parabol overflaten i en enkelt dråpe. Fjern så mye væske som mulig. Merk: 1,5% lav smelte agarose er utarbeidet ved hjelp av 0,15 g lav smelte agarose oppløst i 10 mL E3 medium uten metylen blå i en mikrobølgeovn og oppbevares ved 45 ° c til bruk.</li>
	<li>Tilsett en dråpe 1,5% lav-smelte agarose (vedlikeholdt som væske i en 45 ° c varme blokk) til larvene og ved hjelp av en 800 μm monterings kapillær, og trekke Larvene opp hodet først. Hvis posisjonering ikke er nøyaktig, kan Larvene bli utvist fra agarose og monteres igjen. La kapillær avkjøles før du setter inn i lightsheet kammeret. Merk: Alternativt kan et konfokalmikroskopi mikroskop brukes til denne prosedyren. For dette bør Larvene monteres sidelengs i agarose på et glassbunn rett.</li>
	<li>Tilegne seg z-stack bilder av hodet mellom øyet linser (~ 300 μm) og prosess til maksimal intensitet projeksjon bilde.<ol>
<li>Analyser hjernens region fra bilder samlet inn for totalt antall fluorescerende celler og total intensitet fluorescens20.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lag en tidsforløp video av flere projeksjon kompositter over 18-24 h for å spore leukocytter mobilitet og interaksjon med døende celler. Merk: Hvis det utføres lang tids bildebehandling, monteres bare én Larven i kapillær.</li>
	<li>Når bildebehandling er ferdig utvise Larvene fra montering kapillær i en dødelig overdose av 4% MS222 til euthanize.</li>
</ol>5. dag 3: velge larver for motilitet analysen på 72 hpf
<ol><li>Dop larver i Petri retter med 0,02% MS222.</li>
	<li>Tilfeldig velger n = 24 larver for motilitet analysen og overføre til nye E3 Media og la dyrene til å gjenopprette fra bedøvelse. Merk: bedøvelse på dette punktet fjerner utvalg bias for langsom svømmere som er lett å fange.</li>
</ol>6. dag 3-5: assaying bevegelse ved 72, 96 og 120 hpf
<ol><li>Overføring larver valgt ved 72 hpf inn E3 medium uten metylen blå. Merk: for assaying på 3 DPF tillate Larvene god tid til å komme seg fra bedøvelse (> 1 h).</li>
	<li>Tallerken en Larven i 1 mL per brønn av en 24-brønn plate med en pipette. Merk: klipp enden av pipette spissen for å unngå å skade larvene. Plate størrelse kan endres i henhold til eksperimentell design.</li>
	<li>Legg platene inn i kamera kammeret og analysen bevegelse i 10 min ved hjelp av en hvit lys skremme rutine for å øke spontan svømming. Merk: svømming oppførsel ble sporet ved hjelp av et kamera kammer og sporing av programvare (se tabell over materialer).</li>
	<li>Gjenta eksperiment med samme larver på 96 og 120 hpf. Flytt larver fra individuelle boliger i analysen plate til en Petri parabol og ruge ved 28 ° c mellom analysene.</li>
	<li>Ved analysen ferdigstillelse, euthanize larver i en dødelig overdose av 4% MS222.</li>
</ol>

<ol>
	<li>An, S. J., Kim, T. J., Epidemiology Yoon, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology,+risk+factors,+and+clinical+features+of+intracerebral+hemorrhage:+an+update.">Epidemiology, risk factors, and clinical features of intracerebral hemorrhage: an update.</a> Journal of stroke. 19 (1), 3 (2017).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The top 10 causes of death. , (2017).</li><li>Casals, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+animal+models+for+stroke+research:+a+review.">The use of animal models for stroke research: a review.</a> Comparative medicine. 61 (4), 305-313 (2011).</li><li>Kellner, C. P., Connolly, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+Strategies+for+Intracerebral+Hemorrhage+Trials+and+Translation.">Neuroprotective Strategies for Intracerebral Hemorrhage Trials and Translation.</a> Stroke. 41 (10 Suppl 1), S99-S102 (2010).</li><li>Kirkman, M. A., Allan, S. M., Parry-Jones, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+intracerebral+hemorrhage:+avoiding+pitfalls+in+translational+research.">Experimental intracerebral hemorrhage: avoiding pitfalls in translational research.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (11), 2135-2151 (2011).</li><li>ASPA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 1986 amendments. , (2012).</li><li>Butler, M. G., Gore, A. V., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in cell biology. 105, 137-161 (2011).</li><li>Walcott, B. P., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+of+cerebrovascular+disease.">Zebrafish models of cerebrovascular disease.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 34 (4), 571-577 (2014).</li><li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+mediate+the+repair+of+brain+vascular+rupture+through+direct+physical+adhesion+and+mechanical+traction.">Macrophages mediate the repair of brain vascular rupture through direct physical adhesion and mechanical traction.</a> Immunity. 44 (5), 1162-1176 (2016).</li><li>Kasher, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+samhd1+morphant+zebrafish+recapitulates+features+of+the+human+type+I+interferonopathy+Aicardi-Goutieres+syndrome.">Characterization of samhd1 morphant zebrafish recapitulates features of the human type I interferonopathy Aicardi-Goutieres syndrome.</a> The Journal of Immunology. 194 (6), 2819-2825 (2015).</li><li>Wen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+rnf213a+by+TALEN+causes+abnormal+angiogenesis+and+circulation+defects+in+zebrafish.">Mutation of rnf213a by TALEN causes abnormal angiogenesis and circulation defects in zebrafish.</a> Brain research. 1644, 70-78 (2016).</li><li>Eisa-Beygi, S., Rezaei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etiology+of+intracerebral+hemorrhage+(ICH):+novel+insights+from+Zebrafish+embryos.">Etiology of intracerebral hemorrhage (ICH): novel insights from Zebrafish embryos.</a> International Journal of Developmental Biology. 60 (4-5-6), 119-126 (2016).</li><li>Mracsko, E., Veltkamp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation+after+intracerebral+hemorrhage.">Neuroinflammation after intracerebral hemorrhage.</a> Frontiers in cellular neuroscience. 8, 388 (2014).</li><li>Eisa-Beygi, S., Hatch, G., Noble, S., Ekker, M., Moon, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA+reductase+(HMGCR)+pathway+regulates+developmental+cerebral-vascular+stability+via+prenylation-dependent+signalling+pathway.">The 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (HMGCR) pathway regulates developmental cerebral-vascular stability via prenylation-dependent signalling pathway.</a> Developmental biology. 373 (2), 258-266 (2013).</li><li>Shen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+Rho-kinase+inhibitors+by+docking-based+virtual+screening.">Discovery of Rho-kinase inhibitors by docking-based virtual screening.</a> Molecular BioSystems. 9 (6), 1511-1521 (2013).</li><li>Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tanshinone+I+prevents+atorvastatin-induced+cerebral+hemorrhage+in+zebrafish+and+stabilizes+endothelial+cell-cell+adhesion+by+inhibiting+VE-cadherin+internalization+and+actin-myosin+contractility.">Tanshinone I prevents atorvastatin-induced cerebral hemorrhage in zebrafish and stabilizes endothelial cell-cell adhesion by inhibiting VE-cadherin internalization and actin-myosin contractility.</a> Pharmacological research. , (2017).</li><li>Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+ROCK+inhibitor,+FPND,+which+prevents+cerebral+hemorrhage+through+maintaining+vascular+integrity+by+interference+with+VE-cadherin.">Discovery of a ROCK inhibitor, FPND, which prevents cerebral hemorrhage through maintaining vascular integrity by interference with VE-cadherin.</a> Cell death discovery. 3, 17051 (2017).</li><li>Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&#946;Pix-Pak2a+signaling+pathway+regulates+cerebral+vascular+stability+in+zebrafish.">A &#946;Pix-Pak2a signaling pathway regulates cerebral vascular stability in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (35), 13990-13995 (2007).</li><li>ten Klooster, P. J., Jaffer, Z. M., Chernoff, J., Hordijk, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+and+activation+of+Rac1+are+mediated+by+the+exchange+factor+&#946;-Pix.">Targeting and activation of Rac1 are mediated by the exchange factor &#946;-Pix.</a> The Journal of cell biology. 172 (5), 759-769 (2006).</li><li>Crilly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+zebrafish+larval+models+to+study+brain+injury,+locomotor+and+neuroinflammatory+outcomes+following+intracerebral+haemorrhage.">Using zebrafish larval models to study brain injury, locomotor and neuroinflammatory outcomes following intracerebral haemorrhage.</a> F1000Research. 7, (2018).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish. , (2000).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).</li><li>Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li><li>Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants.">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nature immunology. 4 (12), 1238 (2003).</li><li>Morsch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+microglial+engulfment+of+dying+neurons+in+the+zebrafish+spinal+cord.">In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord.</a> Frontiers in cellular neuroscience. 9, (2015).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Liang, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish in the Classroom. , (2011).</li><li>Yang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miconazole+protects+blood+vessels+from+MMP9-dependent+rupture+and+hemorrhage.">Miconazole protects blood vessels from MMP9-dependent rupture and hemorrhage.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 10 (3), 337-348 (2017).</li><li>Andaluz, N., Zuccarello, M., Wagner, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+animal+models+of+intracerebral+hemorrhage.">Experimental animal models of intracerebral hemorrhage.</a> Neurosurgery Clinics of North America. 13 (3), 385-393 (2002).</li><li>Rosenberg, G. A., Mun-Bryce, S., Wesley, M., Kornfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagenase-induced+intracerebral+hemorrhage+in+rats.">Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats.</a> Stroke. 21 (5), 801-807 (1990).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Denne studien viser at ICH i sebrafisk larver induserer en hjerneskade respons som viser viktige aspekter av den menneskelige tilstand som kan være systematisk analyseres og kvantifisert. Sebrafisk tilbyr en konsekvent og reproduserbar modell av spontane ICH som vil bistå med fremtidige narkotika intervensjon studier fokusert på målretting blod-indusert hjerneskade, snarere enn å hindre fartøy brudd17,28. Faktisk, gitt den raske karakteren av sykdomsutbruddet beslektet med den kliniske situasjonen, gir en slik tilnærming spennende utsikter for vellykket oversettelse i fremtiden.
Noen begrensninger er forbundet med bruk av sebrafisk larver, slik som bruk av et utviklingssystem og taksonomisk rang, men den praktiske og vitenskapelige fordeler av denne modellen må vurderes å tilby ny innsikt i ICH. Ingen operasjon er nødvendig for å starte en blødning eller å overvåke cellulære prosesser over lengre perioder etter skade. Høy fekunditet av sebrafisk motstandere generere lett tilgjengelig og store utvalgsstørrelser, og på grunn av rask utvikling av Larvene den eksperimentelle tidslinjen er betydelig redusert i forhold til gnager studier29,30.
Aktuelle disse modeller er anfall å benytte til Elucidating det omgående patologisk og immunologiske svaret å spontan ICH inne hjernen av bo Behold dyrene. Potensielt kan denne modellen tilpasses for middels høy gjennomstrømming narkotika skjermer for ICH terapier, enten forebyggende eller utvinning fremme. Som sådan, det stolpe-ICH patologi forevist i denne studere forestiller en alternativ, komplementær plattform for pre-klinisk ICH forskning.

Intracerebrale blødning (ICH) er den mest alvorlige sub-type slag forbundet med spontane cerebral fartøy brudd og blødning i parenchyma fører til hjerneskade, fysisk funksjonshemming og ofte død1. Til tross for høy dødelighet og sykelighet rate forbundet med ICH2, forståelse av underbygger etiologi og post-blødning patologi mangler fortsatt. Som sådan, der er nei spesifikk handling å forhindre ICH eller gjøre bedre pasientresultater. De fleste av vår forståelse av sykdom biologi har kommet fra pre-klinisk gnager modeller av ICH3, men studier å-date i disse modellene har unnlatt å oversette noen vellykket terapeutisk til klinikken4,5. Denne feilen kan skyldes delvis, til noen begrensninger av disse prekliniske modeller, inkludert manglende evne til å enkelt recapitulate den spontane natur menneskelig sykdom og kravet om invasiv kirurgi for å generere modeller i pattedyr6. I tillegg gnagere utgjøre praktiske problemer med hensyn til å observere den raske utbruddet av cellulære svar på ICH i intakt vev. Gitt mangelen på oversettelse fra gnager modeller, utvikle alternative modeller av spontane ICH er viktig hvis vi skal overvinne disse praktiske problemer og bidra til å identifisere romanen narkotika mål.
Den molekylære mekanismer av vaskulær utvikling er godt bevart blant virveldyr inkludert sebrafisk (Danio rerio)7. Som sådan, er innføringen av denne modellen organisme blir en stadig mer nyttig mekanistisk strategi for å studere cerebrovaskulær sykdom8. En rekke sebrafisk modeller har blitt generert som recapitulate fenotyper assosiert med Stroke-relaterte forhold9,10,11,12. Bruk av sebrafisk larver for å undersøke sykdoms patogenesen tilbyr både praktiske og vitenskapelige fordeler fremfor pattedyr modeller8. Dette inkluderer høy reproduksjon priser, rask utvikling og larvestadiet åpenhet som gjør det mulig for intravital Imaging uten invasiv begrensninger knyttet gnagere. Sammenkobling av disse fordelene med det brede spekteret av transgene reporter-linjer i det sebrafisk forskningsmiljøet utgjør en kraftig in vivo -tilnærming for å studere sykdoms biologi, som ennå ikke er benyttet for å studere patologisk konsekvensene av ICH.
Skaden respons på blod i hjernen er bifasisk13; den primære fornærmelse fører neuronal død og celle nekrose, som deretter initierer en sekundær bølge av skader som er indusert av medfødt immun aktivering. Den andre fasen av hjerneskade, spesielt den neuroinflammatory komponenten, er ansett som et realistisk mål for fremtidig behandling13. Spontane og cerebral-spesifikke blødninger har blitt beskrevet i sebrafisk larver tidligere14,15,16,17,18,19. To slike modeller er bruken av Atorvastatin (ATV) ved 24 h post-befruktning (hpf) for å hemme HMGCR veien og kolesterol biosyntesen14, og en rotehode (BBH) mutant som uttrykker en hypomorphic mutasjon i arhgef7 genet, βpix, og deretter hemmer utgangen remodeling for stramt endovaskulær kryss18. Disse modellene viser spontan cerebral-spesifikke blodkar brudd ved utbruddet av sirkulasjon (~ 33 hpf). Nylig har vi karakterisert disse modellene videre for å avdekke at viktige aspekter ved hjerneskade responsen er bevart mellom mennesker og sebrafisk larver20. Denne studien demonstrerer metodikken som kreves for å oppnå og visualisere spontane hjerne blødninger i sebrafisk larver og hvordan å kvantifisere hjerneskade, og Locomotor og neuroinflammatory fenotyper som er knyttet til den menneskelige tilstand. Disse data og teknikker støtter bruk av denne modellen arter som et verdifullt supplerende system for pre-klinisk ICH forskning.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1159px;" width="1160">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">24 well plates</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">CLS3527</td>
			<td style="width:441px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">28 &#176;C incubator</td>
			<td style="width:227px;">LMS</td>
			<td align="right" style="width:165px;">210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Atorvastatin</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">PZ0001-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Breeding boxes</td>
			<td style="width:227px;">Thoren Aquatics systems</td>
			<td align="right" style="width:165px;">10011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Daniovision observation chamber</td>
			<td style="width:227px;">Noldus</td>
			<td style="width:165px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">E3 medium 1x</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:165px;"></td>
			<td>4% Instant Ocean, 500 &#181;L methylene blue in 1 L dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">EthoVision XT software</td>
			<td style="width:227px;">Noldus</td>
			<td style="width:165px;">version 11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heat block</td>
			<td style="width:227px;">Grant-Bio</td>
			<td>PHMT-PSC18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Instant ocean</td>
			<td style="width:227px;">Instant Ocean</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Lightsheet microscope</td>
			<td style="width:227px;">Zeiss</td>
			<td style="width:165px;">Z.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lightsheet microscope mounting capillary</td>
			<td style="width:227px;">Zeiss</td>
			<td>402100-9320-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Low melt agarose</td>
			<td style="width:227px;">Promega</td>
			<td style="width:165px;">V2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Methylene Blue</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">319112-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Microscope&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Leica</td>
			<td style="width:165px;">MZ95</td>
			<td>dissection microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Microscope</td>
			<td style="width:227px;">Leica</td>
			<td>M165FC</td>
			<td>fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;">MS222</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td></td>
			<td>4g tricaine powder, 500 mL of dH2O, 10 mL of 1 M Tris (pH 9). Adjust pH to ~7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P1000 pipette</td>
			<td style="width:227px;">Gilson</td>
			<td>F144059M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">P1000 pipette tips</td>
			<td style="width:227px;">Starlab</td>
			<td style="width:165px;">S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pasteur pipettes</td>
			<td style="width:227px;">Starlab</td>
			<td style="width:165px;">E1414-0300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dishes&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Corning</td>
			<td style="width:165px;">101VR20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipetboy</td>
			<td style="width:227px;">Integra Biosciences</td>
			<td style="width:165px;">PIPETBOY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Stripette 25ml</td>
			<td style="width:227px;">Corning</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Tricaine powder</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">A5040-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Base</td>
			<td style="width:227px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:165px;">BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra fine dissection forceps</td>
			<td style="width:227px;">Agar scientific</td>
			<td style="width:165px;">AGT502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Zen software</td>
			<td style="width:227px;">Zeiss</td>
			<td style="width:165px;">version 2.3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using zebrafish larvae to study the pathological consequences of hemorrhagic stroke

Til tross for at den mest alvorlige under type av slag med høy global dødelighet, er det ingen spesifikk behandling for pasienter med intracerebrale blødning (ICH). Modellering ICH pre-klinisk har vist seg vanskelig, og nåværende gnager modeller dårlig recapitulate den spontane natur menneskelige ICH. Derfor er det et presserende behov for alternative pre-kliniske metoder for studier av sykdoms mekanismer i ICH og for potensielle narkotika funn.
Bruken av sebrafisk representerer en stadig mer populær tilnærming for translational forskning, hovedsakelig på grunn av en rekke fordeler de har over pattedyr modeller av sykdom, inkludert produktive reproduksjon priser og larvestadiet åpenhet slik at Live Imaging. Andre grupper har fastslått at sebrafisk larver kan utvise spontane ICH etter genetisk eller kjemisk forstyrrelse av cerebrovaskulær utvikling. Målet med denne metodikken er å bruke slike modeller for å studere patologiske konsekvensene av hjerneblødning, i sammenheng med pre-klinisk ICH forskning. Av benytter bo tenkelig og motilitet analyser, hjerneskade, nevroinflammasjon og Locomotor funksjonen fulgte ICH kan vurdert og kvantifisert.
Denne studien viser at viktige patologiske konsekvenser av hjerneblødning hos mennesker er bevart i sebrafisk larver fremheve modellen organisme som en verdifull in vivo system for pre-klinisk undersøkelse av ICH. Målet med denne metodikken er å aktivere pre-klinisk hjerneslag samfunnet til å ansette den sebrafisk larvestadiet modellen som et alternativ komplementær modell system til gnagere.

Vurdering av hjernecelledød ved hjelp av transgene Ubiq:SecAnnexinV-mVenus resulterer i klare definitive klynger av døende celler i ICH + larver i både ATV og BBH modeller som er fraværende i alle ICH-larver (Figur 3). Klynger vike før 96 hpf. Gjennom bildeanalyse, blødning er forbundet med en betydelig to ganger økning i total intensitet av fluorescens signal i hjernen, indikerer markert celle død.
En neuroinflammatory svar er identifisert i ICH + larver av betydelig økt antall MPEG1 positive macrophage celler i hjernen. Antallet av totalt MPO positive nøytrofile celler også økt men dette nådde ikke statistisk betydning (Figur 4). Den morfologi av MPEG1 positive makrofager kan også sees å endre i ICH + larver som cellene vedta en aktiv, avrundet, Amoeboid form. Disse aktiverte avrundede celler kan også overvåkes over tid for å vise en økt phagocytic respons av Ubiq:SecAnnexinV-mVenus uttrykke døende celler i ICH + larver (figur 5). MPEG1 positive makrofager stiller ramified prosesser ble kategorisert som inaktive.
Brain blødning er forbundet med en betydelig nedgang i motilitet på 72 og 96 hpf i forhold til ICH-søsken kontroller i både BBH og ATV-modeller (figur 6). Motilitet på 120 hpf gjenoppretter til nær Baseline nivåer. Det er ofte forskjeller i Baseline motilitet mellom egg klørne og stammer og så sammenligning bør gjøres til ICH-kontroller hver gang.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig3.jpg"> Figur 3 : Intracerebrale blødning (ICH) i sebrafisk larver resulterer i en målbar hjerneskade. (A) representative bilder av hjerneskade FENOTYPE i ICH + larver (høyre panel), i forhold til ICH-søsken (venstre paneler), på 72 hpf. Brightfield bilder (nederste paneler, skala bar = 250 μm) demonstrere tilstedeværelsen av hjernen blør (piler) i ICH + larver. Fluorescerende mikroskopi ble utført for å visualisere celle død i Ubiq:SecAnnexinV-mVenus reporter linje (topp paneler, skala bar = 100 μm). Klynger av døende celler ble observert i Peri-hematomal regioner. Bilder ble beskåret til hjerne-bare regioner og analysert for total grønn fluorescens intensitet i runde partikler større enn 30 piksler i diameter (hvit linje) ved hjelp av makroen i supplerende fil 1. (B) kvantifisering av fluorescens signal i hjernen av UBEHANDLET, ICH-og ICH + larver innhentet gjennom ATV-modellen (n = 12 per gruppe, 3 uavhengige replikerer) på 72 hpf. Betydelige forskjeller ble observert ved sammenligning ICH + med ubehandlet (* * p = 0,004) og med ICH-(* p = 0,03) søsken. (C) kvantifisering av fluorescens signal som lest opp for annexinV binding i hjernen til ICH-og ICH + larver innhentet gjennom rotehode (BBH) modell (n = 12 per gruppe, 2 uavhengige replikerer) på 72 hpf. Grafer viser SD fra gjennomsnittet. En signifikant forskjell i mVenus fluorescens ble observert mellom ICH + og ICH-alder-matchet søsken (* * p = 0,002). Figuren er gjengitt fra Crilly et al.20 med tillatelse under en Creative Commons-lisens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig4.jpg"> Figur 4 : Intracerebrale blødning (ICH) initierer en medfødt mobilnettet immunrespons i sebrafisk larvestadiet hjernen. Antall leukocytter kvantifisert i hjernen regionene tidligere beskrevet for MPO: GFP; MPEG1: dsRed doble transgene larver (n = 8 per gruppe, 2 uavhengige replikerer) på 72 hpf avslører en betydelig økning i makrofager (* p = 0,01), men ikke nøytrofile (p = 0,5), som svar på ICH. Figuren er gjengitt fra Crilly et al.20 med tillatelse under en Creative Commons-lisens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig5.jpg"> Figur 5 : Aktiverte macrophage celler viser en phagocytic reaksjon på hjernen lesjon. (A) representative tidsforløp stillbilder20 viser en ramified patruljerer macrophage migrerer mot en annexinV positiv celle (i-vi). Stillbilder er Hentet fra en rekke bilder tatt av hele hjernen ved hjelp av en 20x objektiv. Scale bar representerer 50 μm. Macrophage ervervet en Amoeboid morfologi (v) før phagocytosing av den annexinV-positive cellen (vi, VII). Etter fagocytose fortsetter macrophage en ramified morfologi og migrerer bort og den annexinV-positive cellen kan ikke lenger sees (VIII). Ramified macrophage (#), annexinV positiv celle (pil), Amoeboid macrophage (*) er angitt. (B) representative bilder av MPEG1-positive celler i ICH-og ICH + larvestadiet hjernen viser Amoeboid og ramified morfologier. Skala stolper representerer 50 μm. (C) en økt andel av Amoeboid (phagocytic) og redusert andel av ramified (inaktive) makrofager ble OBSERVERT i ICH + hjerner i forhold til ICH-søsken. Figuren er gjengitt fra Crilly et al.20 med tillatelse under en Creative Commons-lisens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig5large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> 
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig6.jpg"> Figur 6 : ICH-indusert hjerneskade resulterer i en målbar Locomotor underskudd i sebrafisk larver. (A) representative eksempler på svømming spor i ICH-og ICH + BBH larver på 72, 96 og 120 hpf. (B) ICH + larver utstilt en betydelig reduksjon i den kumulative tid brukt mobil i løpet av 10 min innspillingen periode på både 72 og 96 hpf. Betydning var tapt på 120 hpf tidspunkt potensielt samband til utvinning fra hjerneskade (n = 24 larver per gruppe; 3 uavhengige replikerer; * * * * p = 0,00006; * * p = 0,003; NS: p = 0,08). (C) kvantifisering av kumulativ tidsbruk beveger seg i UBEHANDLET og ATV-behandlet ICH-og ICH + larver på 120 hpf. ICH + larver utstilt en betydelig reduksjon i den kumulative tid brukt mobil i løpet av 10 min opptaks perioden. Tre tekniske replikerer (n = 24 larver per gruppe) ble brukt til å beregne SD fra gjennomsnittet (* * * p = 0,00004, * * p = 0,0003). Figuren er gjengitt fra Crilly et al.20 med tillatelse under en Creative Commons-lisens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig6large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> 
Tilleggsfil 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/Supplementary_File_1-Macro.docx" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using Zebrafish Larvae to Study the Pathological Consequences of Hemorrhagic Stroke at JoVE.com

Using Zebrafish Larvae to Study the Pathological Consequences of Hemorrhagic Stroke

Her presenterer vi en protokoll for å kvantifisere hjerneskade, Locomotor underskudd og nevroinflammasjon følgende blødning i hjernen i sebrafisk larver, i sammenheng med menneskelig intracerebrale blødning (ICH).

Bruke sebrafisk larver til å studere patologiske konsekvenser av hemoragisk Stroke

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage ...

Denne metoden gir en gratis preklinisk tilnærming for å studere den umiddelbare cellulære responsen på blod i hjernen etter et hemorragisk slag, en svært alvorlig tilstand som vi ikke har noen spesifikke medisiner tilgjengelig for pasienter. I motsetning til gnagermodeller tillater gjennomsiktigheten av sebrafisk larver oss å observere cellulære responser i hjernen til levende intakte dyr i sanntid ved hjelp av fluorescerende mikroskopi. Til å begynne med, bruk en tesil for å samle alle befruktede embryoer fra naturlig gyting i avlsbokser produsert fra en mann og en til to kvinnelige voksne sebrafisk.Overfør 100 embryoer til hver petriskål som inneholder standard E3 embryomedium. Inkuber ved 28 grader Celsius og trinn i henhold til standard retningslinjer. På seks timer etter befruktning, fjern døde og ubefruktede embryoer fra parabolen ved hjelp av en Pasteur pipette og legg oppvasken tilbake i inkubatoren.Ved 24 timer etter befruktning, under et lyst feltstereomikroskop, bruker skarpe ultratynne disseksjonskraft for å dekorionere embryoer for Atorvastatin-behandling. Tilsett deretter 30 milliliter E3 embryomedium til to rene Petri-retter, en for behandling og den andre for kontroll. Fjern 60 mikroliter embryovann fra behandlingsfatet og tilsett 60 mikroliter på 0,5 millimolar Atorvastatin for å oppnå 80% av larver blødning.Bruk en Pasteur pipette, overfør 100 embryoer i så lite vann som mulig til hver tallerken. Inkuber de to rettene på 28 grader Celsius. Når som helst etter 50 timer etter befruktning, bruk en Pasteurpipette under mikroskopet til å forsiktig skille hemorragisk fisk fra ikke-hemorrodige populasjoner og overføre larver til nye retter som inneholder friske E3-medier.For å gjøre det lettere å skille blødningpositive larver, kan du bruke fisk uten pigment eller fisk som uttrykker fluorescerende protein i røde blodlegemer. På den tredje dagen, under et fluorescerende mikroskop, skjermbilde larver for å sikre uttrykk for fluorescerende protein. Fyll deretter lysarkmonteringskammeret med E3-medier som inneholder 0,2% MS-222 for bedøvelse.Bruk en Pasteur pipette, overfør en enkelt dråpe som inneholder en til seks larver til en tørr petriskåloverflate for montering. Bruk en pipette til å fjerne så mye væske som mulig. Legg til en dråpe 1,5% lav smelte oppsto fra 45 grader Celsius varmeblokk til larver og bruk en 800 mikrometer montering kapillær for å trekke larver opp hodet først.Hvis posisjonering ikke er nøyaktig, utvise larver fra agarose og montere igjen. La kapillæren avkjøles og sett deretter inn i lysarkkammeret. På ZEN-bildeprogramvaren trykker du kontinuerlig for å orientere larver og trykk på erverve for å skaffe z-stack bilder av hodet mellom øyelinsene.Generer et projeksjonsbilde med maksimal intensitet fra hver z-stabel i kategorien behandling. For å tilfeldig velge for motilitetsanalyse, overfør 24 larver etter anestesi til friske E3-medier og la dyrene komme seg fra anestesi. Etter larver har fullstendig gjenopprettet fra anestesi, ved hjelp av en pipette med end cut overføring gjenvunnet larver til E3 medium uten metylen blå.Plate en larve i en milliliter per brønn av en 24 brønnplate. Legg platen inn i kamerakammeret. I EthoVision XT-sporingsprogramvaren justerer du eksperimentinnstillingene for å konfigurere en oppsiktsvekkende rutine for hvitt lys for å øke spontan svømming og analysebevegelse i 10 minutter.Gjenta bevegelsesanalysen ved 96 og 120 timer etter gjødsel. Vurdering av hjernecelledød ved hjelp av en transgen ubiquitin utskilles Annexin V M venøs reporterlinje resulterer i klare bestemte klynger av døende celler i blødninger larver som er fraværende i alle ikke-hemorrhaged larver indikert av grønn fluorescens Bright-feltbilder viser tilstedeværelsen av hjerneblødninger. Døende celler ble observert i både Atorvastatin- og boblehodemodeller for blødningslarver.Morfologien til MPEG1-positive makrofager endres i intracerebral blødning positive larver som cellene vedtar i aktiv avrundet amoeboid form. Disse aktiverte avrundede cellene ble overvåket over tid for å vise en økt fagocytisk respons av ubiquitin utskilles Annexin V M venøs uttrykker døende celler i intracerebral blødning positive larver. Hjerneblødning er forbundet med en betydelig reduksjon i motilitet ved 72 og 96 timer etter befruktning i forhold til intracerebral blødning negative søskenkontroller.Motilitet ved 120 timer etter befruktning gjenoppretter til nær baseline nivåer. Det viktigste aspektet ved denne prosedyren er å være sikker på å grundig undersøke larver for tilstedeværelse eller fravær av hjerneblødninger før du går videre til fenotyping analysene. Denne modellen kan også brukes til narkotikascreening for å avgjøre om fenotype alvorlighetsgrad kan forbedres etter en blødning, en tilnærming som kan føre oss til å identifisere nye narkotikakandidater i fremtiden.Denne teknikken tillater oss å utforske de cellulære svarene umiddelbart etter en blødning i hjernen i en tidsperiode som har vært så notorisk vanskelig å studere før nå. Selv om ingen av reagensene eller instrumentene som er beskrevet i denne protokollen er spesielt farlige, må standard forsiktighet og forholdsregler tas gjennom når du bruker kjemikalier, skarpe eller lasere.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualisering av Proprioceptors i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver og pupper

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Lett preferanse analysen å studere medfødte og Circadian Regulert Photobehavior i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

Automatiserte høy gjennomstrømming Behavioral Analyser i sebrafisk Larver

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

Utlede Tid Course of Glutamat Lagersalg med en deconvolution Analyse av astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

Elektroretinogrammet Analyse av Visual Response i Sebrafisk Larver

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

Utilizing 3D Printing Technology to Merge MRI with Histology: A Protocol for Brain Sectioning

Utnytte 3D utskriftsteknologi til Merge MR med histologi: En protokoll for Brain Seksjonering

Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Tidsavhengig økning i nettverksresponsen til stimulering av neuronale cellekulturer på mikroelektrodearrayer

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

Ablasjon av Neuronal innbyggere med en to-fotonet Laser og sin vurdering ved hjelp av kalsium Imaging og atferdsmessige opptak i sebrafisk larver

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

In vivo avbildning av fullt aktivt hjernevev i våken sebrafisk larver og juveniler av hodeskalle og hudfjerning

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...