Name: using zebrafish larvae to study the pathological consequences of hemorrhagic stroke
Uploaded: 2019-06-05T15:00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Zebrafish Larvae to Study the Pathological Consequences of Hemorrhagic Stroke at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить д-ра Дэвида Спиллера и Основной фонд микроскопии Манчестерского университета за использование оборудования, профессора Ричарда Бейнса за использование DanioVision и д-ра Джека Риверса-Аути для статистической консультации. Линия bbh была любезно разделена Николь Мунси из лаборатории доктора Сары Чайлд в Университете Калгари. Мы также благодарим профессора Стивена Реншоу, д-ра Адама Херлстоуна, д-ра Эндрю Бадрока и д-ра Хелен Янг за рыбные линии и оборудование.
Это исследование было поддержано NC3Rs (NC/N002598/1), Stroke Association (TSA LECT 2017/02), ERA-NET NEURON (MR/M501803/1) и Британским фондом сердца (FS/15/67/32038). Мы также особенно благодарны Фонду Натали Кейт Мосс и факультету биологии, медицины и здравоохранения Манчестерского университета за их постоянную финансовую поддержку.

Зебрафиш были подняты и поддерживается в Университете Манчестера биологических услуг группы в стандартных условиях, как ранее описано21. Взрослый зебры животноводства была одобрена Университетом Манчестера животных благосостояния и этического обзора совета. Все эксперименты проводились в соответствии с правилами Министерства внутренних дел (PPL/PPL/P132EB6D7).
ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ, используемые в этом исследовании включают макрофаг-специфической линии mpeg1,mCherry (построен в доме, как ранее описано22), нейтрофил-специфический mpo,GFP23,эритроид-специфический gata1 dsRed24 и ubiq. На рисунке 1 показана экспериментальная шкала времени.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> Рисунок 1 : Графика экспериментальной временной шкалы для характеристики черепно-мозговой травмы, локомоторных и нейровоспалительных исходов. ICH, внутримозговое кровоизлияние; bbh, пузырьковая головка. Рисунок был воспроизведен с Crilly et al.20 с разрешения под лицензией Creative Commons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a> 
1. День 0. Производство и сбор яиц
<ol><li>Собирайте оплодотворенные эмбрионы от естественного нереста в племенных коробках, произведенных у 1 самца и 1-2 самки взрослых зебры. ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ однократное ПРИМЕЧАНИЕ однократнодляное между штаммами любой дикий тип/трансгенные животные.</li>
	<li>Инкубировать 100 эмбрионов при 28 градусах Цельсия в стандартной среде эмбриона E3 на чашку Петри и стадии в соответствии со стандартными руководящими принципами26.</li>
	<li>В 6 часов после оплодотворения (hpf) удалить мертвых и неоплодотворенных эмбрионов из тарелки с помощью пастера пипетка.</li>
</ol>2. День 1. Аторвастатин лечение на 24 л.с.
<ol><li>Дехорионат эмбрионов для лечения аторвастатина с использованием острых ультра тонких рассечения щипцы27. Цифры, необходимые для экспериментов, могут быть соответствующим образом скорректированы.</li>
	<li>Добавьте 30 мл эмбриона E3 среднего до двух чистых блюд Петри. Используйте одно блюдо для 100 эмбрионов. ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ, если плиты конструированы для культуры клетки, то dechorionated зебра на этой предыдущей стадии часто прилипает к дну. Чтобы избежать этого, тщательно промыть пластины в чистой воде перед использованием.</li>
	<li>Удалить 60 л эмбриональной воды из лечебной пластины и добавить 60 юл 0,5 мМ аторвастатин (ATV). При концентрации запасов 0,5 мм, вышеуказанное разбавление приведет к окончательной концентрации 1 МКм, что приведет к 20% личинок, не кровоизлияний (ICH-) и 80% личинок кровоизлияния (ICH). Используйте другую пластину для необработанных элементов управления ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ ОДНОЗАМЕЧАНИЕ, аторвастатин растворяется в дистиллированной воде (3 мг в 10 мл), чтобы сделать раствор запаса 0,5 мм. Инкубировать на ночь при комнатной температуре в темноте с возбуждением, так как растворимизация занимает некоторое время. Полная растворимизация может занять до 1 недели. Не используйте DMSO. Раствор aliquoted и хранится при -20 градусах Цельсия. Не замораживайте оттепель.</li>
	<li>Используя пипетку Pasteur, перенесите 100 эмбрионов в как можно меньше воды на лечебные пластины.</li>
	<li>Инкубировать пластины при 28 градусах Цельсия. ПРИМЕЧАНИЕ, ICH будет происходить между 33 и 48 л.с. Аторвастатин не нужно удалять, так как инкубация длиннее 24 ч не вызывает никаких дальнейших проблем с развитием.</li>
</ol>3. День 2. Разделение популяций ICH- и ICH на 50 л.с.
<ol><li>Отделить рыбу Ich- от ICH-популяций и перевести на новые блюда для удобства.<ol>
<li>При использовании модели ATV в концентрации 1 ММ, 75-100% личинок будут проявлять кровоизлияние (Ich) в этот момент времени. ПРИМЕЧАНИЕ МЕСТО ПРИМЕЧАния к ответу личинок отличается между штаммами, если личинки не кровоизлияния на желаемых частотах, используйте свежую партию аторвастатина или более высокую концентрацию. Если личинки не выставили кровоизлияния на 48 л.с., то считайте их ICH-.</li>
		<li>При использовании модели bbh, все гомозиготные мутанты будут проявлять кровоизлияние на 48 л.с. При использовании гетерозиготного инкросса, ICH-гетерозиготные и дикие братья и сестры могут быть использованы в качестве контрольных животных для экспериментов.</li>
	</ol>
</li>
	<li>При необходимости обезображив личинок, добавив 0,02% MS222 в e3-носители. Используя пипетку Pasteur, сортируйте личинки для присутствия крови в голове в свежие средства массовой информации E3. Посмотреть рисунок 2. ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ, Кровь в голове может появиться в передний, средний или задний мозг или в комбинации, и кровоточить объем может варьироваться между животными. В bbh мутантов, ICH часто связано с тяжелым отек узнаваемым более крупными головами, более широкое пространство между глазами и более рассеянное кровотечение. Однако не все личинки ICH' bbh обладают отеками.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig2.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> Рисунок 2 : Фенотипы кровоизлияния в мозг. Примеры личий ICH фенотипов поддерживается на трансгенных gata1'DsRed репортер перламутровый фон наблюдается с яркой стереомикроскоп (верхние панели) и флуоресценции (нижняя панель) на 48 ч после оплодотворения. В ЛИЧ-личинках (левых панелях) кровоизлияний не наблюдалось. В личинках ICH ' (правые панели) наблюдалось заметное накопление эритроцитов в предтече и заднем мозге (стрелках). Шкала баров представляют 250 мкм. Рисунок был воспроизведен из Crilly et al.20 с разрешения под лицензией Creative Commons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a> 
4. День 3. Клеточная смерть и лейкоцитов анализ на 72 л.с.
<ol><li>Экран личинок с помощью флуоресцентного микроскопа для обеспечения экспрессии флуоресцентного белка. ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ, В этом исследовании, трансгенные ubiq'secAnnexinV-mVenus личинки были использованы для сообщения о гибели клеток мозга и двойной трансгенной mpo(GFP); mpeg1(мПГЕ1)или убик(secAnnexinV-mVenus); mpeg1 (мпег1))используется для анализа лейкоцитов.</li>
	<li>Заполните световую монтажную камеру с помощью e3-носителя, содержащего 0,02% MS222.</li>
	<li>Анестезия личинок с помощью 0,02% MS222. Перенесите личинки для монтажа (n no 1-6) на сухую поверхность блюда Петри в одну каплю. Удалите как можно больше жидкости. ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ, 1.5% низкий расплавленный агароза подготовлена используя 0.15 g агарозы низкого расплава растворяемого в 10 ml среды E3 без метиленового синего цвета в микроволновой печи и держится на 45 c до использования.</li>
	<li>Добавьте каплю 1,5% низкорасплавленной агарозы (поддерживаемой в качестве жидкости в тепловом блоке 45 градусов Цельсия) к личинкам и с помощью капилляра 800 мкм, и сначала нарисуйте личинки головой. Если позиционирование не является точным, личинки могут быть исключены из агарозы и установлены снова. Оставьте капилляр остыть перед вставкой в камеру световой листа. ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ, Альтернативно, конфокальный микроскоп смог быть использован для этой процедуры. Для этого личинки должны быть установлены боково в агарозе на стеклянной нижней тарелке.</li>
	<li>Приобретите изображения головы между линзами глаза z-stack (300 мкм) и переполните максимальное изображение проекции интенсивности.<ol>
<li>Анализ области мозга из изображений, собранных для общего числа флуоресцентных клеток и общей интенсивности флуоресценции20.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Создайте промежуток времени видео нескольких проекционных композитов в течение 18-24 ч для отслеживания подвижности лейкоцитов и взаимодействия с умирающими клетками. ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ, Если долгосрочная живая визуализация выполняется, только одна личинка установлена в капилляре.</li>
	<li>Когда изображение завершено изгнать личинок из монтажа капилляров в смертельной передозировки 4% MS222 усыпления.</li>
</ol>5. День 3. Выбор личинок для асссирования подвижности на 72 л.с.
<ol><li>Анестезия личинок в чашках Петри с 0,02% MS222.</li>
	<li>Случайно выберите n 24 личинки для ассеии подвижности и передачи в свежие E3 носителей и позволяют животным оправиться от анестезии. ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ примечание мейнснетвейка на данный момент удаляет смещения выбора для медленных пловцов, которые легко поймать.</li>
</ol>6. День 3-5. Assaying передвижения на 72, 96 и 120 л.с.
<ol><li>Передача личинок, выбранных на 72 л.с. в E3 среде без метилена синий. ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ, для assaying на 3 dpf позволяют личинки достаточно времени, чтобы оправиться от анестезии (No gt;1 ч).</li>
	<li>Плита одна личинка в 1 мл на колодец из 24-хорошо пластины с помощью пипетки. ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ. Вырезать конец кончика пипетки, чтобы избежать повреждения личинок. Размер плиты может быть изменен в соответствии с экспериментальным дизайном.</li>
	<li>Загрузите пластины в камеру камеры и ассеировать движение в течение 10 минут с помощью белого света испуга рутины для увеличения спонтанного плавания. ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ одноразового поведения было отслежено с помощью камеры камеры и программного обеспечения для отслеживания (см. таблицуматериалов).</li>
	<li>Повторите эксперимент с теми же личинками на 96 и 120 л.с. Перемещение личинок из индивидуального жилья в анализ пластины в чашку Петри и инкубировать при 28 градусов по Цельсию между анализами.</li>
	<li>По завершении ассоговые работы, эвтаназии личинок в смертельной передозировки 4% MS222.</li>
</ol>

<ol>
	<li>An, S. J., Kim, T. J., Epidemiology Yoon, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology,+risk+factors,+and+clinical+features+of+intracerebral+hemorrhage:+an+update.">Epidemiology, risk factors, and clinical features of intracerebral hemorrhage: an update.</a> Journal of stroke. 19 (1), 3 (2017).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The top 10 causes of death. , (2017).</li><li>Casals, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+animal+models+for+stroke+research:+a+review.">The use of animal models for stroke research: a review.</a> Comparative medicine. 61 (4), 305-313 (2011).</li><li>Kellner, C. P., Connolly, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+Strategies+for+Intracerebral+Hemorrhage+Trials+and+Translation.">Neuroprotective Strategies for Intracerebral Hemorrhage Trials and Translation.</a> Stroke. 41 (10 Suppl 1), S99-S102 (2010).</li><li>Kirkman, M. A., Allan, S. M., Parry-Jones, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+intracerebral+hemorrhage:+avoiding+pitfalls+in+translational+research.">Experimental intracerebral hemorrhage: avoiding pitfalls in translational research.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (11), 2135-2151 (2011).</li><li>ASPA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 1986 amendments. , (2012).</li><li>Butler, M. G., Gore, A. V., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in cell biology. 105, 137-161 (2011).</li><li>Walcott, B. P., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+of+cerebrovascular+disease.">Zebrafish models of cerebrovascular disease.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 34 (4), 571-577 (2014).</li><li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+mediate+the+repair+of+brain+vascular+rupture+through+direct+physical+adhesion+and+mechanical+traction.">Macrophages mediate the repair of brain vascular rupture through direct physical adhesion and mechanical traction.</a> Immunity. 44 (5), 1162-1176 (2016).</li><li>Kasher, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+samhd1+morphant+zebrafish+recapitulates+features+of+the+human+type+I+interferonopathy+Aicardi-Goutieres+syndrome.">Characterization of samhd1 morphant zebrafish recapitulates features of the human type I interferonopathy Aicardi-Goutieres syndrome.</a> The Journal of Immunology. 194 (6), 2819-2825 (2015).</li><li>Wen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+rnf213a+by+TALEN+causes+abnormal+angiogenesis+and+circulation+defects+in+zebrafish.">Mutation of rnf213a by TALEN causes abnormal angiogenesis and circulation defects in zebrafish.</a> Brain research. 1644, 70-78 (2016).</li><li>Eisa-Beygi, S., Rezaei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etiology+of+intracerebral+hemorrhage+(ICH):+novel+insights+from+Zebrafish+embryos.">Etiology of intracerebral hemorrhage (ICH): novel insights from Zebrafish embryos.</a> International Journal of Developmental Biology. 60 (4-5-6), 119-126 (2016).</li><li>Mracsko, E., Veltkamp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation+after+intracerebral+hemorrhage.">Neuroinflammation after intracerebral hemorrhage.</a> Frontiers in cellular neuroscience. 8, 388 (2014).</li><li>Eisa-Beygi, S., Hatch, G., Noble, S., Ekker, M., Moon, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA+reductase+(HMGCR)+pathway+regulates+developmental+cerebral-vascular+stability+via+prenylation-dependent+signalling+pathway.">The 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (HMGCR) pathway regulates developmental cerebral-vascular stability via prenylation-dependent signalling pathway.</a> Developmental biology. 373 (2), 258-266 (2013).</li><li>Shen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+Rho-kinase+inhibitors+by+docking-based+virtual+screening.">Discovery of Rho-kinase inhibitors by docking-based virtual screening.</a> Molecular BioSystems. 9 (6), 1511-1521 (2013).</li><li>Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tanshinone+I+prevents+atorvastatin-induced+cerebral+hemorrhage+in+zebrafish+and+stabilizes+endothelial+cell-cell+adhesion+by+inhibiting+VE-cadherin+internalization+and+actin-myosin+contractility.">Tanshinone I prevents atorvastatin-induced cerebral hemorrhage in zebrafish and stabilizes endothelial cell-cell adhesion by inhibiting VE-cadherin internalization and actin-myosin contractility.</a> Pharmacological research. , (2017).</li><li>Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+ROCK+inhibitor,+FPND,+which+prevents+cerebral+hemorrhage+through+maintaining+vascular+integrity+by+interference+with+VE-cadherin.">Discovery of a ROCK inhibitor, FPND, which prevents cerebral hemorrhage through maintaining vascular integrity by interference with VE-cadherin.</a> Cell death discovery. 3, 17051 (2017).</li><li>Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&#946;Pix-Pak2a+signaling+pathway+regulates+cerebral+vascular+stability+in+zebrafish.">A &#946;Pix-Pak2a signaling pathway regulates cerebral vascular stability in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (35), 13990-13995 (2007).</li><li>ten Klooster, P. J., Jaffer, Z. M., Chernoff, J., Hordijk, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+and+activation+of+Rac1+are+mediated+by+the+exchange+factor+&#946;-Pix.">Targeting and activation of Rac1 are mediated by the exchange factor &#946;-Pix.</a> The Journal of cell biology. 172 (5), 759-769 (2006).</li><li>Crilly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+zebrafish+larval+models+to+study+brain+injury,+locomotor+and+neuroinflammatory+outcomes+following+intracerebral+haemorrhage.">Using zebrafish larval models to study brain injury, locomotor and neuroinflammatory outcomes following intracerebral haemorrhage.</a> F1000Research. 7, (2018).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish. , (2000).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).</li><li>Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li><li>Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants.">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nature immunology. 4 (12), 1238 (2003).</li><li>Morsch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+microglial+engulfment+of+dying+neurons+in+the+zebrafish+spinal+cord.">In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord.</a> Frontiers in cellular neuroscience. 9, (2015).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Liang, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish in the Classroom. , (2011).</li><li>Yang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miconazole+protects+blood+vessels+from+MMP9-dependent+rupture+and+hemorrhage.">Miconazole protects blood vessels from MMP9-dependent rupture and hemorrhage.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 10 (3), 337-348 (2017).</li><li>Andaluz, N., Zuccarello, M., Wagner, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+animal+models+of+intracerebral+hemorrhage.">Experimental animal models of intracerebral hemorrhage.</a> Neurosurgery Clinics of North America. 13 (3), 385-393 (2002).</li><li>Rosenberg, G. A., Mun-Bryce, S., Wesley, M., Kornfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagenase-induced+intracerebral+hemorrhage+in+rats.">Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats.</a> Stroke. 21 (5), 801-807 (1990).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Это исследование показывает, что ICH в личинки зебры вызывает ответ травмы головного мозга, что резюмирует ключевые аспекты человеческого состояния, которые могут быть систематически анализируется и количественно. Зебрафиш предлагают последовательную и воспроизводимую модель спонтанного ICH, который поможет с будущими исследованиями вмешательства наркотиков сосредоточены на ориентации кровотока индуцированной черепно-мозговой травмы, а не предотвращение разрыва сосуда17,28. Действительно, учитывая быстрый характер заболевания, сродни клинической ситуации, такой подход открывает захватывающие перспективы для успешного перевода в будущем.
Некоторые ограничения связаны с использованием личинок зебры, таких как использование развивающейся системы и таксономического ранга, однако практические и научные преимущества этой модели должны быть рассмотрены, чтобы предложить новые идеи в ICH. Никакая операция не требуется, чтобы инициировать кровотечение или контролировать клеточные процессы в течение длительных периодов времени после травмы. Высокая плодовитость спаривания зебры генерирует легкодоступные и большие размеры образцов, а благодаря быстрому развитию личинок экспериментальная хронология значительно снижается по сравнению с исследованиями грызунов29,30.
В настоящее время эти модели пригодны для использования для выяснения непосредственной патологической и иммунологической реакции на спонтанный ICH в мозге живых нетронутых животных. Потенциально, эта модель может быть адаптирована для средне-высокой пропускной связи наркотиков экраны для ICH терапии, будь то профилактические или восстановления содействия. Таким образом, патологии пост-ICH, представленные в данном исследовании, представляют собой альтернативную, дополняемую платформу для доклинических исследований ICH.

Внутримозговое кровоизлияние (ICH) является наиболее тяжелым подтипом инсульта, связанного с спонтанным разрывом сосуда головного мозга и кровотечением в паренхиму, приводящим к повреждению мозга, физической инвалидности и часто йен1. Несмотря на высокую смертность и заболеваемость, связанную с ICH2,понимание лежащей в основе этиологии и патологии после кровоизлияния по-прежнему отсутствует. Как таковой, Есть никаких конкретных методов лечения для предотвращения ICH или улучшить исходы пациента. Большая часть нашего понимания биологии болезни пришла из доклинических моделей грызунов ICH3, однако исследования на сегодняшний день в этих моделях не удалось перевести какой-либо успешной терапии в клинику4,5. Эта неудача может быть отчасти связано с некоторыми ограничениями этих доклинических моделей, в том числе неспособность легко резюмировать спонтанный характер болезни человека и требование для инвазивной хирургии для создания моделей у млекопитающих6. Кроме того, грызуны создают практические проблемы в отношении наблюдения быстрого начала клеточных реакций на ICH в нетронутой ткани. Учитывая отсутствие перевода с моделей грызунов, разработка альтернативных моделей спонтанного ICH необходимо, если мы хотим преодолеть эти практические проблемы и помочь определить новые цели наркотиков.
Молекулярные механизмы развития сосудов хорошо сохраняются среди позвоночных, включая зебры(Danio rerio)7. Таким образом, принятие этой модели организма становится все более полезной механистической стратегии для изучения цереброваскулярных заболеваний8. Ряд моделей зебры были созданы, которые повторяют фенотипы, связанные с инсультом связанных условий9,10,11,12. Использование личинок зебры для исследования болезни патогенеза предлагает как практические, так и научные преимущества по сравнению с моделями млекопитающих8. Это включает в себя высокие показатели воспроизводства, быстрое развитие и прозрачность личинок, что позволяет для интравитентной визуализации без инвазивных ограничений, связанных с грызунами. Соединение этих преимуществ с широким спектром трансгенных линий репортера, доступных в рамках научно-исследовательского сообщества зебры, составляет мощный подход in vivo для изучения биологии болезней, еще не использованный для изучения патологических последствия ICH.
Ответ травмы на кровь в головном мозге является двухфамным13; первичное оскорбление вызывает гибель нейронов и некроз клеток, который затем инициирует вторичную волну повреждений, которая вызвана врожденной иммунной активацией. Вторая фаза черепно-мозговой травмы, в частности нейровоспалительный компонент, считается реалистичной мишенью для будущего лечения наркотиков13. Спонтанные и церебральных конкретных кровоизлияний были описаны в личинки зебры ранее14,15,16,17,18,19. Две такие модели являются использование аторвастатина (ATV) на 24 ч после оплодотворения (hpf) для ингибирования пути HMGCR и холестерина биосинтеза14, и пузырь (bbh) мутант, которые выражают гипоморфные мутации в гене arhgef7, и впоследствии ингибирует актин ремоделирования для плотных эндоваскулярных узлов18. Эти модели демонстрируют спонтанный разрыв мозгового сосуда в начале кровообращения (33 л.с.). В последнее время мы охарактеризовали эти модели далее, чтобы показать, что ключевые аспекты реакции травмы головного мозга сохраняется между людьми и личинки зебры20. Это исследование демонстрирует методологию, необходимую для получения и визуализации спонтанных кровоизлияний в мозг в личинки зебры и как количественно травмы головного мозга, а также локомотиви и нейровоспалительные фенотипы, которые относятся к человеческому состоянию. Эти данные и методы поддерживают использование этого модельного вида в качестве ценной дополнительной системы для доклинических исследований ICH.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1159px;" width="1160">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">24 well plates</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">CLS3527</td>
			<td style="width:441px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">28 &#176;C incubator</td>
			<td style="width:227px;">LMS</td>
			<td align="right" style="width:165px;">210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Atorvastatin</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">PZ0001-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Breeding boxes</td>
			<td style="width:227px;">Thoren Aquatics systems</td>
			<td align="right" style="width:165px;">10011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Daniovision observation chamber</td>
			<td style="width:227px;">Noldus</td>
			<td style="width:165px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">E3 medium 1x</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:165px;"></td>
			<td>4% Instant Ocean, 500 &#181;L methylene blue in 1 L dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">EthoVision XT software</td>
			<td style="width:227px;">Noldus</td>
			<td style="width:165px;">version 11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heat block</td>
			<td style="width:227px;">Grant-Bio</td>
			<td>PHMT-PSC18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Instant ocean</td>
			<td style="width:227px;">Instant Ocean</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Lightsheet microscope</td>
			<td style="width:227px;">Zeiss</td>
			<td style="width:165px;">Z.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lightsheet microscope mounting capillary</td>
			<td style="width:227px;">Zeiss</td>
			<td>402100-9320-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Low melt agarose</td>
			<td style="width:227px;">Promega</td>
			<td style="width:165px;">V2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Methylene Blue</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">319112-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Microscope&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Leica</td>
			<td style="width:165px;">MZ95</td>
			<td>dissection microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Microscope</td>
			<td style="width:227px;">Leica</td>
			<td>M165FC</td>
			<td>fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;">MS222</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td></td>
			<td>4g tricaine powder, 500 mL of dH2O, 10 mL of 1 M Tris (pH 9). Adjust pH to ~7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P1000 pipette</td>
			<td style="width:227px;">Gilson</td>
			<td>F144059M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">P1000 pipette tips</td>
			<td style="width:227px;">Starlab</td>
			<td style="width:165px;">S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pasteur pipettes</td>
			<td style="width:227px;">Starlab</td>
			<td style="width:165px;">E1414-0300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dishes&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Corning</td>
			<td style="width:165px;">101VR20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipetboy</td>
			<td style="width:227px;">Integra Biosciences</td>
			<td style="width:165px;">PIPETBOY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Stripette 25ml</td>
			<td style="width:227px;">Corning</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Tricaine powder</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">A5040-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Base</td>
			<td style="width:227px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:165px;">BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra fine dissection forceps</td>
			<td style="width:227px;">Agar scientific</td>
			<td style="width:165px;">AGT502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Zen software</td>
			<td style="width:227px;">Zeiss</td>
			<td style="width:165px;">version 2.3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using zebrafish larvae to study the pathological consequences of hemorrhagic stroke

Несмотря на то, что это самый тяжелый подтип инсульта с высокой глобальной смертностью, специфического лечения для пациентов с внутримозговым кровоизлиянием (Ich). Моделирование ICH до клинически оказалось трудным, и нынешние модели грызунов плохо резюмировать спонтанную природу человека ICH. Поэтому существует настоятельная необходимость в альтернативных доклинических методологиях для изучения механизмов заболевания в МКЗ и для потенциального открытия препарата.
Использование зебры представляет собой все более популярный подход к трансляционным исследованиям, в первую очередь из-за ряда преимуществ, которыми они обладают над моделями болезней млекопитающих, включая плодовитые показатели воспроизводства и прозрачность личинок, позволяющие жить изображения. Другие группы установили, что личинки зебры могут проявлять спонтанный ICH после генетического или химического нарушения цереброваскулярного развития. Цель этой методологии заключается в использовании таких моделей для изучения патологических последствий кровоизлияния в мозг, в контексте доклинических исследований ICH. С помощью живой визуализации и подвижности анализы, повреждение мозга, нейровоспаление и локомотивная функция после ICH могут быть оценены и количественно.
Это исследование показывает, что ключевые патологические последствия кровоизлияния в мозг у человека сохраняются в личинках зебры, подчеркивая модель организма как ценную систему in vivo для доклинического исследования ICH. Цель этой методологии заключается в том, чтобы дать возможность сообществу, доклиническим инсультам, использовать модель личинок зебры в качестве альтернативной дополнительной модели системы для грызунов.

Оценка гибели клеток мозга с помощью трансгенного убика. Кластеры отступают до 96 л.с. Благодаря анализу изображений кровотечение связано со значительным двукратным увеличением общей интенсивности флуоресцентного сигнала в головном мозге, что указывает на заметную гибель клеток.
Нейровоспалительный ответ идентифицируется в личинках Ich' значительно увеличенным числом mpeg1 положительных клеток макрофага в головном мозге. Число общего MPO положительных нейтрофильных клеток также увеличилось, однако это не достигло статистической значимости(Рисунок 4). Морфология mpeg1 положительных макрофагов также можно увидеть, чтобы изменить в личинки ICH, как клетки принимают активную, округлую, амебоидную форму. Эти активированные округлые клетки также могут контролироваться с течением времени, чтобы показать повышенную фагоцитарную реакцию убика,secAnnexinV-mVenus, выражающую умирающие клетки в личинках ICH (Рисунок 5). mpeg1 положительные макрофаги, демонстрирующие неразрежированные процессы, были классифицированы как неактивные.
Кровоизлияние в мозг связано со значительным снижением подвижности на 72 и 96 л.с. по сравнению с ICH-sibling управления в обоих bbh и ATV моделей(рисунок 6). Подвижность при 120 л.с. восстанавливается до почти базовых уровней. Есть часто различия в базовой подвижности между яйцеклетки и штаммов и поэтому сравнение должно быть сделано ich-контроля каждый раз.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig3.jpg"> Рисунок 3 - Внутримозговое кровоизлияние (Ich) в личинки зебры приводит к количественной травмы головного мозга. (A) Представитель изображения фенотипа черепно-мозговой травмы в личинки ICH (правые панели), по сравнению с ICH-братьев (левые панели), на 72 л.с. Яркие изображения (нижние панели, шкала бар 250 мкм) демонстрируют наличие мозговых кровотечений (стрелки) в личинки ICH. Флуоресцентная микроскопия была выполнена для визуализации клеточной смерти в ubiqлинии репортера secAnnexinV-mVenus (верхние панели, шкала бар 100 мкм). Кластеры умирающих клеток наблюдались в перигематомных регионах. Изображения были обрезаны в области мозга только и проанализированы для общей интенсивности зеленой флуоресценции в круглых частиц больше, чем 30 пикселей в диаметре (белая линия) с помощью макроса в дополнительномфайле 1 . (B) Количественная оценка сигнала флуоресценции в мозге необработанных, ich- и ICH, личинок, полученных через модель ATV (n 12 в группу; 3 независимых репликаций) при 72 л.с. Значительные различия наблюдались при сравнении С МХЗ с необработанными (зря 0,004) и с братьями и сестрами ICH- (ПЗ 0,03). (C) Количественная оценка сигнала флуоресценции как зачитывания для присоединения к приложению в мозге личинки и личинки ICH, полученные через модель bubblehead (bbh) (n - 12 в группу; 2 независимых репликации) при 72 л.с. Графики показывают SD из среднего. Значительная разница в флуоресценции мвенеры наблюдалась между МЗЗ и ICH-возрастных братьев и сестер (п. 0,002). Рисунок был воспроизведен с Crilly et al.20 с разрешения под лицензией Creative Commons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig4.jpg"> Рисунок 4 : Внутримозговое кровоизлияние (ICH) инициирует врожденный клеточный иммунный ответ в личиночном мозге зебры. Числа лейкоцитов, количественные в областях мозга, ранее описанных для mpo;GFP;mpeg1.dsRed двойные трансгенные личинки (n - 8 на группу; 2 независимых репликатора) при 72 л.с. показывает значительное увеличение макрофагов (п. 0,01), но не нейтрофилов (р) 0,5), в ответ на ICH. Рисунок был воспроизведен с Crilly et al.20 с разрешения под лицензией Creative Commons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a> 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig5.jpg"> Рисунок 5 : Активированные макрофагные клетки показывают фагоцитическую реакцию на повреждение мозга. (A) Представитель замедленного неподвижности20 показаны ramified патрулирования макрофаг мигрирует к annexinV положительной ячейки (i - vi). Кадры получены из серии изображений, сделанных всего мозга с помощью 20x цели. Шкала бар представляет 50 мкм. Макрофаг приобрел амебоидную морфологию (v) до фагоцитоза аннексииВ-позитивной клетки (vi, vii). После фагоцитоза макрофаг возобновляет разбушеванную морфологию и мигрирует, а аскинв-положительную клетку больше не видно (viii). Рамированный макрофаг (яп. ) — положительная клетка (стрелка), амебидный макрофаг( амебидный макрофаг. (B) Репрезентативные изображения mpeg1-положительныхклеток в личиночном мозге ICH- и ICH', демонстрирующих амебоид ные и перемешанные морфологии. Шкала баров представляют 50 мкм. (C) Повышенная доля амебоида (фагоцита) и снижение доли бродячих (неактивных) макрофагов наблюдалось в мозге ICH' по сравнению с ICH- братьев и сестер. Рисунок был воспроизведен с Crilly et al.20 с разрешения под лицензией Creative Commons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a> 
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig6.jpg"> Рисунок 6 : ICH-индуцированной черепно-мозговой травмы приводит к количественной дефицит локомотива в личинки зебры. (A) Представитель примеры плавательных треков в ICH- и ICH' bbh личинки на 72, 96 и 120 л.с. (B) личинки Ich' продемонстрировали значительное снижение совокупного времени, проведенного мобильным в течение 10 минут периода записи на 72 и 96 л.с. Значение было потеряно на 120 л.с. точки времени потенциально намекая на восстановление после черепно-мозговой травмы (n No 24 личинки на группу; 3 независимых репликации; »p - 0.00006; ю 0.003; ns. (C) Количественная оценка кумулятивного времени, затраченного на перемещение в необработанных и aTV-обработанных личинки ICH- и ICH' на 120 л.с. Личинки Ich' продемонстрировали значительное снижение совокупного времени, затраченного на мобильный телефон в течение 10 минут периода записи. Для расчета SD-из среднего значения были использованы три технических репликации (n no 24 личинки на группу) (no 24 личинки на группу). Рисунок был воспроизведен с Crilly et al.20 с разрешения под лицензией Creative Commons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a> 
Дополнительный файл 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/Supplementary_File_1-Macro.docx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using Zebrafish Larvae to Study the Pathological Consequences of Hemorrhagic Stroke at JoVE.com

Using Zebrafish Larvae to Study the Pathological Consequences of Hemorrhagic Stroke

Здесь мы представляем протокол для количественной оценки черепно-мозговой травмы, локомотивных дефицитов и нейровоспаления после кровотечения в мозге в личинки зебры, в контексте внутримозгового кровоизлияния человека (ICH).

Использование larvae зебрафиш для изучения патологических последствий геморрагического инсульта

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage ...

Этот метод обеспечивает бесплатный доклинический подход для изучения немедленной клеточной реакции на кровь в головном мозге после геморрагического инсульта, очень серьезное состояние, для которого у нас нет конкретных лекарств для пациентов. В отличие от моделей грызунов, прозрачность личинок зебры позволяет наблюдать клеточные реакции в мозге живых нетронутых животных в режиме реального времени с помощью флуоресцентной микроскопии. Для начала используйте чайный ситечко для сбора всех оплодотворенных эмбрионов от естественного нереста в племенных коробках, произведенных из одного самца и от одного до двух взрослых зебр.Перенесите 100 эмбрионов в каждую чашку Петри, содержащую стандартную среду эмбриона Е3. Инкубация при 28 градусах по Цельсию и этап в соответствии со стандартными руководящими принципами. В шесть часов после оплодотворения, удалить мертвые и неудобренные эмбрионы из блюда с помощью пастер пипетки и положить посуду обратно в инкубатор.В течение 24 часов после оплодотворения, под стерео микроскопом яркого поля, используйте острые ультратонкие миппы вскрытия для декорации эмбрионов для лечения аторвастатина. Затем добавьте 30 миллилитров эмбриона E3 среднего до двух чистых блюд Петри, один для лечения, а другой для контроля. Удалить 60 микролитров воды эмбриона из лечения блюдо и добавить 60 микролитров 0,5 миллимолярный аторвастатин для достижения 80% личинок кровоизлияния.Используя пипетку Pasteur, перенесите 100 эмбрионов в как можно меньше воды к каждому блюду. Инкубировать два блюда при 28 градусах по Цельсию. В любое время после 50 часов после оплодотворения, под микроскопом используйте пипетку Pasteur, чтобы тщательно отделить кровоизлияние рыбы от неморрагивных популяций и перенести личинки на новые блюда, содержащие свежие средства массовой информации E3.Чтобы облегчить отделить кровоизлияние положительных личинок, можно использовать рыбу без пигмента или рыбы, которые выражают флуоресцентный белок в красных кровяных телец. На третий день под флуоресцентным микроскопом экран личинки обеспечивают экспрессию флуоресцентного белка. Затем заполните световую камеру монтажа листа с E3 сми, содержащей 0,2%MS-222 для анестезии.Используя трубу Pasteur, перенесите одну каплю, содержащую от одной до шести личинок, на сухую поверхность чашки Петри для монтажа. Используйте пипетку, чтобы удалить как можно больше жидкости. Добавить падение 1,5%низкий расплава агарозы от 45 градусов по Цельсию тепловой блок для личинок и использовать 800 микрометров монтажа капилляров, чтобы привлечь личинок вверх головой в первую очередь.Если позиционирование не является точным, изгнать личинки из агарозы и смонтировать снова. Оставьте капилляр остыть, а затем вставьте в камеру светлого листа. На программное обеспечение для визуализации ЗЕН, нажмите непрерывно, чтобы сориентировать личинки и нажмите приобрести приобрести z-стек изображения головы между линзами глаз.В вкладке обработки создайте изображение проекции максимальной интенсивности из каждого z-стека. Чтобы случайным образом выбрать для анализа подвижности, перенесите 24 личинки после анестезии в свежие средства массовой информации E3 и позвольте животным оправиться от анестезии. После того, как личинки полностью оправились от анестезии, используя пипетки с конца вырезать передачи восстановленных личинок в E3 среды без метиленового синего.Плита одна личинка в один миллилитр на колодец 24 хорошо пластины. Загрузите пластину в камеру камеры. В программном обеспечении отслеживания EthoVision XT отрегулируйте настройки эксперимента, чтобы настроить режим белого света, чтобы увеличить спонтанное плавание и движение анализа в течение 10 минут.Повторите анализ передвижения в 96 и 120 часов после оплодотворения. Оценка смерти клеток головного мозга с помощью трансгенного убиквитина, секретированная венозной линией репортера Annexin V M, приводит к тому, что явные скопления умирающих клеток в кровоизлияниях личинок, которые отсутствуют во всех неморрагальных личинках, показанных зелеными флуоресценциями, свидетельствуют о наличии кровотечений в головном мозге. Умирающие клетки наблюдались как в моделях аторвастатина, так и в моделях головок пузырьков для кровоизлияния личинок.Морфология MPEG1 положительные макрофаги изменения во внутримозговых кровоизлияния положительных личинок, как клетки принимают в активной округлой форме амебоидов. Эти активированные округлые клетки были проверены с течением времени, чтобы показать повышенную фагоцитическую реакцию убиквитина, секретного Annexin V M венозного выражения умирающих клеток во внутримозговых кровоизлияниях положительных личинок. Кровоизлияние в мозг связано со значительным снижением подвижности на 72 и 96 часов после оплодотворения по сравнению с внутримозгового кровоизлияния отрицательный контроль брата и сестры.Подвижность в 120 часов после оплодотворения восстанавливается почти до базового уровня. Наиболее важным аспектом этой процедуры является обязательно тщательно изучить личинки на наличие или отсутствие кровоизлияний в мозг, прежде чем приступить к фенотипирование анализов. Эта модель также может быть использована для скрининга наркотиков, чтобы определить, если фенотип тяжести может быть улучшена после кровотечения, подход, который может привести нас к выявлению новых кандидатов наркотиков в будущем.Этот метод позволяет нам исследовать клеточные реакции сразу после кровотечения в мозге в течение точки времени, которая была так печально известно трудно изучить до сих пор. Хотя ни один из реагентов или инструментов, описанных в этом протоколе, не является особо опасным, стандартная осторожность и меры предосторожности должны приниматься во время использования химических веществ, острых или лазеров.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Визуализация проприорецепторов в<em&gt; Drosophila</em&gt; Личинки и куколки

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Свет Анализ предпочтений по изучению врожденных и суточного Регулируемые Photobehavior в<em&gt; Drosophila</em&gt; Личинки

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

Автоматизированная Высокая пропускная Поведенческий анализ в личинки данио

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

Выводя на динамику Глутамат зазор Деконволюция Анализ астроцитов Токи Transporter

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

Электроретинограммы Анализ визуальной ответ в данио рерио Личинки

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

Utilizing 3D Printing Technology to Merge MRI with Histology: A Protocol for Brain Sectioning

Используя технологию 3D печати для слияния с МРТ гистологии: Протокол для мозга Секционирование

Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Зависящее от времени увеличение ответа сети на стимуляцию нейронных клеточных культур на микроэлектродных массивах

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

Аблация нейрональных населения с помощью двух Фотон лазера и его оценки с использованием изображений кальция и поведенческих запись в Zebrafish личинки

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

Визуализация in vivo полностью активной мозговой ткани у бодрствующих личинок рыбок данио и молоди путем удаления черепа и кожи

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...