Name: using zebrafish larvae to study the pathological consequences of hemorrhagic stroke
Uploaded: 2019-06-05T15:00:00
Duration: 6 min 36 s
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Nos gustaría agradecer al Dr. David Spiller y al centro de microscopía de sistemas de la Universidad de Manchester por el uso de los equipos, el Prof. Richard Baines para el uso de DanioVision y el Dr. Jack Rivers-auty para la consulta estadística. La línea BBH fue amablemente compartida por Nicole Munsie del laboratorio del Dr. Sarah Child en la Universidad de Calgary. También agradecemos al Prof. Stephen Renshaw, al Dr. Adam Hurlstone, al Dr. Andrew Badrock y al Dr. Helen Young por sus líneas de pescado y equipo.
Este estudio fue apoyado por la NC3Rs (NC/N002598/1), la Asociación de accidentes cerebrovasculares (TSA 2017/02), la ERA-NET NEURRON (MR/M501803/1) y la Fundación británica del corazón (FS/15/67/32038). También estamos particularmente agradecidos con la Natalie Kate Moss Trust y la Facultad de biología, medicina y salud de la Universidad de Mánchester por su continuo apoyo financiero.

Los peces zebrafish fueron criados y mantenidos en la unidad de servicios biológicos de la Universidad de Manchester en condiciones estándar como se describió anteriormente21. La cría de pez cebra adulta fue aprobada por la Junta de revisión ética y bienestar animal de la Universidad de Manchester. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las regulaciones del Home Office del Reino Unido (PPL: P132EB6D7).
Nota: las líneas transgénicas utilizadas en este estudio incluyen el linaje específico de los macrófagos MPEG1:mcherry (construido en la casa como se describió anteriormente como22), MPO específico de neutrófilos :GFP23,GATA1 específico de erythroid: DsRED24 y UBIQ:secanexinv-mvenus, un reportero para la muerte celular (rederivado en la casa25)en fondos de tipo salvaje, nácar (mitfaW2/W2) y mutante (BBHM292). La figura 1 muestra la cronología experimental.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> Figura 1 : Gráfico de cronología experimental para caracterizar la lesión cerebral, el locomotriz y los resultados neuroinflamatorios. ICH, hemorragia intracerebral; BBH, bubblehead. Figura se ha reproducido de Crilly et al.20 con permiso bajo una licencia Creative Commons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 
1. día 0: producción y recogida de huevos
<ol><li>Recolectar embriones fecundados de desove natural en cajas de cría producidas a partir de 1 macho y 1-2 de pez cebra hembra adulta. Nota: para el protocolo de atorvastatina se pueden utilizar animales silvestres/transgénicos sin embargo las tasas de hemorragia difieren ligeramente entre las cepas.</li>
	<li>Incubar 100 embriones a 28 ° c en medio del embrión estándar E3 por placa de Petri y etapa de acuerdo con las pautas estándar26.</li>
	<li>A ~ 6 horas después de la fertilización (HPF) eliminar los embriones muertos y no fertilizados del plato usando una pija Pasteur.</li>
</ol>2. día 1: tratamiento con atorvastatina a 24 HPF
<ol><li>Los embriones de dechorionate para el tratamiento con atorvastatina utilizan fórceps de disección ultra delgada y afilada27. Los números requeridos para la experimentación se pueden ajustar en consecuencia.</li>
	<li>Añadir 30 mL de medio embrión E3 a dos placas de Petri limpias. Utilice un plato para 100 embriones. Nota: si las placas están diseñadas para el cultivo celular, el pez cebra dechorionated en esta etapa temprana a menudo se adhieren a la parte inferior. Para evitarlo, enjuague bien las placas en agua limpia antes de usarlas.</li>
	<li>Remover 60 μL de agua del embrión de la placa de tratamiento y añadir 60 μL de 0,5 mM atorvastatina (ATV). En una concentración de stock de 0,5 mM, la dilución anterior resultará en una concentración final de 1 μM que resultará en ~ 20% de las larvas no hemorrágicas (ICH-) y ~ 80% de las larvas hemorrágicas (ICH +). Utilice la otra placa para los controles no tratados Nota: atorvastatina se solubiliza en agua destilada (3 mg en 10 mL) para hacer una solución en stock de 0,5 mM. Incubar durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad con agitación como la solubilización lleva algún tiempo. La solubilización completa puede tardar hasta 1 semana. No utilice DMSO. La solución es alicitada y almacenada a-20 ° c. No congele el deshielo.</li>
	<li>Utilizando una Piera Pasteur, transfiera 100 embriones en el menor agua posible a las placas de tratamiento.</li>
	<li>Incubar las planchas a 28 ° c. Nota: ICH ocurrirá entre 33 y 48 HPF. Atorvastatina no necesita ser removido ya que la incubación de más de 24 h no causa ningún problema de desarrollo adicional.</li>
</ol>3. día 2: separación de las poblaciones de ICH y ICH + en 50 HPF
<ol><li>Separe el pescado ICH + de las poblaciones ICH y transfiera a nuevos platos para mayor facilidad.<ol>
<li>Si se utiliza el modelo de ATV a una concentración de 1 μM, el 75-100% de las larvas exhibirá hemorragia (ICH +) en este momento. Nota: la respuesta de las larvas difiere entre las cepas, si las larvas no son hemorrágicas en las frecuencias deseadas, utilizar un lote fresco de atorvastatina o una concentración más alta. Si las larvas no han exhibido hemorragia por 48 HPF entonces considéralos ICH-.</li>
		<li>Si se utiliza el modelo BBH, todos los mutantes homocigosos exhibirán hemorragia por 48 HPF. Si se utiliza un incross heterocigoso, los hermanos ICH-heterocigotos y wildtype pueden utilizarse como animales de control para experimentos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Si es necesario, anestesiar las larvas añadiendo 0,02% MS222 a los medios E3. Usando una Piera Pasteur, ordene las larvas para la presencia de sangre en la cabeza en los nuevos medios E3. Vea la figura 2. Nota: la sangre en la cabeza puede aparecer en el frente, en la mitad o en el cerebro posterior o en combinación, y el volumen de sangrado puede variar entre los animales. En los mutantes BBH, el ICH se asocia a menudo con un edema severo reconocible por cabezas más grandes, un espacio más amplio entre los ojos y un sangrado más difuso. Sin embargo, no todas las larvas de ICH + BBH exhiben edema.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig2.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> Figura 2 : ICH + fenotipos de hemorragia cerebral. Ejemplos de fenotipos de la larval ICH mantenidos en una GATA1 transgénica: el fondo nácar de reportero DsRED observó con un estereomicroscopio de campo claro (paneles superiores) y fluorescencia (panel inferior) a ~ 48 h después de la fertilización. No se observaron hemorragias en las larvas ICH (paneles izquierdo). Se observó una acumulación diferenciada de glóbulos rojos en el prosencéfalo y el cerebro posterior (flechas) en las larvas de ICH + (paneles de la derecha). Las barras de escala representan 250 μm. figura se ha reproducido de Crilly et al.20 con permiso bajo una licencia Creative Commons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 
4. día 3: muerte celular y análisis de leucocitos a 72 HPF
<ol><li>La pantalla de las larvas utilizando un microscopio de fluorescencia para asegurar la expresión de la proteína fluorescente. Nota: en este estudio, UBIQtransgénico: larvas secanexinv-mvenus se utilizaron para reportar la muerte celular del cerebro y doble MPOtransgénico: GFP; MPEG1: mcherry o UBIQ: Secanexinv-mvenus; MPEG1: mcherry utilizado para análisis de leucocitos.</li>
	<li>Llene la cámara de montaje de la hoja de luz con medios E3 que contengan 0,02% MS222.</li>
	<li>Anestesiar las larvas con un 0,02% de MS222. Transferir las larvas para el montaje (n = 1-6) a una superficie de placa Petri seca en una sola gota. Retire tanto líquido como sea posible. Nota: el 1,5% de agarosa de baja fundición se prepara utilizando 0,15 g de agarosa de baja fusión disuelto en 10 ml de medio E3 sin azul de metileno en un microondas y mantenido a 45 ° c hasta su uso.</li>
	<li>Añadir una gota de 1,5% de agarosa de baja fusión (mantenida como líquido en un bloque de calor de 45 ° c) a las larvas y usando un capilar de montaje de 800 μm, y dibujar las larvas arriba de la cabeza primero. Si el posicionamiento no es preciso, las larvas pueden ser expulsadas de la agarosa y montadas de nuevo. Dejar enfriar el capilar antes de insertarlo en la cámara de la hoja de luz. Nota: alternativamente, se podría utilizar un microscopio confocal para este procedimiento. Para ello, las larvas se deben montar lateralmente en agarosa sobre un plato de fondo de vidrio.</li>
	<li>Adquiera imágenes de pila z de la cabeza entre las lentes oculares (~ 300 μm) y procese la imagen de proyección de intensidad máxima.<ol>
<li>Analice la región del cerebro a partir de imágenes recopiladas para el número total de células fluorescentes y fluorescencia de intensidad total20.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cree un vídeo de lapso de tiempo de múltiples compuestos de proyección de más de 18-24 h para rastrear la movilidad de los leucocitos y la interacción con las células moribundas. Nota: si se realiza una imagen en vivo a largo plazo, solo se monta una larva en el capilar.</li>
	<li>Cuando la toma de imágenes se completa expulsar las larvas del capilar de montaje en una sobredosis letal de 4% MS222 a eutanasia.</li>
</ol>5. día 3: selección de larvas para ensayo de motilidad a 72 HPF
<ol><li>Anestesiar larvas en las placas de Petri con un 0,02% de MS222.</li>
	<li>Seleccione aleatoriamente n = 24 larvas para el ensayo de motilidad y transfiera a medios nuevos E3 y permita que los animales se recuperen de la anestesia. Nota: la anestesia en este punto elimina el sesgo de selección para los nadadores lentos que son fáciles de atrapar.</li>
</ol>6. día 3-5: locomoción de Assaying en 72, 96 y 120 HPF
<ol><li>Transfiera las larvas seleccionadas a 72 HPF en el medio E3 sin azul de metileno. Nota: para la agresión a 3 DPF permite que las larvas tengan tiempo suficiente para recuperarse de la anestesia (> 1 h).</li>
	<li>Placa una larva en 1 mL por pozo de una placa de 24-Well usando una picada. Nota: corte el extremo de la punta de la Piera para evitar dañar las larvas. El tamaño de la placa se puede cambiar según el diseño experimental.</li>
	<li>Cargue las placas en la cámara y el movimiento del ensayo durante 10 minutos con una rutina de luz blanca para aumentar la natación espontánea. Nota: el comportamiento de natación fue rastreado usando una cámara de cámaras y un software de rastreo (ver la tabla de materiales).</li>
	<li>Repite el experimento con las mismas larvas en 96 y 120 HPF. Desplazar las larvas de la carcasa individual en la placa de ensayo a una bandeja de Petri e incubar a 28 ° c entre ensayos.</li>
	<li>En la terminación del ensayo, eutanasia larvas en una sobredosis letal de 4% MS222.</li>
</ol>

<ol>
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Los autores no tienen nada que revelar.

Este estudio muestra que el ICH en larvas de pez cebra induce una respuesta de lesión cerebral que recapitula aspectos clave de la condición humana que pueden ser sistemáticamente asaltado y cuantificado. El pez cebra ofrece un modelo consistente y reproducible de ICH espontáneo que ayudará con futuros estudios de intervención de fármacos enfocados en atacar lesiones cerebrales inducidas por la sangre, en lugar de prevenir la rotura del recipiente17,28. De hecho, dada la rápida naturaleza del inicio de la enfermedad similar a la situación clínica, este enfoque ofrece perspectivas emocionantes para una traducción exitosa en el futuro.
Algunas limitaciones están asociadas con el uso de larvas de pez cebra, tales como el uso de un sistema en desarrollo y el rango taxonómico, sin embargo, las ventajas prácticas y científicas de este modelo deben ser consideradas para ofrecer nuevas perspectivas en el ICH. No se requiere cirugía para iniciar una hemorragia o para monitorear los procesos celulares durante períodos prolongados de tiempo después de la lesión. La alta fecundez de los emparejamientos de pez cebra genera tamaños de muestra fácilmente accesibles y grandes, y debido al rápido desarrollo de las larvas, la cronología experimental se reduce significativamente en comparación con los estudios de roedores29,30.
Actualmente estos modelos son aptos para la eluciación de la respuesta patológica e inmunológica inmediata al ICH espontáneo en el cerebro de animales vivos intactos. Potencialmente, este modelo puede ser adaptado para las pantallas de fármacos de medio-alto rendimiento para las terapias ICH, ya sea preventivo o promoción de la recuperación. Como tal, las patologías post-ICH presentadas en este estudio representan una alternativa, plataforma complementaria para la investigación pre-clínica ICH.

La hemorragia intracerebral (ICH) es el subtipo más grave de accidente cerebrovascular asociado con la ruptura espontánea del vaso cerebral y el sangrado en el parénquima que conduce al daño cerebral, la discapacidad física y, a menudo, la muerte1. A pesar de la elevada tasa de mortalidad y morbilidad asociada al ICH2, todavía falta la comprensión de la etiología subyacente y la patología posterior a la hemorragia. Como tal, no hay tratamientos específicos para prevenir el ICH o mejorar los resultados del paciente. La mayor parte de nuestra comprensión de la biología de las enfermedades proviene de modelos de roedores pre-clínicos de ICH3, sin embargo los estudios hasta la fecha en estos modelos no han logrado traducir ningún terapéutico exitoso a la clínica4,5. Este fracaso puede deberse en parte a algunas limitaciones de estos modelos preclínicos, incluyendo la incapacidad de recapitular fácilmente la naturaleza espontánea de la enfermedad humana y el requerimiento de cirugía invasiva para generar los modelos en los mamíferos6. Además, los roedores plantean problemas prácticos con respecto a observar el rápido inicio de las respuestas celulares al ICH en el tejido intacto. Dada la falta de traducción de los modelos de roedores, es imperativo desarrollar modelos alternativos de ICH espontáneo si queremos superar estos problemas prácticos y ayudar a identificar nuevos objetivos de drogas.
Los mecanismos moleculares del desarrollo vascular están bien conservados entre los vertebrados, incluido el pez cebra (Danio rerio)7. Como tal, la adopción de este modelo de organismo se está convirtiendo en una estrategia mecanicista cada vez más útil para el estudio de la enfermedad cerebrovascular8. Se han generado varios modelos de pez cebra que recapitulan los fenotipos asociados A las condiciones9,10,11y12relacionadas con el accidente cerebrovascular. El uso de larvas de pez cebra para investigar la patogénesis de la enfermedad ofrece ventajas prácticas y científicas sobre los modelos de mamíferos8. Esto incluye altas tasas de reproducción, desarrollo rápido y transparencia larvaria que permite la imagen intravital sin las restricciones invasivas asociadas con los roedores. El acoplamiento de estas ventajas con la amplia gama de líneas reporteras transgénicas disponibles dentro de la comunidad de investigación del pez cebra equivale a un potente enfoque in vivo para estudiar la biología de la enfermedad, que aún no se utiliza para estudiar el consecuencias del ICH.
La respuesta de la lesión a la sangre en el cerebro es bifásica13; el insulto primario causa muerte neuronal y necrosis celular, que luego inicia una onda secundaria de daño que es inducida por la activación inmune innata. La segunda fase de la lesión cerebral, en particular el componente neuroinflamatorio, se considera un objetivo realista para el tratamiento futuro de drogas13. Se han descrito hemorragias espontáneas y específicas cerebrales en las larvas del pez cebra anteriormente14,15,16,17,18,19. Dos de estos modelos son el uso de atorvastatina (ATV) a 24 h post-fertilización (HPF) para inhibir la vía HMGCR y la biosíntesis de colesterol14, y un mutante bubblehead (BBH) que expresan una mutación hipomórfica en el gen arhgef7 , βpix, y posteriormente inhibe la remodelación de actina para uniones endovasculares estrechas18. Estos modelos exhiben ruptura espontánea de vasos sanguíneos cerebrales específicos en el inicio de la circulación (~ 33 HPF). Recientemente, hemos caracterizado a estos modelos aún más para revelar que los aspectos clave de la respuesta a la lesión cerebral se conservan entre los seres humanos y las larvas de pez cebra20. Este estudio demuestra la metodología necesaria para obtener y visualizar las hemorragias cerebrales espontáneas en larvas de pez cebra y cómo cuantificar la lesión cerebral, y los fenotipos locomotores y neuroinflamatorios que se relacionan con la condición humana. Estos datos y técnicas apoyan el uso de esta especie modelo como un valioso sistema complementario para la investigación pre-clínica ICH.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1159px;" width="1160">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">24 well plates</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">CLS3527</td>
			<td style="width:441px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">28 &#176;C incubator</td>
			<td style="width:227px;">LMS</td>
			<td align="right" style="width:165px;">210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Atorvastatin</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">PZ0001-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Breeding boxes</td>
			<td style="width:227px;">Thoren Aquatics systems</td>
			<td align="right" style="width:165px;">10011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Daniovision observation chamber</td>
			<td style="width:227px;">Noldus</td>
			<td style="width:165px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">E3 medium 1x</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:165px;"></td>
			<td>4% Instant Ocean, 500 &#181;L methylene blue in 1 L dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">EthoVision XT software</td>
			<td style="width:227px;">Noldus</td>
			<td style="width:165px;">version 11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heat block</td>
			<td style="width:227px;">Grant-Bio</td>
			<td>PHMT-PSC18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Instant ocean</td>
			<td style="width:227px;">Instant Ocean</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Lightsheet microscope</td>
			<td style="width:227px;">Zeiss</td>
			<td style="width:165px;">Z.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lightsheet microscope mounting capillary</td>
			<td style="width:227px;">Zeiss</td>
			<td>402100-9320-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Low melt agarose</td>
			<td style="width:227px;">Promega</td>
			<td style="width:165px;">V2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Methylene Blue</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">319112-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Microscope&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Leica</td>
			<td style="width:165px;">MZ95</td>
			<td>dissection microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Microscope</td>
			<td style="width:227px;">Leica</td>
			<td>M165FC</td>
			<td>fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;">MS222</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td></td>
			<td>4g tricaine powder, 500 mL of dH2O, 10 mL of 1 M Tris (pH 9). Adjust pH to ~7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P1000 pipette</td>
			<td style="width:227px;">Gilson</td>
			<td>F144059M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">P1000 pipette tips</td>
			<td style="width:227px;">Starlab</td>
			<td style="width:165px;">S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pasteur pipettes</td>
			<td style="width:227px;">Starlab</td>
			<td style="width:165px;">E1414-0300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dishes&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Corning</td>
			<td style="width:165px;">101VR20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipetboy</td>
			<td style="width:227px;">Integra Biosciences</td>
			<td style="width:165px;">PIPETBOY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Stripette 25ml</td>
			<td style="width:227px;">Corning</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Tricaine powder</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">A5040-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Base</td>
			<td style="width:227px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:165px;">BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra fine dissection forceps</td>
			<td style="width:227px;">Agar scientific</td>
			<td style="width:165px;">AGT502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Zen software</td>
			<td style="width:227px;">Zeiss</td>
			<td style="width:165px;">version 2.3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using zebrafish larvae to study the pathological consequences of hemorrhagic stroke

A pesar de ser el subtipo más severo de accidente cerebrovascular con una alta mortalidad global, no existe un tratamiento específico para los pacientes con hemorragia intracerebral (ICH). La modelización de ICH ha demostrado ser difícil y los modelos actuales de roedores no recapitulan la naturaleza espontánea del ICH humano. Por lo tanto, existe un requisito urgente para las metodologías preclínicos alternativas para el estudio de los mecanismos de la enfermedad en el ICH y para el potencial descubrimiento de fármacos.
El uso de pez cebra representa un enfoque cada vez más popular para la investigación traslacional, principalmente debido a una serie de ventajas que poseen sobre los modelos de enfermedad de mamíferos, incluyendo las tasas de reproducción prolíficas y la transparencia larval que permite vivir Imagen. Otros grupos han establecido que las larvas de pez cebra pueden exhibir la ICH espontánea tras una alteración genética o química del desarrollo cerebrovascular. El objetivo de esta metodología es utilizar estos modelos para estudiar las consecuencias patológicas de la hemorragia cerebral, en el contexto de la investigación pre-clínica ICH. Mediante el uso de imágenes en vivo y ensayos de motilidad, se puede evaluar y cuantificar el daño cerebral, la neuroinflamación y la función locomotriz después del ICH.
Este estudio muestra que las consecuencias patológicas clave de la hemorragia cerebral en humanos se conservan en larvas de pez cebra destacando el organismo modelo como un valioso sistema in vivo para la investigación preclínica del ICH. El objetivo de esta metodología es permitir que la comunidad de accidentes cerebrovasculares preclínicos emplee el modelo larval de pez cebra como un sistema de modelo complementario alternativo a los roedores.

Evaluación de la muerte de la célula cerebral mediante UBIQtransgénico: secanexinv-mvenus da lugar a racimos definitivos claros de células moribundas en larvas de ICH + en modelos de ATV y BBH que están ausentes en todas las larvas de ICH (figura 3). Los racimos retroceden antes de 96 HPF. A través del análisis de la imagen, el sangrado se asocia con un aumento significativo de dos veces en la intensidad total de la señal de fluorescencia en el cerebro, indicando la muerte celular marcada.
Una respuesta Neuroinflamatoria se identifica en las larvas de ICH + por un número significativamente mayor de células de macrófagos MPEG1 positivas en el cerebro. El número total de células de neutrófilos positivas MPO también aumentó sin embargo esto no llegó a significancia estadística (figura 4). La morfología de los macrófagos MPEG1 positivos también se puede ver para cambiar en las larvas ICH + como las células adoptan una forma activa, redondeada, ameboide. Estas células redondeadas activadas también se pueden monitorizar con el tiempo para mostrar una mayor respuesta fagocitaria del UBIQ:secanexinv-mvenus que expresa células moribundas en larvas de ICH + (figura 5). los macrófagos MPEG1 positivos que exhiben procesos ramificados se clasificaron como inactivos.
La hemorragia cerebral se asocia con una disminución significativa de la motilidad a 72 y 96 HPF en comparación con los controles ICH-hermanos en los modelos BBH y ATV (figura 6). La motilidad a 120 HPF se recupera hasta niveles basales cercanos. A menudo hay diferencias en la motilidad basal entre los embragues de huevo y las cepas y por lo tanto la comparación debe hacerse a ICH-Controls cada vez.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig3.jpg"> Figura 3 : Hemorragia intracerebral (ICH) en larvas de pez cebra produce una lesión cerebral cuantificable. (A) imágenes representativas del fenotipo de lesión cerebral en larvas ICH + (paneles de la derecha), en comparación con ICH-hermanos (paneles izquierdo), a 72 HPF. Las imágenes de campo claro (paneles inferiores, barra de escala = 250 μm) demuestran la presencia de hemorragias cerebrales (flechas) en las larvas de ICH +. La microscopía fluorescente se realizó para visualizar la muerte celular en la línea de reportera UBIQ:secanexinv-mvenus (paneles superiores, barra de escala = 100 μm). Se observaron racimos de células moribundas en regiones perihematomales. Las imágenes se recortaron a regiones sólo cerebrales y se analizaron para la intensidad total de fluorescencia verde en partículas redondas de más de 30 píxeles de diámetro (línea blanca) utilizando la macro en el archivo suplementario 1. (B) cuantificación de la señal de fluorescencia en el cerebro de las larvas no tratadas, ICH-y ICH + obtenidas a través del modelo ATV (n = 12 por grupo; 3 réplicas independientes) a 72 HPF. Se observaron diferencias significativas al comparar ICH + con no tratados (* * p = 0,004) y con los hermanos ICH-(* p = 0,03). (C) cuantificación de la señal de fluorescencia como una lectura para anexión de la Unión en el cerebro de las larvas ICH-y ICH + obtenidas a través del modelo bubblehead (BBH) (n = 12 por grupo; 2 réplicas independientes) a 72 HPF. Gráficos muestran SD de la media. Se observó una diferencia significativa en la fluorescencia de mVenus entre los hermanos ICH + y ICH-adaptado A la edad (* * p = 0,002). Figura se ha reproducido de Crilly et al.20 con permiso bajo una licencia Creative Commons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig4.jpg"> Figura 4 : La hemorragia intracerebral (ICH) inicia una respuesta inmune celular innata en el cerebro larval del pez cebra. Número de leucocitos cuantificados dentro de las regiones cerebrales descritas anteriormente para MPO: GFP; MPEG1: las larvas transgénicas dobles de dsRed (n = 8 por grupo; 2 réplicas independientes) a 72 HPF revelan un aumento significativo en los macrófagos (* p = 0,01), pero no neutrófilos (p = 0,5), en respuesta al ICH. Figura se ha reproducido de Crilly et al.20 con permiso bajo una licencia Creative Commons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig5.jpg"> Figura 5 : Las células de macrófagos activados muestran una respuesta fagocitaria a la lesión cerebral. (A) alambiques representativos de lapso de tiempo20 que muestren un macrófago de patrullaje ramificado migrando hacia una célula positiva anexada (i-vi). Los alambiques se obtienen de una serie de imágenes tomadas de todo el cerebro usando un objetivo de 20x. Barra de escala representa 50 μm. El macrófago adquirió una morfología ameboide (v) antes de phagocitosing la célula anexial-positivo (VI, VII). Después de la fagocitosis, el macrófago reanuda una morfología ramificada y migra hacia fuera y ya no se puede ver la célula anexial positiva (VIII). Macrófagos ramificados (#), anexion célula positiva (flecha), macrófagos ameboides (*) están indicados. (B) imágenes representativas de células positivas MPEG1en el cerebro larval ICH-e ICH +, que exhiben morfologías ameboides y de ramificaciones ramificadas. Las barras de escala representan 50 μm. (C) se observó un aumento de la proporción de ameboides (fagocitosis) y disminución de la proporción de macrófagos ramificados (inactivos) en los cerebros de ICH + en comparación con los hermanos ICH. Figura se ha reproducido de Crilly et al.20 con permiso bajo una licencia Creative Commons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig6.jpg"> Figura 6 : La lesión cerebral inducida por ICH resulta en un déficit locomotriz cuantificable en larvas de pez cebra. (A) ejemplos representativos de las pistas de natación en larvas ICH-e ICH + bbh en 72, 96 y 120 HPF. (B) ICH + larva exhibió una disminución significativa en el tiempo acumulado gastado en el móvil durante el período de grabación de 10 min en 72 y 96 HPF. El significado se perdió en el punto de tiempo de 120 HPF potencialmente aludiendo a la recuperación de la lesión cerebral (n = 24 larvas por grupo; 3 réplicas independientes; * * * * p = 0,00006; * * p = 0,003; NS: p = 0,08). (C) cuantificación del tiempo acumulado empleado en el movimiento en larvas de ICH-e ICH + tratadas en ATV y sin tratar a 120 HPF. Las larvas de ICH + mostraron una disminución significativa en el tiempo acumulado gastado en el móvil durante el período de grabación de 10 minutos. Se utilizaron tres réplicas técnicas (n = 24 larvas por grupo) para calcular SD a partir de la media (* * * p = 0,00004, * * p = 0,0003). Figura se ha reproducido de Crilly et al.20 con permiso bajo una licencia Creative Commons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig6large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 
Archivo suplementario 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/Supplementary_File_1-Macro.docx" target="_blank">Por favor haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Using Zebrafish Larvae to Study the Pathological Consequences of Hemorrhagic Stroke

Aquí presentamos un protocolo para cuantificar la lesión cerebral, los déficits locomotores y la neuroinflamación después del sangrado en el cerebro en larvas de pez cebra, en el contexto de hemorragia intracerebral humana (ICH).

El uso de larvas de pez cebra para estudiar las consecuencias patológicas de accidente cerebrovascular hemorrágico

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage ...

Este método proporciona un enfoque preclínica gratuito para estudiar la respuesta celular inmediata a la sangre en el cerebro después de un accidente cerebrovascular hemorrágico, una condición muy grave para la cual no tenemos medicamentos específicos disponibles para los pacientes. A diferencia de los modelos de roedores, la transparencia de las larvas de pez cebra nos permite observar las respuestas celulares dentro del cerebro de animales vivos intactos en tiempo real utilizando microscopía fluorescente. Para comenzar, utilice un colador de té para recoger todos los embriones fertilizados del desove natural en cajas de reproducción producidas a partir de un macho y de una a dos hembras de peces cebra adultos.Transfiera 100 embriones a cada plato Petri que contenga el medio embrionario E3 estándar. Incubar a 28 grados centígrados y escenificar de acuerdo con las pautas estándar. A las seis horas después de la fertilización, retire los embriones muertos y no fecundados del plato con una pipeta Pasteur y vuelva a colocar los platos en la incubadora.A las 24 horas después de la fertilización, bajo un microscopio estéreo de campo brillante, utilice fórceps de disección ultradelgadas afiladas para decorionar embriones para el tratamiento con atorvastatina. A continuación, añadir 30 mililitros de medio embrionario E3 a dos platos Limpios de Petri, uno para el tratamiento y el otro para el control. Retire 60 microlitros de agua embrionaria de la placa de tratamiento y agregue 60 microlitros de 0,5 mililitrolas de atorvastatina para lograr el 80% de la hemorragia de larvas.Con una pipeta Pasteur, transfiera 100 embriones en la menor agua posible a cada plato. Incubar los dos platos a 28 grados centígrados. En cualquier momento después de 50 horas después de la fertilización, bajo el microscopio utilizar una pipeta Pasteur para separar cuidadosamente el pescado con hemorragia de poblaciones no hemorragias y transferir las larvas a nuevos platos que contengan medios frescos E3.Para facilitar la separación de las larvas positivas por hemorragia, podrías usar peces sin pigmento o pescado que expresen proteína fluorescente en los glóbulos rojos. Al tercer día, bajo un microscopio fluorescente criba las larvas para asegurar la expresión de proteína fluorescente. A continuación, llene la cámara de montaje de la hoja de luz con medios E3 que contengan 0,2%MS-222 para la anestesia.Con una pipeta Pasteur, transfiera una sola gota que contenga de una a seis larvas a una superficie seca de la placa Petri para su montaje. Utilice una pipeta para eliminar tanto líquido como sea posible. Agregue una gota de 1.5% de agarosa de fusión baja del bloque de calor de 45 grados Celsius a las larvas y utilice un capilar de montaje de 800 micrómetros para atraer primero la cabeza de las larvas.Si el posicionamiento no es preciso, expulse las larvas de la agarosa y vuelva a montarla. Deje que el capilar se enfríe y luego insértelo en la cámara de la lámina de luz. En el software de imágenes ZEN, presione continuamente para orientar las larvas y la prensa adquiera para adquirir imágenes de la cabeza de la cabeza entre las lentes oculares.En la pestaña de procesamiento, genere una imagen de proyección de intensidad máxima a partir de cada pila z. Para seleccionar aleatoriamente el ensayo de motilidad, transfiera 24 larvas después de la anestesia a medios E3 frescos y permita que los animales se recuperen de la anestesia. Después de que las larvas se hayan recuperado completamente de la anestesia, utilizando una pipeta con el corte final transferir larvas recuperadas en E3 medio sin azul de metileno.Placa una larva en un mililitro por pozo de un plato de 24 pozos. Cargue la placa en la cámara de la cámara. En el software de seguimiento EthoVision XT, ajuste la configuración del experimento para configurar una rutina de inicio de luz blanca para aumentar el movimiento espontáneo de natación y ensayo durante 10 minutos.Repita el ensayo de locomoción a las 96 y 120 horas después de la fertilización. La evaluación de la muerte de células cerebrales utilizando una línea de reportero venoso de Annexin V M ocultada en ubiquitina estuvo en secreto da como resultado grupos claros claros de células moribundas en larvas con hemorragias que están ausentes en todas las larvas no hemorragias indicadas por imágenes verdes de fluorescencia de campo brillante demuestran la presencia de sangrado cerebral. Se observaron células moribundas en modelos de Atorvastatina y cabeza de burbuja para larvas con hemorragias.La morfología de los macrófagos positivos MPEG1 cambia en la hemorragia intracerebral de larvas positivas a medida que las células adoptan en forma de amoeboides redondeados activos. Estas células redondeadas activadas fueron monitoreadas con el tiempo para mostrar una mayor respuesta fagocítica de la ubiquitina secretada Annexin V M venosa expresando células moribundas en larvas positivas de hemorragia intracerebral. La hemorragia cerebral se asocia con una disminución significativa de la motilidad a las 72 y 96 horas después de la fertilización en comparación con los controles negativos de los hermanos con hemorragia intracerebral.La motilidad a las 120 horas después de la fertilización se recupera a niveles basales cercanos. El aspecto más importante de este procedimiento es asegurarse de examinar a fondo las larvas para detectar la presencia o ausencia de hemorragias cerebrales antes de proceder a los ensayos de fenotipado. Este modelo también se puede utilizar para la detección de fármacos para determinar si la gravedad del fenotipo se puede mejorar después de un sangrado, un enfoque que puede llevarnos a identificar nuevos candidatos a medicamentos en el futuro.Esta técnica nos permite explorar las respuestas celulares inmediatamente después de un sangrado en el cerebro durante un punto de tiempo que ha sido tan notoriamente difícil de estudiar antes. Aunque ninguno de los reactivos o instrumentos descritos en este protocolo es específicamente peligroso, se deben tomar precauciones y cuidados estándar en todo momento en el uso de productos químicos, objetos punzantes o láseres.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

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Visualización de los propioceptores<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas y pupas

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Investigación

Neurociencias

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

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Ensayo Preferencia luz para estudiar innata y circadiano Photobehavior Regulado de<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas

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Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

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Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

Derivado de la evolución temporal de la Liquidación glutamato con un análisis de deconvolución de Corrientes Transporter astrocíticos

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Análisis Electrorretinograma de la respuesta visual en pez cebra larvas

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

Utilizing 3D Printing Technology to Merge MRI with Histology: A Protocol for Brain Sectioning

Utilizando tecnología de impresión 3D se fusiona con la RM Histología: Un protocolo para el Cerebro de seccionamiento

Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Incremento dependiente del tiempo en la respuesta de la red a la estimulación de cultivos de células neuronales en matrices de microelectrodos

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

Ablación de una población Neuronal utilizando un láser de dos fotones y su evaluación mediante grabación comportamiento y proyección de imagen de calcio en las larvas de pez cebra

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

Imágenes in vivo de tejido cerebral completamente activo en larvas y juveniles de pez cebra despiertos mediante la extirpación del cráneo y la piel

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...