Name: using zebrafish larvae to study the pathological consequences of hemorrhagic stroke
Uploaded: 2019-06-05T15:00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Zebrafish Larvae to Study the Pathological Consequences of Hemorrhagic Stroke at JoVE.com

Biz Dr David Spiller ve Manchester Systems mikroskopisi çekirdek tesis Üniversitesi ekipman kullanımı için teşekkür etmek istiyorum, Prof Richard Baines için DanioVision ve Dr Jack Rivers kullanımı için-Auty istatistiksel Danışma için. BBH hattı, Nicole Munsie tarafından Calgary Üniversitesi 'nde Dr. Sarah Child 'ın laboratuarından paylaşıldı. Ayrıca balık hatları ve ekipmanları için Prof. Stephen Renshaw, Dr. adam Hurlstone, Dr. Andrew Badrock ve Dr. Helen Young 'a da teşekkür ederiz.
Bu çalışmada NC3Rs (NC/N002598/1), Inme Derneği (TSA LECT 2017/02), ERA-NET NEURON (Bay/M501803/1) ve Ingiliz Kalp Vakfı (FS/15/67/32038) tarafından destekleniyordu. Biz de özellikle Natalie Kate Moss Trust ve Manchester Üniversitesi Biyoloji Fakültesi, tıp ve sağlık için onların sürekli mali destek için minnettarız.

Zebrafish, daha önce21' de açıklandığı gibi, Manchester Üniversitesi biyolojik hizmetler birimi 'nde standart koşullar altında büyüdü ve sürdürülür. Yetişkin zebra balığı yetiştiriciliği Manchester Üniversitesi hayvan refahı ve etik İnceleme Kurulu tarafından onaylandı. Tüm deneyler İngiltere ev ofisi yönetmeliklerine (PPL: P132EB6D7) uygun olarak gerçekleştirildi.
Not: Bu çalışmada kullanılan transjenik çizgiler macrophage özgü Lineage MPEG1 içerir:MCherry (daha önce açıklanan22), nötrofil özgü MPO:Gfp23,erythroid özgü gata1: DSRed24 ve ubiq:secannexinv-mvenus, hücre ölümü için bir muhabir (ev25' te yeniden türedi)vahşi tip, nacre (mitfaW2/W2) ve mutant (BBHm292) arka planlar. Şekil 1 deneysel zaman çizelgesini gösterir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> Şekil 1 : Beyin hasarı, lokomotor ve nöroinflamatuar sonuçları karakterize etmek için deneysel zaman çizelgesi grafik. ICH, intrakerebral kanama; BBH, bubblehead. Şekil Crilly ve al.20 ' den bir Creative Commons lisansı altında izni ile çoğaltılmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a> 
1. gün 0: yumurta üretimi ve toplanması
<ol><li>1 erkek ve 1-2 kadın yetişkin zebrafish üretilen üreme kutularında doğal yumurtlama döllenmiş embriyo toplayın. Not: atorvastatin Protokolü Için herhangi bir wildtype/transgenik hayvanlar kullanılabilir ancak kanama oranları suşları arasında biraz farklılık gösterebilir.</li>
	<li>Standart kurallar26' ya göre Petri tabağı ve sahne başına standart E3 embriyo orta olarak 28 °c ' de 100 embriyoları inküat.</li>
	<li>~ 6 saat sonrası döllenme (HPF) Pasteur pipet kullanarak yemden ölü ve döllenmemiş embriyoları çıkarın.</li>
</ol>2. gün 1: atorvastatin tedavi 24 HPF
<ol><li>NET Ultra ince diseksiyon forseps kullanarak atorvastatin tedavisi için dechorionate embriyo27. Denemeler için gerekli sayılar buna göre ayarlanabilir.</li>
	<li>İki temiz Petri yemek için E3 embriyo orta 30 mL ekleyin. 100 embriyo için bir çanak kullanın. Not: plakalar hücre kültürü için tasarlanmış ise, bu erken aşamada dechorionated zebra balığı genellikle alt sopa. Bunu önlemek için, kullanmadan önce plakaları iyice temiz suya durulayın.</li>
	<li>Tedavi plakasını 60 μL embriyo suyu çıkarın ve 60 μL 0,5 mM atorvastatin (ATV) ekleyin. 0,5 mM 'Lik stok konsantrasyonunda, yukarıdaki seyreltme, larvanın kanama olmayan (ICH-)% 20 ' sini 80 ve larvaları kanama (ıCH +) ' nın% ~%% ' ine neden olacak 1 μM son konsantrasyona neden olacaktır. Tedavi edilmeyen kontroller için diğer plakası kullanın Not: atorvastatin, 0,5 mM 'Lik bir stok solüsyonu yapmak için distile suda (10 mL 'ye 3 mg) çözünmüştür. Çözündürme biraz zaman alır gibi agitasyon ile karanlıkta oda sıcaklığında bir gecede inküye. Komple çözünme 1 hafta kadar sürebilir. DMSO kullanmayın. Çözüm,-20 °C ' de saklanır. Çözünme dondurmayın.</li>
	<li>Pasteur pipet kullanarak, 100 embriyoları tedavi plakalarına mümkün olduğunca az su olarak aktarın.</li>
	<li>Levhaları 28 °C ' de kulyatın. Not: 33 ve 48 HPF arasında ıCH gerçekleşir. Atorvastatin 'in 24 h 'den uzun kuluçk olarak kaldırılması gerekmez daha fazla gelişim sorunlarına neden olmaz.</li>
</ol>3. gün 2:50 HPF 'de ıCH-ve ıCH + nüfusunun ayrılması
<ol><li>ICH 'den ayrı ıCH + balık-nüfus ve kolaylıkla yeni yemeklerle transfer.<ol>
<li>ATV modelini 1 μM konsantrasyonda kullanıyorsanız, larvaları% 75-100 ' i bu zaman noktasında hemoraj (ıCH +) sergileyecektir. Not: larvaları, larva istenilen frekanslarda kanama yoksa, atorvastatin yeni bir toplu veya daha yüksek bir konsantrasyon kullanmak, suşları arasında farklıdır. Larvaları 48 HPF tarafından kanama sergilememiş ise o zaman onları ıCH-düşünün.</li>
		<li>BBH modelini kullanıyorsanız, tüm homozigot mutantlar 48 HPF tarafından kanama sergileyecektir. Bir heterozigot incross kullanıyorsanız, Ich-heterozigot ve wildtype kardeşler deneyler için denetim hayvanları olarak kullanılabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gerekirse, larvaları, E3 ortamına 0,02% MS222 ekleyerek anestezize etme. Pasteur pipet kullanarak, Kafadaki kan varlığı için larvaları yeni E3 medyasında sıralayabilirsiniz. Bkz. Şekil 2. Not: baş kanı ön, orta veya arka beyin ya da kombinasyon halinde görünebilir ve kanama hacmi hayvanlar arasında farklılık gösterebilir. BBH mutantlar, ıCG genellikle büyük kafaları tarafından tanınabilir şiddetli ödem ile ilişkilidir, gözler ve daha geniş boşluk arasında daha fazla taşma kanama. Ancak tüm ıCG + BBH larvaları ödemi sergiler.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig2.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> Şekil 2 : Ich + beyin hemoraj fenotipleri. Bir transgenik gata1 tutulan larva Ich fenotipleri örnekleri: DSRed muhabir nacre arka plan bir aydınlık alan mikroskoptan (üst paneller) ve floresan (alt panel) ile gözlenen ~ 48 h sonrası fertilizasyon. ICH-larva (sol paneller) ' de kanama görülmemiştir. Ich + larvaları (sağ paneller), önefe ve arka beyin (oklar) kırmızı kan hücrelerinin ayrı bir birikimi gözlenmiştir. Ölçek çubukları 250 μm temsil eder. Şekil Crilly ve al.20 ' den bir Creative Commons lisansı altında izni ile çoğaltılmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a> 
4. gün 3:72 HPF 'de hücre ölümü ve lökosit Analizi
<ol><li>Floresan protein ifadesi sağlamak için bir floresan mikroskop kullanarak larvaları ekran. Not: Bu çalışmada, transjenik ubiq: secannexinv-mvenus larvaları beyin hücresi ölümü ve çift transgenik MPOraporu için kullanılmıştır: Gfp; MPEG1: MCherry veya ubiq: secannexinv-mvenus; MPEG1: lökosit analizi için kullanılan MCherry.</li>
	<li>0,02% MS222 içeren E3 medyasını içeren lightsheet montaj odasını doldurun.</li>
	<li>Larvalar kullanarak anestezize 0,02% MS222. Montaj (n = 1-6) için larvaları, tek bir damlacık içinde kuru Petri çanak yüzeyine aktarın. Mümkün olduğunca fazla sıvı çıkarın. Not: 1,5% düşük Melt agaroz, mikrodalgada metilen mavisi olmaksızın 10 ml E3 ortamında çözülmüş ve 45 °c ' de kullanılıncaya kadar tutulan düşük Melt agaroz 0,15 g kullanılarak hazırlanır.</li>
	<li>Bir damla 1,5% düşük Melt agaroz ekleyin (bir 45 °c ısı bloğunda sıvı olarak tutulur) larvaya ve bir 800 μm montaj kılcal kullanarak ve larvaları ilk önce yukarı çizin. Konumlandırma doğru değilse larvalar agaroz 'den atılabilir ve tekrar monte edilebilir. Lightsheet odasına takmadan önce kapiller soğumaya bırakın. Not: Alternatif olarak, bu prosedür için bir Konfokal mikroskop kullanılabilir. Bunun için, larvaları bir cam alt çanak üzerinde agaroz yanal monte edilmelidir.</li>
	<li>Göz lensler (~ 300 μm) ve maksimum yoğunluk projeksiyon görüntü süreci arasında kafa z-yığını görüntüleri elde.<ol>
<li>Toplam floresan hücre sayısı ve toplam yoğunluk floresan20için toplanan görüntülerden beyin bölgesini analiz edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lökosit hareketlilik ve ölüm hücreleri ile etkileşim izlemek için 18-24 h üzerinde birden fazla projeksiyon kompozitlerin bir zaman atlamalı video oluşturun. Not: uzun vadeli canlı görüntüleme yapıldığında, kapiller sadece bir larva monte edilir.</li>
	<li>Görüntüleme tamamlandığında, larvaları montaj kapiller arasında ölümcül bir aşırı dozda% 4 MS222 ötenize etmek için uzaklaştırın.</li>
</ol>5. gün 3:72 HPF 'de motilite tahlili için larvaları seçme
<ol><li>0,02% MS222 ile Petri yemeklerinden anestezize larvaları.</li>
	<li>Rastgele seçin n = 24 motilite tahlil için larva ve yeni E3 medya içine transfer ve hayvanların anestezik kurtarmak için izin. Not: Bu noktada anestezik yakalamak kolay yavaş yüzücüler için seçim önyargı kaldırır.</li>
</ol>6. gün 3-5:72, 96 ve 120 HPF at lokomotif Asdiyerek
<ol><li>72 HPF 'de seçilen transfer larvaları metilen mavisi olmadan E3 orta haline gelmiştir. Not: 3 DPF 'de larvaları bol zaman anestezik (> 1 h) kurtarmak için izin vermek Için.</li>
	<li>Bir pipet kullanarak 24-kuyu plakasının iyi başına 1 mL plaka bir larva. Not: larvaları zarar görmesini önlemek için pipet ucunun ucunu kesin. Plaka boyutu deneysel tasarıma göre değiştirilebilir.</li>
	<li>Spontan yüzme artırmak için beyaz ışık korkutmak rutin kullanarak 10 dakika için kamera odasına ve tahlil hareket içine plakaları yükleyin. Not: yüzme davranışı bir kamera odası ve izleme yazılımı kullanılarak izlenir ( malzeme tablosunabakın).</li>
	<li>96 ve 120 HPF 'de aynı larvaları ile deneyi tekrarlayın. Test plakasında bulunan bireysel konutların larvaları Petri tabağına taşıyın ve 28 °C ' de asder arasında inkük yapın.</li>
	<li>Tahlil tamamlandığında, ölümcül bir aşırı doz içinde ötenize larva 4% MS222.</li>
</ol>

<ol>
	<li>An, S. J., Kim, T. J., Epidemiology Yoon, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology,+risk+factors,+and+clinical+features+of+intracerebral+hemorrhage:+an+update.">Epidemiology, risk factors, and clinical features of intracerebral hemorrhage: an update.</a> Journal of stroke. 19 (1), 3 (2017).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The top 10 causes of death. , (2017).</li><li>Casals, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+animal+models+for+stroke+research:+a+review.">The use of animal models for stroke research: a review.</a> Comparative medicine. 61 (4), 305-313 (2011).</li><li>Kellner, C. P., Connolly, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+Strategies+for+Intracerebral+Hemorrhage+Trials+and+Translation.">Neuroprotective Strategies for Intracerebral Hemorrhage Trials and Translation.</a> Stroke. 41 (10 Suppl 1), S99-S102 (2010).</li><li>Kirkman, M. A., Allan, S. M., Parry-Jones, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+intracerebral+hemorrhage:+avoiding+pitfalls+in+translational+research.">Experimental intracerebral hemorrhage: avoiding pitfalls in translational research.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (11), 2135-2151 (2011).</li><li>ASPA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 1986 amendments. , (2012).</li><li>Butler, M. G., Gore, A. V., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in cell biology. 105, 137-161 (2011).</li><li>Walcott, B. P., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+of+cerebrovascular+disease.">Zebrafish models of cerebrovascular disease.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 34 (4), 571-577 (2014).</li><li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+mediate+the+repair+of+brain+vascular+rupture+through+direct+physical+adhesion+and+mechanical+traction.">Macrophages mediate the repair of brain vascular rupture through direct physical adhesion and mechanical traction.</a> Immunity. 44 (5), 1162-1176 (2016).</li><li>Kasher, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+samhd1+morphant+zebrafish+recapitulates+features+of+the+human+type+I+interferonopathy+Aicardi-Goutieres+syndrome.">Characterization of samhd1 morphant zebrafish recapitulates features of the human type I interferonopathy Aicardi-Goutieres syndrome.</a> The Journal of Immunology. 194 (6), 2819-2825 (2015).</li><li>Wen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+rnf213a+by+TALEN+causes+abnormal+angiogenesis+and+circulation+defects+in+zebrafish.">Mutation of rnf213a by TALEN causes abnormal angiogenesis and circulation defects in zebrafish.</a> Brain research. 1644, 70-78 (2016).</li><li>Eisa-Beygi, S., Rezaei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etiology+of+intracerebral+hemorrhage+(ICH):+novel+insights+from+Zebrafish+embryos.">Etiology of intracerebral hemorrhage (ICH): novel insights from Zebrafish embryos.</a> International Journal of Developmental Biology. 60 (4-5-6), 119-126 (2016).</li><li>Mracsko, E., Veltkamp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation+after+intracerebral+hemorrhage.">Neuroinflammation after intracerebral hemorrhage.</a> Frontiers in cellular neuroscience. 8, 388 (2014).</li><li>Eisa-Beygi, S., Hatch, G., Noble, S., Ekker, M., Moon, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA+reductase+(HMGCR)+pathway+regulates+developmental+cerebral-vascular+stability+via+prenylation-dependent+signalling+pathway.">The 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (HMGCR) pathway regulates developmental cerebral-vascular stability via prenylation-dependent signalling pathway.</a> Developmental biology. 373 (2), 258-266 (2013).</li><li>Shen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+Rho-kinase+inhibitors+by+docking-based+virtual+screening.">Discovery of Rho-kinase inhibitors by docking-based virtual screening.</a> Molecular BioSystems. 9 (6), 1511-1521 (2013).</li><li>Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tanshinone+I+prevents+atorvastatin-induced+cerebral+hemorrhage+in+zebrafish+and+stabilizes+endothelial+cell-cell+adhesion+by+inhibiting+VE-cadherin+internalization+and+actin-myosin+contractility.">Tanshinone I prevents atorvastatin-induced cerebral hemorrhage in zebrafish and stabilizes endothelial cell-cell adhesion by inhibiting VE-cadherin internalization and actin-myosin contractility.</a> Pharmacological research. , (2017).</li><li>Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+ROCK+inhibitor,+FPND,+which+prevents+cerebral+hemorrhage+through+maintaining+vascular+integrity+by+interference+with+VE-cadherin.">Discovery of a ROCK inhibitor, FPND, which prevents cerebral hemorrhage through maintaining vascular integrity by interference with VE-cadherin.</a> Cell death discovery. 3, 17051 (2017).</li><li>Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&#946;Pix-Pak2a+signaling+pathway+regulates+cerebral+vascular+stability+in+zebrafish.">A &#946;Pix-Pak2a signaling pathway regulates cerebral vascular stability in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (35), 13990-13995 (2007).</li><li>ten Klooster, P. J., Jaffer, Z. M., Chernoff, J., Hordijk, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+and+activation+of+Rac1+are+mediated+by+the+exchange+factor+&#946;-Pix.">Targeting and activation of Rac1 are mediated by the exchange factor &#946;-Pix.</a> The Journal of cell biology. 172 (5), 759-769 (2006).</li><li>Crilly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+zebrafish+larval+models+to+study+brain+injury,+locomotor+and+neuroinflammatory+outcomes+following+intracerebral+haemorrhage.">Using zebrafish larval models to study brain injury, locomotor and neuroinflammatory outcomes following intracerebral haemorrhage.</a> F1000Research. 7, (2018).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish. , (2000).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).</li><li>Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li><li>Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants.">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nature immunology. 4 (12), 1238 (2003).</li><li>Morsch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+microglial+engulfment+of+dying+neurons+in+the+zebrafish+spinal+cord.">In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord.</a> Frontiers in cellular neuroscience. 9, (2015).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Liang, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish in the Classroom. , (2011).</li><li>Yang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miconazole+protects+blood+vessels+from+MMP9-dependent+rupture+and+hemorrhage.">Miconazole protects blood vessels from MMP9-dependent rupture and hemorrhage.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 10 (3), 337-348 (2017).</li><li>Andaluz, N., Zuccarello, M., Wagner, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+animal+models+of+intracerebral+hemorrhage.">Experimental animal models of intracerebral hemorrhage.</a> Neurosurgery Clinics of North America. 13 (3), 385-393 (2002).</li><li>Rosenberg, G. A., Mun-Bryce, S., Wesley, M., Kornfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagenase-induced+intracerebral+hemorrhage+in+rats.">Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats.</a> Stroke. 21 (5), 801-807 (1990).</li></ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Bu çalışmada, zebra balığı larvaları içinde Ich sistematik olarak tespit edilebilir ve niceliksel olabilir insan durumunun önemli yönlerini yeniden bir beyin hasarı tepkisi indükleyen gösterir. Zebrafish, damar rüptürü17,28' i önlemek yerine kan kaynaklı beyin yaralanmasını hedeflemeye odaklanan gelecekteki ilaç müdahalesi çalışmalarına yardımcı olacak spontan Ich 'nin tutarlı ve tekrarlanabilir bir modelini sunar. Nitekim, hastalığın başlangıcı klinik duruma benzeyen hızlı doğası göz önüne alındığında, böyle bir yaklaşım gelecekte başarılı çeviri için heyecan verici umutları sunuyor.
Bazı sınırlamalar zebra balığı larva kullanımı ile ilişkilidir, örneğin gelişmekte olan bir sistemin kullanımı ve taksononomik rütbe, ancak bu modelin pratik ve bilimsel avantajları Ich yeni Öngörüler sunmak için dikkate alınmalıdır. Yaralanmadan sonra uzun süre boyunca bir kanama veya hücresel süreçleri izlemek için hiçbir ameliyat gerektirmez. Zebra balığı eşleştirmeleri yüksek büyüklükleri kolayca erişilebilir ve büyük Numune boyutları oluşturmak ve larvalar hızlı gelişimi nedeniyle deneysel zaman çizelgesi kemirgen çalışmaları ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde azalır29,30.
Şu anda bu modeller canlı bozulmamış hayvanların beyinde spontan Ich hemen patolojik ve immünolojik yanıt aydınlatılmasına için kullanılmak üzere uygundur. Potansiyel olarak, bu model ıCH terapileri için orta-yüksek verimlilik ilaç ekranları için adapte edilebilir, ister önleyici veya kurtarma teşvik. Bu nedenle, bu çalışmada sunulan Post-ıCH patolojileri, klinik öncesi ıCH araştırmaları için alternatif ve tamamlayıcı bir platform oluşturmaktadır.

İntrakerebral kanama (ıCH), spontan serebral damar rüptür ve beyin hasarı, fiziksel özürlülük ve genellikle ölüm1olan parankimat içine kanama ile ilişkili en şiddetli alt tip inme olduğunu. Ich2ile ilişkili yüksek mortalite ve morbidite oranına rağmen, destek etiyolojisi ve kanama sonrası patolojinin anlaşılması hala eksiktir. Bu nedenle, ıCH önlemek veya hasta sonuçlarını iyileştirmek için özel tedaviler yoktur. Hastalık biyolojisinin anlayışımızın çoğu, Ich3' ün klinik öncesi kemirgen modellerinden geliyor, ancak bu modellerde yapılan çalışmalar, herhangi bir başarılı terapötik terapi için klinik4,5' e çeviremedi. Bu başarısızlık kısmen, bu preklinik modellerin bazı sınırlamalar için, kolayca insan hastalığının spontan doğası ve invaziv cerrahi gereksinimi memelilerde modelleri oluşturmak için reapitulate dahil olmak üzere olabilir6. Ayrıca, kemirgenler bozulmamış doku içinde ıCH hücresel tepkiler hızlı başlangıcı gözlemlemeye ilişkin pratik sorunlar oluşturmaktadır. Kemirgen modellerinden çeviri eksikliği göz önüne alındığında, spontan ıCH alternatif modelleri geliştirmek bu pratik sorunları aşmak ve yeni uyuşturucu hedeflerini belirlemeye yardımcı olmak için zorunludur.
Vasküler gelişimin moleküler mekanizmaları, zebra balığı (Danio rerio)7de dahil olmak üzere vertebratlar arasında iyi şekilde tutulurlar. Bu nedenle, bu model organizmanın benimsenmesi serebrovasküler hastalığı incelemek için her zamankinden daha kullanışlı bir mekanik strateji haline geliyor8. Bir dizi zebra balığı modelleri, inme ile ilgili koşullar ile ilgili fenotipleri özetlemek üretilir9,10,11,12. Hastalık patogenezi araştırmak için zebra balığı larvaları kullanımı, memelinin modelleri üzerinde hem pratik hem de bilimsel avantajlar sunar8. Bu yüksek üreme oranları, hızlı gelişim ve intravital görüntüleme için kemirgenler ile ilişkili invaziv kısıtlamalar olmadan sağlar larva şeffaflık içerir. Zebra balığı araştırma topluluğunun içinde mevcut olan çok çeşitli transgenik muhabir hatları ile bu avantajları kavramak, hastalık biyolojisi eğitimi için güçlü bir In vivo yaklaşımıdır, henüz patolojik çalışmalar için kullanılmaz ıCH sonuçları.
Beynin kan yaralanma tepkisi bifazik13; birincil hakaret nöronal ölüm ve hücre nekrozu neden olur, daha sonra doğuştan gelen bağışıklık aktivasyonu ile indüklenen bir hasar ikincil dalgası başlatır. Beyin yaralanması ikinci aşaması, özellikle nöroinflamatuar bileşeni, gelecekteki ilaç tedavisi için gerçekçi bir hedef olarak kabul edilir13. Zebra balığı larvaları daha önce14,15,16,17,18,19' da spontan ve serebral özel hemorajler tarif edilmiştir. İki tür modeller atorvastatin kullanımı (ATV) at 24 h sonrası fertilizasyon (HPF) inhibe hmgcr yol ve kolesterol biyosentezi14, ve bir balon kafa (BBH) arhgef7 geni bir Hipomorfik mutasyon ifade mutant, βpix, ve daha sonra sıkı endovasküler kavşaklar için aktin remodeling inhibe18. Bu modeller dolaşım başlangıcında spontan serebral spesifik kan damar rüptürü sergiler (~ 33 HPF). Son zamanlarda, bu modeller daha fazla beyin hasarı tepkisi önemli yönlerini insanlar ve zebra balığı larvaları arasında tutulmaktadır ortaya çıkarmak için karakterize ettik20. Bu çalışmada, zebra balığı larvaları içinde spontan beyin hemorajinin elde edilmesi ve görselleştirilmesi için gereken metodoloji ve insan durumu ile ilgili olarak beyin yaralanması, lokomotor ve nöroinflamatuar fenotiplerin nasıl ölçüleceği gösterilmektedir. Bu veri ve teknikler, klinik öncesi ıCH araştırmaları için değerli bir tamamlayıcı sistem olarak bu model türlerinin kullanımını desteklemektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1159px;" width="1160">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">24 well plates</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">CLS3527</td>
			<td style="width:441px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">28 &#176;C incubator</td>
			<td style="width:227px;">LMS</td>
			<td align="right" style="width:165px;">210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Atorvastatin</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">PZ0001-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Breeding boxes</td>
			<td style="width:227px;">Thoren Aquatics systems</td>
			<td align="right" style="width:165px;">10011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Daniovision observation chamber</td>
			<td style="width:227px;">Noldus</td>
			<td style="width:165px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">E3 medium 1x</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:165px;"></td>
			<td>4% Instant Ocean, 500 &#181;L methylene blue in 1 L dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">EthoVision XT software</td>
			<td style="width:227px;">Noldus</td>
			<td style="width:165px;">version 11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heat block</td>
			<td style="width:227px;">Grant-Bio</td>
			<td>PHMT-PSC18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Instant ocean</td>
			<td style="width:227px;">Instant Ocean</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Lightsheet microscope</td>
			<td style="width:227px;">Zeiss</td>
			<td style="width:165px;">Z.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lightsheet microscope mounting capillary</td>
			<td style="width:227px;">Zeiss</td>
			<td>402100-9320-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Low melt agarose</td>
			<td style="width:227px;">Promega</td>
			<td style="width:165px;">V2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Methylene Blue</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">319112-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Microscope&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Leica</td>
			<td style="width:165px;">MZ95</td>
			<td>dissection microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Microscope</td>
			<td style="width:227px;">Leica</td>
			<td>M165FC</td>
			<td>fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;">MS222</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td></td>
			<td>4g tricaine powder, 500 mL of dH2O, 10 mL of 1 M Tris (pH 9). Adjust pH to ~7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P1000 pipette</td>
			<td style="width:227px;">Gilson</td>
			<td>F144059M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">P1000 pipette tips</td>
			<td style="width:227px;">Starlab</td>
			<td style="width:165px;">S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pasteur pipettes</td>
			<td style="width:227px;">Starlab</td>
			<td style="width:165px;">E1414-0300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dishes&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Corning</td>
			<td style="width:165px;">101VR20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipetboy</td>
			<td style="width:227px;">Integra Biosciences</td>
			<td style="width:165px;">PIPETBOY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Stripette 25ml</td>
			<td style="width:227px;">Corning</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Tricaine powder</td>
			<td style="width:227px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">A5040-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Base</td>
			<td style="width:227px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:165px;">BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra fine dissection forceps</td>
			<td style="width:227px;">Agar scientific</td>
			<td style="width:165px;">AGT502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Zen software</td>
			<td style="width:227px;">Zeiss</td>
			<td style="width:165px;">version 2.3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using zebrafish larvae to study the pathological consequences of hemorrhagic stroke

Yüksek küresel mortalite ile en şiddetli inme alt türüne rağmen, intrakerebral kanama (ıCH) olan hastalarda spesifik bir tedavi yoktur. Modelleme Ich önceden klinik olarak zor kanıtlanmıştır, ve mevcut kemirgen modelleri kötü insan Ich spontan doğası özetlemek. Bu nedenle, ıCH 'de hastalık mekanizmalarının incelenmesi ve potansiyel uyuşturucu keşfi için alternatif klinik öncesi metodolojiler için acil bir gereksinim vardır.
Zebra balığı kullanımı translasyonel araştırma için giderek daha popüler bir yaklaşım temsil eder, öncelikle yararları bir dizi nedeniyle hastalığın memeli modelleri üzerinde sahip, üretken üreme oranları ve larva şeffaflık canlı için izin dahil olmak üzere Görüntüleme. Diğer gruplar, zebra balığı larvaları serebrovasküler gelişmenin genetik veya kimyasal bozulması sonrasında spontan Ich 'yi sergileyebilir. Bu metodolojinin amacı, klinik öncesi ıCH araştırmaları bağlamında beyin kanama patolojik sonuçlarını incelemek için bu tür modelleri kullanmaktır. Canlı görüntüleme ve motilite yöntemleri kullanarak, ıCH aşağıdaki beyin hasarı, nöroinflamasyon ve Lokomotor işlevi değerlendirilebilir ve nicelik.
Bu çalışmada, insanlarda beyin kanamanın önemli patolojik sonuçlarının zebra balığı larvalar içinde, model organizmayı Ich 'nin klinik öncesi incelenmesi için değerli bir in vivo sistemi olarak vurgulayarak tutulmasını göstermektedir. Bu metodolojinin amacı, klinik öncesi inme topluluğunun zebra balığı larva modelini kemirgenler için alternatif bir tamamlayıcı model sistemi olarak kullanmalarını sağlamak.

Transjenik ubıqkullanarak beyin hücresi ölümü değerlendirilmesi: secannexinv-mvenus, tüm Ich-larva ' d a yok olan hem ATV hem de bby modellerinde ICG + larvaları içinde ölen hücrelerin net kesin kümeleri ile sonuçlanır (Şekil 3). Kümeleri 96 HPF önce geri. Görüntü analizi sayesinde, kanama beyinde floresans sinyalinin toplam yoğunluğunda önemli iki kat artış ile ilişkilidir, işaretlenmiş hücre ölümü gösteren.
ICH + larvaları içinde, beynin MPEG1 pozitif makrophaj hücrelerinin sayıları önemli ölçüde artan bir nöroinflamatuar yanıt tanımlanır. Toplam MPO pozitif nötrofil hücrelerinin sayısı da arttı ancak bu istatistiksel öneme ulaşamadı (Şekil 4). MPEG1 pozitif makrofajların morfolojisi, hücreler aktif, yuvarlatılmış, Kökbacaklılar şekli benimsemek olarak Ich + larvaları değiştirmek için de görülebilir. Bu aktif yuvarlak hücreler aynı zamanda ubıq'nun artan bir fagositik tepkisi göstermek için zaman içinde izlenebilir: secannexinv-mvenus, Ich + larva 'daki ölüm hücrelerini ifade ediyor (Şekil 5). MPEG1 pozitif makrofajlar sergileme dallanmış süreçleri etkin olarak kategorize edildi.
Beyin kanaması, 72 ve 96 HPF 'de motilite önemli bir düşüş ile ilişkilidir, hem BBH hem de ATV modellerinde ıCY-kardeş kontrollerine kıyasla (Şekil 6). 120 HPF 'de motilite, temel seviyelere yakın şekilde kurtarır. Genellikle yumurta debriyajlar ve suşları arasında temel motilite farklılıkları vardır ve bu nedenle karşılaştırma ıCH yapılmalıdır-her zaman kontrol eder.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig3.jpg"> Şekil 3 : Zebra balığı larvlarda intrakerebral kanama (Ich) ölçülebilir bir beyin yaralanmasına neden olur. (A) Ich + larvaları (sağ paneller) içinde beyin hasarı fenotipinin temsili görüntüleri, Ich-kardeşler (sol paneller) ile karşılaştırıldığında, 72 HPF. Brightfield görüntüleri (alt paneller, ölçek çubuğu = 250 μm) ıCG + larvada beyin kanamaları (oklar) varlığını göstermektedir. Ubiq:secannexinv-mvenus Reporter satırında (üst paneller, ölçek çubuğu = 100 μm) hücre ölümünü görselleştirmek için Floresan Mikroskobu yapılmıştır. Peri-hematomal bölgelerde ölen hücrelerin kümeleri gözlenmiştir. Görüntüler sadece beyin bölgelerine kırpılıyorlardı ve ek dosya 1' de makroyu kullanarak, çapı 30 pikselden (beyaz çizgi) büyük yuvarlak partiküllerde toplam yeşil floresan yoğunluğu için analiz edilmiştir. (B) ATV modeli (n = 12 Grup başına; 3 bağımsız çoğaltır) ile elde edilen, tedavi edilmemiş, Ich-ve Ich + larvaları beyinlerinde floresans sinyalinin ölçülmesini 72 HPF. ICH + ile tedavi edilmemiş (* * p = 0,004) ve ıCH-(* p = 0,03) kardeşler ile karşılaştırılırken önemli farklılıklar gözlenmiştir. (C) 72 HPF 'de balon kafa (BBH) modeli (grup başına n = 12; 2 bağımsız çoğaltır) ile elde edilen ICG-ve ICU + larvasının beyinlerinde annexinv bağlayıcı için okuma olarak floresan sinyalinin ölçülmesini. Grafikler ortalama SD gösterir. ICH + ve ıCH-yaş eşleştirilen kardeşler arasında mVenus floresan önemli bir fark görüldü (* * p = 0,002). Şekil Crilly ve al.20 ' den bir Creative Commons lisansı altında izni ile çoğaltılmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig3large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig4.jpg"> Şekil 4 : İntrakerebral kanama (Ich) zebra balığı larva beyninde içsel bir hücresel bağışıklık tepkisi başlatır. Daha önce MPO için açıklanan beyin bölgelerinde nicelik lökosit sayısı: GFP; MPEG1: dsRed çift transjenik larvaları (grup başına n = 8; 2 bağımsız çoğaltır) 72 HPF makrofajlarda önemli bir artış ortaya çıkarır (* p = 0,01), ancak nötrofiller (p = 0,5), ıCH yanıt olarak. Şekil Crilly ve al.20 ' den bir Creative Commons lisansı altında izni ile çoğaltılmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig4large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a> 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig5.jpg"> Şekil 5 : Aktif makrophaj hücreleri beyin lezyonunun fagositik tepkisini gösteriyor. (A) temsili zaman atlamalı fotoğraf20 bir annexinv pozitif hücreye doğru göç bir dallanmış devriye makrophage gösteren (i-vi). Stills bir 20X amacı kullanarak tüm beyin alınan görüntüleri bir dizi elde edilir. Ölçek çubuğu 50 μm temsil eder. Makrofaj annexinv-pozitif hücre (VI, VII) phagocytosing önce bir Kökbacaklılar morfoloji (v) satın aldı. Phagositoz sonrası makrofaj bir dallanmış morfoloji devam eder ve uzaklaşır ve annexinv-pozitif hücre artık görülebilir (VIII). Ramified makrofaj (#), annexinv pozitif hücre (ok), Kökbacaklılar makrofaj (*) belirtilir. (B) Ich-ve Ich + larva beyninde MPEG1-pozitif hücrelerin temsili görüntüleri Kökbacaklılar ve dallanmış Morphologies sergileme. Ölçek çubukları 50 μm ' sini temsil eder. (C) Ich-kardeşlere kıyasla Ich + beyinde artan oranda Kökbacaklılar (fagositik) ve azalmış oran (aktif olmayan) makrofajlar gözlenmiştir. Şekil Crilly ve al.20 ' den bir Creative Commons lisansı altında izni ile çoğaltılmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig5large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a> 
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig6.jpg"> Şekil 6 : Zebra balığı larva 'da ölçülebilir bir lokomotor açığı ile Ich kaynaklı beyin hasarı sonuçlanır. (A) 72, 96 ve 120 HPF 'de ich-ve ich + BBH larvaları 'ndaki yüzme pistlerinin temsili örnekleri. (B) Ich + larvaları, hem 72 hem de 96 HPF 'de 10 dk kayıt döneminde mobil harcanan toplu süre içinde önemli bir düşüş sergiledi. 120 HPF zaman noktasında potansiyel olarak beyin yaralanması (n = 24 larva grubu başına; 3 bağımsız çoğaltır; * * * * p = 0,00006; * * p = 0,003; NS: p = 0,08) geri kazanımı için anlam kaybı oldu. (C) 120 HPF 'de tedavi EDILMEMIŞ ve ATV TEDAVI edilen Ick-ve Ich + larvaları içinde hareket eden toplu zamanın ölçülmesini. ICH + larvaları, 10 dakika kayıt döneminde mobil harcanan toplu süre içinde önemli bir düşüş sergiledi. Ortalama (* * * p = 0,00004, * * p = 0,0003) SD hesaplamak için üç teknik çoğaltır (grup başına n = 24 larva) kullanılmıştır. Şekil Crilly ve al.20 ' den bir Creative Commons lisansı altında izni ile çoğaltılmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig6large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a> 
Ek dosya 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/Supplementary_File_1-Macro.docx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using Zebrafish Larvae to Study the Pathological Consequences of Hemorrhagic Stroke at JoVE.com

Using Zebrafish Larvae to Study the Pathological Consequences of Hemorrhagic Stroke

Burada insan intrakerebral kanama (Ich) bağlamında, zebra balığı larvalarda beyinde kanama sonrasında beyin yaralanması, lokomotor açıkları ve nöroinflamasyonu ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Hemorajik Inme patolojik sonuçlarını Incelemek için zebrafish larva kullanma

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage ...

Bu yöntem, hemorajik inme sonrasında beyinde kana hemen hücresel yanıt eğitimi için ücretsiz bir ön klinik yaklaşım sağlar, hangi biz hastalar için mevcut özel ilaçlar var çok ciddi bir durum. Kemirgen modellerinin aksine, zebra balığı larvalarının şeffaflığı, floresan mikroskopi kullanarak canlı hayvanların beyinlerindeki hücresel tepkileri gerçek zamanlı olarak gözlemlememizi sağlar. Başlamak için, bir erkek ve bir ila iki dişi yetişkin zebra balığı ndan üretilen üreme kutularında doğal yumurtlama tüm döllenmiş embriyoları toplamak için bir çay süzgeci kullanın.Standart E3 embriyo ortamı içeren her Petri kabına 100 embriyo aktarın. 28 santigrat derecede kuluçka ve standart kurallara göre sahne. Döllenmeden altı saat sonra, pasteur pipeti kullanarak ölü ve döllenmemiş embriyoları yemekten çıkarın ve bulaşıkları kuvöze geri koyun.24 saat sonra, parlak alan stereo mikroskop altında, Atorvastatin tedavisi için embriyoları decorionate keskin ultra ince diseksiyon forsepsi kullanın. Sonra iki temiz Petri yemekleri, bir tedavi ve kontrol için diğer E3 embriyo orta 30 mililitre ekleyin. Tedavi çanak embriyo su 60 mikrolitre çıkarın ve larva kanamalı% 80 elde etmek için 0.5 milimolar Atorvastatin 60 mikrolitre ekleyin.Pasteur pipeti kullanarak, her çan ağa mümkün olduğunca az su 100 embriyo transfer. İki tabak 28 santigrat derece kuluçka. Gübrelemeden 50 saat sonra herhangi bir zamanda, mikroskop altında, kanamalı balıkları kanamasız popülasyonlardan dikkatlice ayırmak ve larvaları taze E3 ortam içeren yeni yemeklere aktarmak için pasteur pipetkullanın.Daha kolay kanama pozitif larvaayırmak için, kırmızı kan hücrelerinde floresan protein ifade pigment veya balık olmadan balık kullanabilirsiniz. Üçüncü gün, floresan mikroskop ekranında floresan proteinin ekspresyonunu sağlamak için larvalar kullanılır. Daha sonra anestezi için %0,2 MS-222 içeren E3 ortamile hafif sac montaj odasını doldurun.Pasteur pipeti kullanarak, 1-6 larva içeren tek bir damlacığı montaj için kuru petri kabı yüzeyine aktarın. Mümkün olduğunca çok sıvı kaldırmak için bir pipet kullanın. Larvalara 45 derece santigrat ısı bloğundan %1,5'lik düşük erime agarose'u ekleyin ve larvaları baş yukarı çekmek için 800 mikrometrelik bir kapiller kullanın.Konumlandırma doğru değilse, larvaları agarose'dan uzaklaştırın ve tekrar monte edin. Kapiller soğumaya bırakın ve sonra ışık levha odasına takın. ZEN görüntüleme yazılımında larvaları yönlendirmek için sürekli basın ve göz merceği arasında kafanın z-yığın görüntülerini elde etmek için elde edin.İşlem sekmesinde, her z yığınından maksimum yoğunluklu projeksiyon görüntüsü oluşturun. Motilite testi için rastgele seçmek için, anesteziden sonra 24 larvayı taze E3 ortama aktarın ve hayvanların anesteziden kurtulmasını bekleyin. Larvalar anesteziden tamamen iyileştikten sonra, son kesme transferi ile bir pipet kullanarak metilen mavisi olmadan E3 ortamına geri kazanılmış larvalar.24 kuyu plakası kuyubaşına bir mililitrede bir larva plakası. Plakayı kamera odasına yükleyin. EthoVision XT izleme yazılımında, spontan yüzme ve deneme hareketini 10 dakika artırmak için beyaz ışık ürktülü rutini ayarlamak için deneme ayarlarını ayarlayın.96 ve 120 saat post-fertilizatin de lokomotion tsay tekrarlayın. Transgenik ubiquitin salgılanan Annexin V M venöz muhabir hattı kullanılarak beyin hücresi ölümünün değerlendirilmesi, yeşil floresan parlak alan görüntüleri ile gösterilen tüm kanamasız larvalarda bulunmayan kanamalı larvalarda kesin ölüm hücre kümeleri ile sonuçlanır Parlak alan görüntüleri beyin kanamalarının varlığını göstermektedir. Kanamalı larvalar için hem Atorvastatin hem de kabarcık kafa modellerinde ölen hücreler gözlendi.MPEG1 pozitif makrofajların morfolojisi intraserebral kanama pozitif larvalarda hücreler aktif yuvarlak amipoid şekil olarak benimsemiştir. Bu aktif yuvarlak hücreler intraserebral kanama pozitif larvalarda ölmekte olan hücreleri ifade eden ubikitin salgılanan Annexin V M venözlerin fagositik yanıtını göstermek için zaman içinde izlendi. Beyin kanaması intraserebral kanama negatif kardeş kontrolleri ile karşılaştırıldığında 72 ve 96 saat post-fertilizasyon de motilite önemli bir azalma ile ilişkilidir.Döllenme sonrası 120 saat olan hareketlilik, temel seviyelere yakın bir düzeye geri kazanışır. Bu işlemin en önemli yönü iyice fenomeni ilerkileme tahlilleri geçmeden önce beyin kanamaları varlığı veya yokluğu için larva incelemek için emin olmaktır. Bu model aynı zamanda fenotip şiddetinin kanamadan sonra iyileşip iyileşmeyebileceğini belirlemek için ilaç taraması için de kullanılabilir, bu da gelecekte yeni ilaç adaylarını belirlememize yol açabilecek bir yaklaşımdır.Bu teknik bize şimdiye kadar çok kötü üne sahip şimdi çalışma zor olmuştur bir zaman noktası sırasında beyinkanamasından hemen sonra hücresel yanıtları keşfetmek için izin verir. Bu protokolde tanımlanan reaktiflerin veya aletlerin hiçbiri özellikle tehlikeli olmamasına rağmen, kimyasallar, keskin ler veya lazerler kullanılarak her zaman standart bakım ve önlemler alınmalıdır.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Içinde proprioseptörlere Görselleştirmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva ve Pupa

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Içinde Doğuştan gelen ve sirkadiyen Ayarlı Photobehavior Eğitim ışık tercih Testi<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

Zebra balığı Larva otomatik Yüksek verim Davranış Analizleri

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

Astrositik Transporter Akımlar bir Dekonvolüsyon Analizi ile Glutamat Gümrükleme gün Dersin türetilmesi

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

Zebra balığı Larva Görsel Tepki Elektroetinogram Analizi

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

Utilizing 3D Printing Technology to Merge MRI with Histology: A Protocol for Brain Sectioning

3D Baskı Teknolojisini kullanan Histoloji ile MRG Birleştirme: Beyin için Protokol Kesit

Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Mikro Elektrod Dizilerinde Nöronal Hücre Kültürlerinin Uyarılmasına Ağ Yanıtına Zamana Bağlı Artış

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

Ablasyon nöronal nüfusunun iki fotonlu lazer ve kalsiyum görüntüleme ve davranış kayıt zebra balığı larva kullanarak kendi değerlendirme kullanma

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

Kafatası ve Deri Temizleme ile Uyanık Zebra Balığı Larvaları ve Yavrularında Tam Aktif Beyin Dokusunun In vivo Görüntülemesi

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...