Name: an all-in-one sample holder for macromolecular x-ray crystallography with minimal background scattering
Uploaded: 2019-07-06T14:30:00
Duration: 7 min 55 s
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作者感谢由赫尔姆霍尔茨-曾特鲁姆柏林公司运营的BESSY II提供光束时间访问和支持,以及样品环境和技术设计部门在设计和施工以及 3D 打印机设施访问方面给予的帮助。

注意:对于后续工作,必须使用未受保护的手指触摸黄色聚酰亚胺箔,因为样品架可能受到污染。此外,强烈建议使用受保护的钳子。
1. 样品架
<ol><li>使用三种类型的样品支架之一。 注:图1显示了新开发的样品支架的三个不同版本。所有它们都包含黑色塑料支撑结构、外侧密封的 COC 箔和内部的微孔结构聚酰亚胺箔。类型 1 (图 1A) 包含固定的外部塑料环,而对于类型 2 和 3(图 1B,1C),外圈可以在指定的各断点机械地断开,用于自动样品传输系统(参见红色图 1B中的箭头 。样品支架的设计允许在黄色聚酰亚胺箔上设置多个结晶滴。它不会影响对结晶实验的监测,因为材料对于可见光是高度透明的。21 μm厚的聚酰亚胺箔还具有5μm孔,允许以后浸泡进行简单的晶体操作。由于X射线的传输接近1.0在所有常用的衍射数据收集能量在大分子晶体学,箔对背景散射的贡献在衍射实验可以忽略28。</li>
</ol>2. 设置结晶滴
<ol><li>使用无湿绒布创建清洁无尘表面。从包装盒中取一个样品架,轻轻地将其(黄箔朝上)放在清洁的表面上,以避免背面 COC 箔损坏或意外刺穿。</li>
	<li>在黄箔上设置最大建议体积为 2 μL 的结晶滴,就像在常用的盖玻片上一样。轻轻地放置液滴,以避免使用移液器使箔发生任何破裂或穿孔。在类型 1 的样品支架上(图 2A)最多可放置三滴,而在类型 2 和 3 两滴的样品支架上,建议的最大丢弃值(图 2C)。</li>
	<li>翻转样品架并将其放在 24 孔林布罗式板的预润滑腔上。使用样品架的定位辅助工具(参见图1A中的红色箭头)来引导其达到最佳位置。</li>
	<li>确保样品架的正确位置,以避免不必要的蒸发(图2A)。</li>
</ol>3. 观察晶体生长
<ol><li>通过将结晶板置于透射光显微镜下,带或不带偏振器,监测晶体生长,不受实验干扰(图4)。</li>
	<li>当使用3型(图1C)的18毫米小样品支架(图1C)时,使用能够处理SBS足迹板的成像机器人以更自动化的方式监测晶体生长。</li>
</ol>4. 晶体操作
注:建议在透射光显微镜下执行所有后续步骤。
<ol><li>
冷冻保护
	<ol>
<li>使用细管轻轻刺穿外部 COC 箔。确保内部黄箔保持原状。穿刺应该就在要操纵的滴旁边 (图 3A,3C)。</li>
		<li>使用细纸芯并将其插入戳孔中。小心地向前推芯,直到它接触黄色聚酰亚胺箔。使灯芯与穿孔箔接触。灯芯会吸走所有多余的溶液。完全去除液体所需的时间取决于溶液的粘度和母液成分(图3B)。</li>
		<li>吸走所有液体后,轻轻缩回纸芯。记住下降的位置,因为它可能不可见后去除母液。</li>
		<li>采用标准移液器,以应用少量低温保护剂溶液,最大。3 μL,使用挤出尖端(例如,凝胶加载尖端)穿过同一孔。一旦液体被分配,收回尖端。黄色箔的孔隙度允许扩散到箔上。实现晶体的低温保护的时间在很大程度上取决于所使用的溶液及其组件。</li>
		<li>要重新密封自愈 COC 箔,请轻轻地将受保护的手指放在孔上约 1 s,然后滑过穿刺。轻微的压力与高温相结合将促进穿刺的重新密封,而穿刺不会太大。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
连体浸泡 注:在配体浸泡之前,可能会去除多余的母液。为此,请按照 4.1.1 到 4.1.3 中描述的步骤操作。<ol>
<li>将母液中的配体溶解在反应管中所需的浓度中。</li>
		<li>在 12,000 x g下旋转溶液 10 分钟,以去除不溶性颗粒。如果需要,请使用温度控制的离心机。</li>
		<li>轻轻放置最大音量。3 μL 含配体溶液在COC箔和聚酰亚胺薄膜之间的间隙使用长,挤压移液头。收回尖端。</li>
		<li>要重新密封自愈 COC 箔,请轻轻地将受保护的手指放在孔上约 1 s,并将其滑过穿刺(另见 4.1.5)。</li>
		<li>孵育实验一段时间,以便扩散在膜上。浸泡时间在很大程度上取决于扩散溶液及其分量的粘度29。</li>
		<li>多次重复步骤 4.2.1 到 4.2.5,以随后浸泡不同的配体。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 环境温度下的原位衍射数据收集
注:为了尽量减少溶剂散射,在收集数据之前去除多余的溶液。
<ol><li>确保稳定湿度控制的梁线环境,具有预先确定的条件30。</li>
	<li>用钳子轻轻提起指定点的透明 COC 箔,然后剥去,就像从酸奶杯上取下盖子一样(图 6B)。</li>
	<li>轻轻地将样品架从腔中取出,并立即将其插入预先准备的磁性样品支架底座中。此步骤无需胶水 (图 6B)。</li>
	<li>施加轻柔的压力,确保样品架在底座内正确定位。</li>
	<li>将样品支架安装在横梁线测角仪上,确保支架正确定位。根据测角仪几何形状,样品支架可旋转多达 160°,而不会在衍射实验期间造成任何阴影。</li>
	<li>使用纸芯,轻轻触摸背面的黄色聚酰亚胺箔,去除多余的母液。请注意,在那个阶段,配体浸泡或冷冻保护也可以执行。该示例现已准备好进行居中和衍射数据收集。</li>
	<li>当使用带有可拆卸外圈的样品支架时,通过抓住外圈施加温和的压力,并在指定的断点处将其断开(图6C)。该示例现已准备好进行居中和衍射数据收集。</li>
</ol>6. 低温现场衍射数据收集
注:建议执行步骤 4.1.1,从样品中取出残留的母液。到 4.1.3。在继续后续步骤以尽量减少溶剂散射之前。大多数样品可以转移到液氮没有事先的低温保护31。如果需要低温保护,请参阅步骤 4.1.1。到 4.1.5。
<ol><li>用钳子轻轻提起指定点的 COC 箔并将其剥下(参见步骤 5.1.2)(图6A)。</li>
	<li>将样品架从腔体上取下,并将其安装在磁性样品支架底座上。为确保正确和紧密的接头,可以施加温和的压力(参见步骤 5.1.5,图6B)。 注: 对称排列的指定断点允许通过施加温和压力轻松拆下样品架的外圈(参见步骤 5.1.8.,图6C)。现在,样品架已准备就绪,可放入液氮中。样品支架类型 2 和 3 的几何形状(图 1B,1C ) 允许将其传输到标准 SPINE 样品小瓶中,可用于机器人辅助样品安装(图 6D)。</li>
</ol>

<ol>
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Helmholtz-Zentrum Berlin 已提交有关报告的样品持有人的专利申请,其注册号和注册日期为德国专利商标局:DE 10 2018 129 125.6,注册日期为 11 月 20 日2018年,DE 10 2018 125 129.7,注册日期2018年10月11日;DE 10 2017 129 761.8,注册日期2017年12月13日。随后通过PCT途径,使用DE 10 2017 129 761.8的优先权,PCT/DE2018/101007提出了后续的国际专利申请。2018年12月6日,一家编号为DE 20 2018 106955.1的实用新型注册。样品架已由德国耶拿耶拿的耶纳生物科学公司以XtalTool和XtalTool/HT的商号上市。

适合结晶实验。新的样品支架可用于标准悬垂结晶实验,使用 24 孔林布罗型板(类型 1 和 2)或 24 孔 SBS 封装板,其中每个孔的直径为 18 mm(类型 3)。它们可用于代替标准显微镜盖滑。无定形的 COC 箔可确保系统的密封性。由于使用了高净度箔,因此可以使用透射光显微镜对结晶实验进行监测。据我们所知,24孔结晶板没有其他样品架,这将允许晶体操作或衍射实验,而无需机械地从晶体滴中取出晶体,在其中生长。这一点特别重要,因为该领域的许多研究人员仍然依赖这种晶板进行晶体优化,因为与 96 孔坐落板相比,可以使用更大的滴量。有了这些较大的落差,可以获得更大的晶体。
适合晶体操作。由于外部COC箔的自愈特性和内黄色聚酰亚胺箔的微孔结构,晶体环境是可访问的,晶体可以在不机械地将它们转移到其他容器的情况下进行操作。这使得样品架非常方便。我们所知道的唯一一个允许这种间接和温和地访问晶体的系统是水晶直系统26。然而,CrystalDirect 的弹性较低,因为必须使用特殊的 96 孔结晶板。晶体生长的箔与密封结晶实验相同,不能自愈。这意味着,通过激光消融将配体或冷冻保护剂输送到晶体的孔径将保持开放,增加液体蒸发的机会。这与我们的设计形成鲜明对比,即使 COC 箔多次被刺穿,晶体也不会直接暴露在环境中。
适合在环境温度下进行原位衍射实验。样品架可以以直前的方式从结晶板上取出,卡在磁基上,并放在横梁测角仪上。对于室温下衍射实验,建议将样品放入规定湿度33的气流中。在将样品支架放在测焦仪上之前,可以去除晶体周围的母液,以减少背景散射。这种设置在几个小时里是稳定的。
用于操作和储存的所用材料的适用性,在 100 K。用于生产样品架的材料和聚酰亚胺薄膜均不会因冷却至34低温而受到不利影响。因此,在低温(例如 100 K)下使用样品架不会造成严重问题。
适合在100K下进行原位衍射实验。在氮流中,在 100 K 处收集数据时,样品架需要像前一段一样从结晶板上移除,卡在磁基上,并放入横梁测角仪上 100 K 的气态氮流中。如果需要,样品也可能受到低温保护,尽管对于裸体样品来说,这可能在多数情况下可能没有必要。对于 100 K 的实验,2 型和 3 型样品支架更适合于外部塑料环。因此,它们的大小较小,因此应不太容易结冰。但是,即使可以使用类型为 1 的样本保持体。在实验小屋中,如果湿度不是太高,并且支架的低温系统结冰不是真正的问题。
限制。样品持有人的几何形状允许通过旋转方法在 160° 的总旋转范围内进行无阻碍的衍射数据收集。这就足够了,因此大多数晶体系统都可以获得完整的衍射数据集。在无法这样做的情况下,需要将来自多个晶体的数据合并在一起。当晶体一起生长时,可以调整事件X射线束的大小,以便只暴露单个晶体的一部分。在极端情况下,可能需要采用类似于 MeshAndCollect 方法35的数据收集策略。总之,虽然与样本持有者有某些限制,但在大多数情况下可以克服这些限制。当然,总是有可能遇到这种情况,而这种情况是不可能实现的。在这种情况下,可能需要采用其他晶体安装方法。
我们描述了一种用于大分子晶体学的新型样品支架,并证明了样品持有人对各种应用的适用性。考虑到蛋白质晶体的简单和可重复的处理,以及样品持有人的独特特性,我们相信这些样品持有者将被证明是大分子样品持有者库的宝贵补充晶体。

生物大分子三维结构的知识是所有基础生物、生物化学和生物医学研究的重要基石。这甚至延伸到此类研究的某些翻译方面,例如药物发现。在原子分辨率X射线晶体学中获取这种三维信息的所有方法中,最有力、最突出的方法就是X射线所贡献的,这一事实证明了这一点,即90%的现有结构信息是由X射线贡献的。晶体学1.X射线晶体学的主要先决条件是必须为衍射实验制作和制备衍射质量晶体,这也是它的主要局限性。此步骤仍然是该方法的主要瓶颈之一。
从历史上看,蛋白质晶体的衍射数据是在环境温度下收集的。在收集数据之前,将个别晶体小心地转移到玻璃或石英毛细血管中,将母液添加到毛细血管中,使晶体不会变干,毛细血管被密封2、3、 4.自20世纪80年代以来,由于X辐射的电离特性和大分子晶体的辐射灵敏度,在环境温度下的数据收集对该方法构成了严重限制, 这一点越来越明显。因此,我们开发了一些方法,通过将大分子晶体冷却到100K来减轻辐射损伤的影响,并在这种低温下收集衍射数据5,6。在低温下工作,由于传热率低,将样品安装在毛细血管中变得不切实际。尽管如此,人们仍在努力使用毛细血管,特别是反扩散结晶实验,进行低温衍射工作7、8,但不管怎样,它还是成为标准在大分子晶体学中,将母液的薄膜在薄线环9、10中安装大分子晶体。尽管随着时间推移,这种基于环的安装进行了一些改进(例如,引入平版环和类似结构11),但1990年代初阶段制定的基本原则至今仍在使用。可以有把握地说,目前大分子晶体上的大多数衍射数据收集仍然依赖于这种方法5。
随着时间的推移,基于循环的安装方法出现了一些有趣的新发展,并作了修改,但这些方法迄今尚未在社区中得到广泛采用。一个是所谓的无环安装晶体,这是开发实现较低的背景散射12,13,14。另一个是使用石墨烯护套来包装晶体样品,并保护它们不干燥。石墨烯是一种非常适合这方面的材料,因为它的X射线散射背景非常低15。
最近,样品装载领域的开发主要侧重于标准化装载,目的是提高样品吞吐量16或设计可容纳多个样本17的装载,例如硅框架上的图案膜,能够保存数百个小晶体,主要在序列晶体学领域18,19,20,21,22。
到目前为止讨论的所有样品安装方法仍然需要一定程度的手动干预,这意味着存在对样品造成机械损坏的固有危险。因此,通过工程化样品环境,可以收集晶体的衍射数据,从而在其生长环境中收集新的方法。其中一种方法称为原位或板筛选23,24,它已经在全球25个同步辐射源的一些大分子晶体学束线上实施。然而,这种方法的使用受到晶体板的几何参数和仪器采样点周围可用空间的限制。
然而,在所谓的水晶定向系统26中,另一种方法也实现了。在这里,整个结晶滴是自动收获的。晶体生长的箔是使用激光定制切割,并直接用作样品架27。
在本文介绍的工作中,目的是开发一个样品保持架,允许用户将晶体样品从生长室移动到数据收集设备,而无需接触它,从而使用户能够轻松操作样品。由于大分子晶体学领域的许多研究人员仍在使用 24 孔结晶格式,通过修改大型筛选活动中确定的条件来优化晶体生长,因此新样品保持器被设计为与此格式兼容。在下面,将描述新样品架的设计,并演示样品保持器对原位数据收集和配体浸泡的处理和性能。最后,将讨论新样品持有人的适用性及其对各种工作步骤的限制。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1167px;" width="1167">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">AF Satetiss</td>
			<td style="width:253px;">RS Components</td>
			<td style="width:207px;">101-5738</td>
			<td style="width:485px;">lint-free paper, multiple retailer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:221px;">Cannula</td>
			<td style="width:253px;">Dispomed Neoject</td>
			<td style="width:207px;">25 G 5/8&#34; 0.5 x 16, Ref:10026</td>
			<td>multiple retailer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">COC foil</td>
			<td style="width:253px;">HJ-Bioanalytik GmbH</td>
			<td style="width:207px;">900360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:221px;">ComboPlate</td>
			<td style="width:253px;">Greiner Bio-one / Jena Bioscience</td>
			<td style="width:207px;">662050 / CPL-131</td>
			<td>pre-greased plate, multiple retailer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Cryo Vials</td>
			<td style="width:253px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:207px;">CV-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Eppendorf Research Plus&#160;</td>
			<td style="width:253px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:207px;">3123000012</td>
			<td>0.1 - 2.5 &#181;L volume</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Eppendorf Tubes</td>
			<td style="width:253px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:207px;">30125150</td>
			<td>1.5 mL g-Safe Eppendorf Quality, manufacturer reference number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Forceps Usbeck</td>
			<td style="width:253px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:207px;">10750313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">GELoader Eppendorf Quality</td>
			<td style="width:253px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:207px;">30001222</td>
			<td>extruded&#160; tips (0.2 - 20 &#181;L), manufacturer reference number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Magnetic CryoVials</td>
			<td style="width:253px;">Molecular Dimension</td>
			<td style="width:207px;">MD7-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Microfuge Thermo</td>
			<td style="width:253px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;">R21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Paper wicks</td>
			<td style="width:253px;">dental2000</td>
			<td style="width:207px;">64460</td>
			<td>Set of paper wicks, multiple retailer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Rotiprotect Nitril-eco&#160;</td>
			<td style="width:253px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:207px;">TC14.1</td>
			<td>powder free, multiple retailer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">SuperClear Plates</td>
			<td style="width:253px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:207px;">CPL-132</td>
			<td>pre-greased plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">UHU super glue</td>
			<td style="width:253px;">UHU GmbH &#38; Co KG</td>
			<td style="width:207px;">45545</td>
			<td>manufacturer reference number, multiple retailer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">VeroBlackPlus</td>
			<td style="width:253px;">Alphacam</td>
			<td style="width:207px;">OBJ-40963</td>
			<td>manufacturer reference number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">XtalTool&#160;</td>
			<td style="width:253px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:207px;">X-XT-101</td>
			<td>sample holder set</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">XtalTool HT</td>
			<td style="width:253px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:207px;">X-XT-103 / X-XT-104</td>
			<td>SPINE compatible sample holder set</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">XtalToolBases</td>
			<td style="width:253px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:207px;">X-XT-105</td>
			<td>Magnetic sample holder bases set</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an all-in-one sample holder for macromolecular x-ray crystallography with minimal background scattering

大分子X射线晶体学(MX)是获取高分辨率生物大分子三维知识的最显性方法。该方法的前提是,需要从大分子中生长高有序的晶体标本,然后需要为衍射实验做好准备。此制备过程通常涉及从溶液中去除晶体,在溶液中生长,将晶体浸泡在配体溶液或冷冻保护剂溶液中,然后将晶体固定在适合实验的底座上。这个过程的一个严重问题是,大分子晶体往往是机械不稳定和相当脆弱。因此,处理这种易碎晶体很容易成为结构确定尝试的瓶颈。施加在这种精密晶体上的任何机械力都可能干扰分子的常规包装,并可能导致晶体的衍射力丧失。在这里,我们提出了一种新颖的一体式样品保持器,它是为了最小化晶体的处理步骤,从而最大限度地提高结构测定实验的成功率而开发的。样品架通过更换常用的显微镜盖滑,支持晶体滴的设置。此外,它允许就地晶体操作,如配体浸泡,低温保护和复杂的形成,没有任何结晶腔的开口,没有晶体处理。最后,设计了样品架,以便能够在环境温度和低温温度收集原位X射线衍射数据。通过使用这个样品保持架,由于不再需要直接晶体处理,从结晶到衍射数据收集的晶体在传输途中受损的机会大大降低。

样品支架类型 1 经过设计,使其适合 24 孔林布罗式板的井。每个单独的样品支架都包含外缘两侧的定位辅助装置,以确保在井缘上实现最佳定位(图1A,图2A)。最大体积 2 μL 的最多三个单独的结晶滴可放置在黄色聚酰亚胺箔上(图 2B)。对于类型 2 和 3 的样品支架,建议设置最大体积 2 μL 的最大两滴。24 个样品支架可安装在一个 24 孔林布罗板上(图 3D)。
利用样品架1对24孔林布罗板进行了结晶实验。1 μL 母鸡蛋清液化溶液 (15 mg/mL) 与样品架上黄色聚酰亚胺箔上的 1 μL 母液混合,其中 50 mM NaAc pH 4.7、500 mM NaCl 和 25% (w/v) PEG-6000 样品架上的黄色聚酰亚胺箔(表 1)。在293K与500 μL的母液和40-50μm大小的晶体在293K时平衡,5小时后观察到(图4)。水晶生长可以用透射光显微镜(图4)观察,无论是否带有偏振器。高透明度薄膜确保使用传统的光学显微镜或自动晶体成像系统对晶体生长条件进行最佳观察和监测。未测试使用紫外光的晶体生长观察。
从晶体周围取出母液后,从结晶板上取出一个带有母鸡蛋清液化晶体的样品架,放置在HZB-MX光束线14.332上的湿度控制气流中。在环境温度下以 1°为增量收集衍射数据,使用 150 μm 光束,以 13.8 keV 能量,4 x 1010 光子/秒,每幅图像的曝光时间为 5 s。典型的衍射图像如图5所示。在衍射图像上检测不升高的背景散射。表2列出了进一步的实验细节以及相关的数据处理统计数据。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59722/59722fig1.jpg"> 图 1:新样本持有者的原理图视图。样品支架由黑色塑料支架组成,外侧覆盖着非晶环烯烃共聚物 (COC) 箔。此箔(蓝色颜色)高度透明和自我修复。它还保证了实验的气密性。内箔(黄色颜色)由生物惰性聚酰亚胺制成,X 射线高度透明。在此箔上,可以放置结晶滴。样品架的外缘包含由红色箭头(面板A)指示的两个定位辅助装置,允许将样品支架精确放置在结晶板的各个预润滑腔上。(A) 样品支架(类型 1),直径为 22 mm,带有固定的外部支撑环。(B) 样品支架(2型),直径为22毫米,带可拆卸外部支撑环。(C) 样品支架(类型 3),直径为 18 mm,带可拆卸外部支撑环。后两种功能已开发出来,使用 SPINE 标准的自动样品安装机器人,以高通量方式使用它们。指定的断点由面板B中的红色箭头突出显示。面板C中的黑色箭头表示定位标记。在生产过程中,黄箔外周突出的销是对齐聚酰亚胺箔所必需的。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59722/59722fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59722/59722fig2.jpg"> 图 2:样品架可用于 24 孔林布罗板,其方式与常用的显微镜盖滑道相同。它密封空腔密封。定位辅助装置可确保样品支架正确定位在型腔上(面板A中的红色箭头 )。最多三个单独的滴可以放置在1型样品架(面板B),而建议的最大滴数放在类型2或3样品支架上是两个。每滴的最大推荐音量为2 μL。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59722/59722fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59722/59722fig3.jpg"> 图 3:24 类型 1 样品支架适合 24 孔板。样品支架可以放置在 24 孔板上的两个方向上,如所示(面板D)。用管子刺穿后COC箔,通过使用轻轻插入同一孔(面板B)的纸芯,从结晶滴(面板A和C)中去除多余的酒。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59722/59722fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59722/59722fig4.jpg"> 图 4: 通过配备偏振器的透射显微镜观察的母鸡蛋清酶晶体图像。单个晶体很容易从沉淀的蛋白质溶液中区分。此图像中的晶体平均大小为 40 μm x 50 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59722/59722fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59722/59722fig5.jpg"> 图 5:样品架上生长的酶晶体的典型X射线衍射图像。在接触X光之前,所有多余的母液从晶体周围被去除。在电子存储环 BESSY II32的 BL14.3 环境温度下收集了衍射数据,使用湿度控制的样品环境,相对湿度为 97.5%。由于样品支架,无法观察到高架背景。图像中的虚线表示分辨率环。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59722/59722fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59722/59722fig6.jpg"> 图 6: 样品保持架为衍射数据收集做好准备。首先,使用钳子轻轻抬起 COC 薄膜,然后剥离(面板A)。随后,样品架从腔中取出,插入磁基的中心孔,直到标记(面板B)指示。通过抓住中央部分,对外圈施加轻柔压力,使用对称排列的指定断点(面板C) 释放中心部件。去除后,样品架可放入液氮中,并转移到标准SPINE小瓶中。例如,在圆盘中放置它们,它们可以被运送到同步加速器站点,在那里自动样品安装机器人将它们识别为常规样品(面板D)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59722/59722fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>结晶细节</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>方法</td>
			<td>悬滴,蒸汽扩散法</td>
		</tr>
<tr>
<td>板类型</td>
			<td>超透明板</td>
		</tr>
<tr>
<td>温度 (K)</td>
			<td>293</td>
		</tr>
<tr>
<td>蛋白质浓度 (毫克 mL-1)</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>储层溶液的组成</td>
			<td>50 mM NaAc pH 4.7, 500 mM NaCl, 25 % (带/v) PEG-6000</td>
		</tr>
<tr>
<td>体积和下降率</td>
			<td>2 μL 总值,1:1 比率(蛋白质 : 母液</td>
		</tr>
<tr>
<td>储层体积</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>孵育时间</td>
			<td>12 小时</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:所述结晶实验的实验细节。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>数据收集和处理</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>波长 (*)</td>
			<td>0.89429</td>
		</tr>
<tr>
<td>温度 (K)</td>
			<td>293</td>
		</tr>
<tr>
<td>探测器</td>
			<td>雷诺 MX225 CCD</td>
		</tr>
<tr>
<td>晶体探测器距离(毫米)</td>
			<td>120</td>
		</tr>
<tr>
<td>每个图像的旋转范围 (*)</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>总旋转范围 (*)</td>
			<td>120</td>
		</tr>
<tr>
<td>每个图像的曝光时间(s)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>空间组</td>
			<td>P43212</td>
		</tr>
<tr>
<td>单元单元参数 (+)</td>
			<td>a = 79.01,b = 79.01,c = 37.95</td>
		</tr>
<tr>
<td>摩萨里(*)</td>
			<td>0.07</td>
		</tr>
<tr>
<td>分辨率范围 (+)</td>
			<td>39.50 - 1.35 (1.37 - 1.35)</td>
		</tr>
<tr>
<td>反射总数</td>
			<td>191940 (8932)</td>
		</tr>
<tr>
<td>唯一反射数</td>
			<td>27020 (1292)</td>
		</tr>
<tr>
<td>完整性(%)</td>
			<td>99.88 (99.20)</td>
		</tr>
<tr>
<td>多样性</td>
			<td>7.1 (6.9)</td>
		</tr>
<tr>
<td>平均 I/+(I)</td>
			<td>15.0 (1.9)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmeas35 (%)</td>
			<td>6.3 (107.0)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rpim36 (%)</td>
			<td>2.4 (40.4)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC1/237 </td>
			<td>99.9 (68.5)</td>
		</tr>
<tr>
<td>伊萨38
</td>
			<td>16.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>威尔逊 B 因子 ( #2)</td>
			<td>17.0</td>
		</tr>
</tbody></table>表2:衍射数据收集和处理统计。

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An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

用于大分子 X 射线晶体学的一体式样品支架,具有最小的背景散射

提出了一种用于大分子X射线晶体学的新型样品架以及合适的处理方案。该系统允许在环境温度和低温温度下采集晶体生长、晶体浸泡和原位衍射数据,无需任何晶体操作或安装。

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

该样品架可用于生长晶体和收集 X 射线衍射数据。该样品架用于 MX 社区广泛使用的 24 孔板。非常重要的方面是不需要操作。此处描述的这些方面的样品支架以前并不存在。看到某样东西总是比仅仅阅读它好得多。通过观看视频，潜在用户可以立即掌握新样品支架的特征和复杂之处。首先，使用潮湿的无绒布创建清洁无尘的表面。从包装盒中取出一个样品支架，轻轻将其、朝上、在干净的表面上放置，以避免背面 COC 箔损坏或不必要的穿刺。在黄箔上设置结晶滴，就像在常用盖幻灯片上一样。轻轻地放置水滴，以避免使用移液器使箔有任何破裂或穿孔。在类型 2 和类型 3 样品支架上，建议最大两滴。在 1 型样品架上，最多可以放置三滴。翻转样品架，并放在 24 孔林布罗式板的预润滑腔上。使用样品架的定位辅助工具将其引导到最佳位置。确保样品架的正确位置，以避免不必要的蒸发。通过将结晶板置于透光显微镜下，不带偏振器，监测晶体生长，不受实验任何干扰。在透光显微镜下进行低温保护。使用细管轻轻刺穿外部 COC 箔。确保内部黄色箔保持不变。穿刺应该就在要操纵的掉落旁边。在戳孔中插入一个细纸芯。小心地向前推灯芯，直到它接触黄色聚酰亚胺箔。保持灯芯与穿孔箔接触。灯芯将吸走所有多余的溶液。完全去除液体所需时间取决于溶液的粘度和母液成分。所有的液体被吸走后，轻轻地缩回纸芯。记住掉落的位置，因为去除母液后可能看不到。采用标准移液器，使用挤出的尖端穿过同一孔，应用少量低温保护液。要重新密封自愈 COC 箔，请轻轻地将受保护的手指放在孔上约一秒钟，然后滑过穿刺。与高温相结合的轻微压力将促进不太大的穿刺重新密封。将母液中的配体溶解在反应管中所需的浓度中。在12，000倍g下旋转溶液10分钟，以去除不溶性颗粒。如果需要，请使用温度控制的离心机。使用长、挤出的移液器尖端，在 COC 箔和聚酰亚胺薄膜之间的间隙中轻轻放置最多三升含配体溶液;收回尖端。要重新密封自愈 COC 箔，请轻轻地将受保护的手指放在孔上约一秒钟，然后滑过穿刺。孵育实验一段时间，允许扩散到膜上。浸泡时间高度取决于扩散溶液及其组件的粘度。多次重复配体浸泡步骤，随后浸泡不同的配体。为了最大限度地减少溶剂散射，在数据收集之前去除多余的溶液。确保稳定、湿度控制的梁线环境，并具有预先确定的条件。要在环境温度下进行原位衍射数据收集，请用钳子在指定点轻轻提起透明 COC 箔并将其剥离。现在轻轻地将样品架从腔中取出，并立即将其插入预先准备的磁性样品支架底座中。此步骤不需要胶水。施加温和的压力，以确保样品架在底座内正确定位。对于具有可拆卸外圈的样品架，通过按住外圈施加温和压力，并在指定的断点将其断开。该示例现已准备好进行居中和衍射数据收集。将样品架安装在梁线测速仪上，并确保支架的正确定位。根据测光仪几何形状，样品架可旋转多达 160 度，而不会在衍射实验中造成任何阴影。使用纸芯，轻轻触摸背面的黄色聚酰亚胺箔，去除多余的母酒。该示例现已准备好进行居中和衍射数据收集。准备在低温下进行原位衍射数据收集，就像环境温度一样，然后将样品放入液氮中，并转移到与 SPINE 兼容的小瓶中。样品架类型 2 和 3 的几何形状允许将其传输到标准 SPINE 样品瓶中，可用于机器人辅助样品安装。样品架类型 1 和类型 2 已设计为适合 24 井林布罗式板的井。每个单独的样品架在外缘的两侧都包含定位辅助工具，以确保在井缘上获得最佳定位。24井林布罗式板与1型样品架一起使用，以平衡293开尔文与500微升母酒的下降。40 至 50 微米的晶体在 5 小时后使用带或不带偏振器的透光显微镜进行观测。在HZB-MX光束线14.3的湿度控制气流中放置了一个带母鸡蛋清乳酶晶体的样品架。此处显示了典型的衍射图像。无法检测到衍射图像上升高的背景散射。必须避免聚酰亚胺箔的污染。此外，样品支架的定位准确，并小心进行晶体操作，这一点很重要。样品架允许处理非常精密的晶体，这是微分子晶体学中最重要的步骤之一。它的使用大大降低了销毁样品的机会。

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Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

采用自动结晶耦合原位动态光散射的不同尺寸生长蛋白晶体

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

用 X 射线晶体学和生物物理技术表征免疫球蛋白折叠的糖蛋白

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

小角度 x 射线散射溶液中大分子的结构研究

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

使用自动工作站进行质谱测量的等离子体样品制备

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

硅氮化物膜的细胞培养和同步加速器X射线荧光纳米分析的冷冻制备

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X射线晶体学研究热木体马里蒂玛M42氨基肽TmPep1050的寡聚态过渡

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

优化用于连续晶体学实验的内硫肽晶体的生长

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Plant Sample Preparation for Nucleoside/Nucleotide Content Measurement with An HPLC-MS/MS

使用 HPLC-MS/MS 进行核苷/核苷酸含量测量的工厂样品制备

Nucleosides/nucleotides are building blocks of nucleic acids, parts of cosubstrates and coenzymes, cell signaling molecules, and energy carriers, which ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

酶的结晶和结构确定：多功能微流体芯片中串行晶体学的基板复合物

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...