Name: an all-in-one sample holder for macromolecular x-ray crystallography with minimal background scattering
Uploaded: 2019-07-06T14:30:00
Duration: 7 min 55 s
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Les auteurs tient à remercier BESSY II, exploité par Helmholtz-Zentrum Berlin pour l'accès et le support du temps de faisceau, et les départements de l'environnement d'échantillon et de la conception technique pour leur aide à la conception et à la construction et l'accès aux installations d'imprimante 3D.

CAUTION: Pour tous les travaux ultérieurs, il est très important que le papier d'aluminium polyimide de couleur jaune ne doit pas être touché avec des doigts non protégés, en raison de contaminations possibles au porte-échantillon. En outre, l'utilisation de forceps protégés est fortement recommandée.
1. Le porte-échantillon
<ol><li>Utilisez l'un des trois types de porte-échantillons. REMARQUE : Trois versions différentes du nouveau porte-échantillons développés sont présentées à la figure 1. Tous contiennent une structure de soutien en plastique noir, une feuille de COC hermétique à l'extérieur et une feuille de polyimide structurée microporeuse à l'intérieur. Le type 1 (figure 1A) contient un anneau en plastique extérieur fixe, alors que pour les types 2 et 3 (Figure 1B,1C) l'anneau externe peut être rompu mécaniquement aux points de rupture respectifs désignés pour une utilisation dans les systèmes automatisés de transfert d'échantillons (voir rouge flèches dans la figure 1B). La conception des supports d'échantillon permet la configuration de gouttes de cristallisation multiples sur le papier d'aluminium jaune. Il ne compromet pas la surveillance de l'expérience de cristallisation, car le matériau est très transparent pour la lumière visible. Le papier d'aluminium en polyimide de 21 m d'épaisseur est également doté de pores de 5 m, ce qui permet une simple manipulation de cristaux en trempant plus tard. Puisque la transmission des rayons X est proche de 1.0 à toutes les énergies couramment utilisées de collecte de données de diffraction dans la cristallographie macromoléculaire, la contribution du papier d'aluminium à la diffusion de fond dans une expérience de diffraction est négligeable28.</li>
</ol>2. Mise en place de gouttes de cristallisation
<ol><li>Créez une surface propre et sans poussière à l'aide d'un chiffon humide sans résine d'élevage. Prenez un porte-échantillon de sa boîte et placez-le doucement, feuille jaune vers le haut, sur la surface nettoyée pour éviter les dommages ou la perforation non désirée du papier d'aluminium du COC à l'arrière.</li>
	<li>Configurez les gouttes de cristallisation avec un volume maximum recommandé de 2 l sur le papier d'aluminium jaune comme cela se ferait sur les glissières de couverture couramment utilisées. Placer délicatement les gouttes pour éviter toute rupture ou perçage du papier d'aluminium à l'aide d'une pipette. Sur un échantillon de type 1 (figure 2A) jusqu'à trois gouttes peuvent être placées, tandis que sur les porte-échantillons de type 2 et 3, deux gouttes sont le maximum recommandé (figure 2C).</li>
	<li>Retournez le support de l'échantillon et placez-le sur une cavité prégraissée d'une plaque de style Linbro de 24 puits. Utilisez les aides de positionnement (voir flèches rouges dans la figure 1A) du support de l'échantillon pour le guider vers sa position optimale.</li>
	<li>Assurer la bonne position du titulaire de l'échantillon afin d'éviter l'évaporation non désirée (figure 2A).</li>
</ol>3. Observer la croissance des cristaux
<ol><li>En plaçant la plaque de cristallisation sous un microscope à transmission légère, avec ou sans polariseurs, surveillez la croissance des cristaux sans aucune perturbation de l'expérience (Figure 4).</li>
	<li>Lorsque vous utilisez les plus petits porte-échantillons de 18 mm de type 3 (figure1C),qui ont été conçus pour être utilisés sur les plaques d'empreinte SBS, utilisez un robot d'imagerie capable de manipuler des plaques d'empreinte SBS pour surveiller la croissance des cristaux d'une manière plus automatisée.</li>
</ol>4. Manipulation de cristal
REMARQUE : Il est recommandé d'effectuer toutes les étapes suivantes sous un microscope à transmission légère.
<ol><li>
Cryo-protection
	<ol>
<li>Percer délicatement le papier d'aluminium extérieur du COC à l'aide d'une canule fine. Assurez-vous que la feuille jaune intérieure reste intacte. La ponction doit être juste à côté de la goutte qui doit être manipulée (Figure 3A,3C).</li>
		<li>Utilisez une mèche de papier fin et insérez-la dans le trou percé. Poussez soigneusement la mèche vers l'avant jusqu'à ce qu'elle touche le papier d'aluminium jaune. Gardez la mèche en contact avec le papier d'aluminium perforé. La mèche aspirera toute solution excédentaire. Le temps requis pour l'enlèvement complet des liquides dépend de la viscosité des solutions et de la composition de l'alcool mère (figure 3B).</li>
		<li>Après que tout le liquide soit aspiré loin, rétractez doucement la mèche de papier. Rappelez-vous la position de la baisse, car il peut ne pas être visible après l'enlèvement de l'alcool mère.</li>
		<li>Prenez une pipette standard pour appliquer un petit volume de solution cryo-protectrice, max. 3 L, à l'aide d'une pointe extrudée (p. ex. une pointe de chargement de gel) à travers le même trou. Une fois que le liquide est distribué, rétractez la pointe. La porosité du papier d'aluminium jaune permet la diffusion à travers le papier d'aluminium. Le temps d'atteindre la cryo-protection de vos cristaux dépend fortement de la solution employée et de ses composants.</li>
		<li>Pour refermer le papier d'aluminium coC auto-guérison, placez délicatement un doigt protégé sur le trou pendant environ 1 s et faites-le glisser sur la ponction. La légère pression combinée à la température élevée favorisera le resséquage des crevaisons, qui ne sont pas trop grandes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ligand trempage REMARQUE : L'excès d'alcool maternel peut être enlevé avant le trempage de ligand. Pour ce faire, suivez les étapes décrites dans 4.1.1 à 4.1.3.<ol>
<li>Dissoudre le ligand dans l'alcool de mère dans la concentration désirée dans un tube de réaction.</li>
		<li>Faites tourner la solution pendant 10 minutes à 12 000 x g afin d'éliminer les particules insolubles. Utilisez une centrifugeuse à température contrôlée si nécessaire.</li>
		<li>Placer délicatement un volume de max. 3 L de ligand contenant la solution dans l'espace entre le papier d'aluminium de COC et le film de polyimide utilisant une longue pointe de pipet extrudée. Retirez la pointe.</li>
		<li>Pour refermer le papier d'aluminium coC auto-guérison, placez délicatement un doigt protégé sur le trou pendant environ 1 s et faites-le glisser sur la ponction (voir aussi 4.1.5).</li>
		<li>Incuber l'expérience pendant un certain temps afin de permettre la diffusion à travers la membrane. Le temps de trempage dépend fortement de la viscosité de la solution de diffusion et de ses composants29.</li>
		<li>Répétez les étapes 4.2.1 à 4.2.5 plusieurs fois pour ensuite tremper différents ligands.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Collecte in situ de données de diffraction à température ambiante
REMARQUE : Afin de minimiser la diffusion des solvants, retirez la solution excédentaire avant la collecte de données.
<ol><li>Assurer un environnement de faisceau contrôlé par l'humidité stable avec des conditions préétablies30.</li>
	<li>Soulevez délicatement le papier d'aluminium transparent du COC au point désigné à l'aide de forceps et décollez-le comme on enlèverait le couvercle d'une tasse de yogourt ( figure 6B).</li>
	<li>Soulevez délicatement le support de l'échantillon de sa cavité et insérez-le immédiatement dans une base de support magnétique pré-préparée. Aucune colle n'est nécessaire pour cette étape (Figure 6B).</li>
	<li>Appliquer une pression douce pour assurer le bon positionnement du porte-échantillon à l'intérieur de la base.</li>
	<li>Montez le support de l'échantillon sur un goniomètre à faisceau x de faisceau et assurez-vous un positionnement correct du support. Selon la géométrie du goniomètre, le support de l'échantillon peut être tourné jusqu'à 160 degrés sans provoquer d'ombre pendant l'expérience de diffraction.</li>
	<li>Utilisez une mèche de papier et touchez délicatement le papier d'aluminium jaune en polyimide de l'arrière pour enlever l'excès d'alcool maternel. Veuillez noter qu'à ce stade, le trempage ou la cryoprotection de ligand peut être effectué tout aussi bien. L'échantillon est maintenant prêt pour la collecte de données de centrage et de diffraction.</li>
	<li>Lorsque vous utilisez un porte-échantillon avec un anneau extérieur amovible, appliquez une légère pression en vous accrochant à l'anneau extérieur et coupez-le aux points de rupture désignés (figure 6C). L'échantillon est maintenant prêt pour la collecte de données de centrage et de diffraction.</li>
</ol>6. Collecte de données de diffraction in situ à température cryogénique
REMARQUE : Il est recommandé d'enlever l'alcool maternel résiduel de l'échantillon en effectuant les étapes 4.1.1. à 4.1.3. avant de poursuivre les étapes suivantes pour minimiser la dispersion des solvants. La plupart des échantillons peuvent être transférés à l'azote liquide sans cryoprotection préalable31. Si la cryoprotection est nécessaire, voir les étapes 4.1.1. à 4.1.5.
<ol><li>Soulevez délicatement le papier d'aluminium coC au point désigné à l'aide d'un forceps et décollez-le (voir l'étape 5.1.2) (figure 6A).</li>
	<li>Enlevez le porte-échantillon de la cavité et montez-le sur une base magnétique du support d'échantillon. Une pression douce peut être appliquée afin d'assurer un ajustement correct et serré (voir l'étape 5.1.5, Figure 6B). REMARQUE : Les points de rupture désignés disposés symétriquement permettent d'enlever simplement l'anneau externe du support de l'échantillon en appliquant une pression douce (voir l'étape 5.1.8., Figure 6C). Maintenant, le porte-échantillon est prêt et peut être plongé dans l'azote liquide. La géométrie des types 2 et 3 du porte-échantillon (Figure 1B,1C) permet leur transfert dans des flacons d'échantillons SPINE standard, qui peuvent être utilisés pour le montage d'échantillons assistés par robot (Figure 6D).</li>
</ol>

<ol>
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Section D, Biological Crystallography. 71 (Pt 11), 2328-2343 (2015).</li></ol>

Helmholtz-Zentrum Berlin a déposé des demandes de brevet concernant le titulaire de l'échantillon déclaré avec les numéros d'enregistrement et les dates d'enregistrement suivants auprès de l'Office allemand des brevets et des marques : DE 10 2018 129 125.6, date d'enregistrement 20 novembre e, 2018; DE 10 2018 125 129,7, date d'inscription 11octobre ,2018; DE 10 2017 129 761.8, date d'inscription 13décembre2017. Une demande de brevet international ultérieure par la voie du PCT, en utilisant la priorité de DE 10 2017 129 761.8 a été déposée, PCT/DE2018/101007. L'enregistrement d'un modèle utilitaire au numéro DE 20 2018 106955.1 a été déposé le 6 décembre 2018. Le titulaire de l'échantillon a été commercialisé sous les noms de commerce XtalTool et XtalTool/HT par Jena Bioscience, Jena, Allemagne.

Convient aux expériences de cristallisation. Les nouveaux porte-échantillons peuvent être utilisés pour des expériences standard de cristallisation des gouttes suspendues à l'aide de plaques de type Linbro de 24 puits (types 1 et 2), ou de plaques d'empreinte SBS de 24 puits dans lesquelles chaque puits a un diamètre de 18 mm (type 3). Ils peuvent être utilisés au lieu des feuillets standard de couverture de microscope. La feuille amorphe de COC assure l'étanchéité du système. La surveillance de l'expérience de cristallisation est possible à l'aide d'un microscope à lumière de transmission, en raison de l'utilisation de foils à haute clarté. Au meilleur de notre connaissance, il n'existe aucun autre porte-échantillons pour les plaques de cristallisation de 24 puits, ce qui permettrait des expériences de manipulation ou de diffraction de cristaux, sans enlever mécaniquement le cristal de la goutte, dans laquelle il est cultivé. Ceci est particulièrement important, puisque de nombreux chercheurs dans le domaine comptent encore sur ces plaques pour l'optimisation des cristaux, en raison du fait que de plus grands volumes de chute peuvent être utilisés par rapport aux plaques de 96 puits assis-goutte. Avec ces volumes de chute plus importants, de plus gros cristaux peuvent être obtenus.
Convient à la manipulation de cristal. En raison des propriétés auto-guérison s'auto-guérison du papier d'aluminium externe du COC et de la structure microporeuse du papier d'aluminium polymide jaune intérieur, l'environnement cristallin est accessible et les cristaux peuvent être manipulés sans les transférer mécaniquement à d'autres récipients. Cela rend les porte-échantillons très pratique. Le seul autre système que nous connaissons, qui permet cet accès indirect et doux au cristal, est le système CrystalDirect26. Cependant, CrystalDirect est moins flexible puisque des plaques de cristallisation spéciales de 96 puits doivent être utilisées. Le papier d'aluminium, sur lequel les cristaux poussent, est le même qui scelle l'expérience de cristallisation et il n'est pas auto-guérison. Cela signifie qu'une ouverture qui a été percée dans le papier d'aluminium par ablation au laser pour la livraison de ligand ou cryo-protecteur aux cristaux restera ouverte, augmentant les chances d'évaporation liquide. Cela contraste avec notre conception, où les cristaux ne seront pas directement exposés à l'environnement, même si le papier d'aluminium COC est percé un certain nombre de fois.
Convient aux expériences de diffraction in situ à température ambiante. Le support de l'échantillon peut être retiré de la plaque de cristallisation d'une manière directe, collé sur une base magnétique et mis sur un goniomètre en ligne de faisceau. Pour une expérience de diffraction à température ambiante, il est conseillé de mettre l'échantillon dans un flux d'air d'humidité définie33. L'alcool mère autour du cristal peut être enlevé avant de mettre le support de l'échantillon sur le goniomètre afin de réduire la diffusion de fond. Une telle configuration est stable pendant des heures.
Convient au matériau utilisé pour l'exploitation et le stockage à 100 K. Ni le matériau utilisé pour la production du support de l'échantillon ni le film en polyimide ne sont affectés négativement par leur refroidissement à des températures basses34. Par conséquent, le fait de travailler avec le porte-échantillon à basse température (p. ex., 100 K) ne pose pas de problème grave.
Convient aux expériences de diffraction in situ à 100 K. Pour la collecte de données à 100 K dans un flux d'azote, le titulaire de l'échantillon doit être retiré de la plaque de cristallisation comme dans le paragraphe précédent, collé sur une base magnétique et mis dans un flux d'azote gazeux à 100 K sur un goniomètre de faisceau. Si désiré, l'échantillon peut également être cryo-protégé, bien qu'il soit probable que pour les échantillons nus cela peut ne pas être nécessaire dans la plupart des cas31. Pour les expériences à 100 K, les supports d'échantillon de type 2 et 3 sont mieux adaptés parce que l'anneau en plastique externe peut être enlevé. Par conséquent, ils sont de plus petite taille et devraient donc être moins enclins au givrage. Cependant, même un échantillon de type 1 peut être utilisé. Étant donné une humidité pas trop élevée dans la huche expérimentale et un givrage cryo-système correctement aligné du support n'est pas vraiment un problème.
Des limites. La géométrie du titulaire de l'échantillon permet la collecte de données de diffraction non obstruée par la méthode de rotation sur une plage de rotation totale de 160 degrés. Cela est suffisant pour que des ensembles de données de diffraction complètes puissent être obtenus pour la plupart des systèmes cristallins. Dans les cas où cela n'est pas possible, les données provenant de plus de cristal doivent être fusionnées. Lorsque les cristaux sont cultivés ensemble, il peut être possible d'ajuster la taille du faisceau de rayons X incident de sorte que seules les parties des cristaux individuels sont exposées. Dans les cas extrêmes, il peut être nécessaire de recourir à une stratégie de collecte de données similaire à l'approche MeshAndCollect35. En résumé, bien qu'il y ait certaines limites associées aux détenteurs de l'échantillon, celles-ci peuvent être surmontées dans la plupart des cas. Bien sûr, il est toujours possible que des situations soient rencontrées, dans lesquelles rien de tout cela n'est possible. Dans de tels cas, on peut avoir besoin de recourir à d'autres méthodes de montage de cristal.
Nous avons décrit un nouveau type de support d'échantillon pour la cristallographie macromoléculaire et nous avons démontré la convenance des détenteurs d'échantillon pour diverses applications. Compte tenu de la manipulation simple et reproductible des cristaux de protéines, ainsi que des propriétés uniques des détenteurs d'échantillons, nous croyons que ces détenteurs d'échantillons s'avéreront être un ajout précieux à l'arsenal de détenteurs d'échantillons pour les macromoléculaires Cristallographie.

La connaissance de la structure tridimensionnelle des macromolécules biologiques constitue une pierre angulaire importante dans toute la recherche biologique, biochimique et biomédicale fondamentale. Cela s'étend même à certains aspects translationnels de ces recherches, comme par exemple la découverte de médicaments. Parmi toutes les méthodes pour obtenir de telles informations tridimensionnelles à la cristallographie à rayons X à résolution atomique est la plus puissante et la plus importante, comme en témoigne le fait que 90 % de toutes les informations structurelles disponibles sont fournies par les rayons X. cristallographie1. La principale condition préalable de la cristallographie aux rayons X, qui est en même temps sa principale limitation, est que des cristaux de qualité diffraction doivent être produits et préparés pour l'expérience de diffraction. Cette étape constitue toujours l'un des principaux goulots d'étranglement de la méthode.
Historiquement, les données de diffraction des cristaux protéiques ont été recueillies à la température ambiante. Les cristaux individuels ont été soigneusement transférés dans des capillaires en verre ou en quartz avant la collecte de données, l'alcool de mère a été ajouté aux capillaires de sorte que les cristaux ne se dessèchent pas et les capillaires ont été scellés2,3, 4. Depuis les années 1980, il est devenu de plus en plus évident qu'en raison des propriétés ionisantes du rayonnement X et de la sensibilité imminente aux rayonnements des cristaux macromoléculaires, la collecte de données à température ambiante pose de graves limites à la méthode. Par conséquent, des approches ont été développées pour atténuer les effets des dommages causés par les radiations en refroidissant les cristaux macromoléculaires jusqu'à 100 K et pour recueillir des données de diffraction à une température aussi basse5,6. Pour travailler à basse température, le montage des échantillons dans les capillaires est devenu peu pratique en raison du faible taux de transfert de chaleur. Malgré cela, il y a des efforts continus pour utiliser également des capillaires, en particulier des expériences de cristallisation de contre-diffusion, pour le travail de diffraction à basse température7,8, mais, indépendamment de cela, il est devenu la norme approche dans la cristallographie macromoléculaire pour monter les cristaux macromoléculaires tenus par un mince film de liqueur mère à l'intérieur d'une boucle câblée mince9,10. Même si un certain nombre d'améliorations (p. ex., l'introduction de boucles lithographiques et de structures similaires11)ont été apportées au fil du temps à ce montage en boucle, les principes de base qui ont été élaborés au début des années 1990 sont encore utilisés aujourd'hui. On peut dire sans risque de se tromper que la plupart des collections de données de diffraction sur les cristaux macromoléculaires reposent encore aujourd'hui sur cette approche5.
Au fil du temps, il y a eu de nouveaux développements et modifications intéressants de la méthode de montage en boucle, mais ces approches n'ont pas encore été largement adoptées dans la communauté. L'un est le soi-disant montage sans boucle de cristaux, qui a été développé pour atteindre la diffusion de fond inférieur12,13,14. Un autre est l'utilisation de gaines de graphène pour envelopper les échantillons cristallins et pour les protéger contre le dessèchement. Le graphène est un matériau bien adapté à cet égard en raison de son fond de diffusion de rayons X très faible15.
Plus récemment, les développements dans le domaine des montures d'échantillons ont été principalement axés sur la normalisation des montures dans le but d'augmenter le débit de l'échantillon16 ou sur la conception de montures, qui peuvent contenir plus d'un échantillon17, par exemple membranes à motifs sur un cadre en silicium, qui sont capables de tenir des centaines de petits cristaux principalement dans le domaine de la cristallographie en série18,19,20,21,22.
Toutes les méthodes de montage d'échantillons discutées jusqu'à présent nécessitent encore un certain degré d'intervention manuelle, ce qui signifie qu'il existe un risque inhérent de causer des dommages mécaniques à l'échantillon. Par conséquent, de nouvelles approches sont recherchées par l'ingénierie de l'environnement de l'échantillon de sorte que les données de diffraction des cristaux peuvent être recueillies dans leur environnement de croissance. Une telle méthode est appelée in situ ou plaque-screening23,24 et il est déjà mis en œuvre à un certain nombre de faisceaux de cristallographie macromoléculaire à diverses sources de synchrotron dans le monde 25 . Cependant, l'utilisation de cette méthode est limitée par les paramètres géométriques de la plaque de cristal et l'espace disponible autour du point d'échantillonnage de l'instrument.
Encore une autre approche est réalisée dans le système dit CrystalDirect26. Ici, des gouttes de cristallisation entières sont récoltées automatiquement. Les foils sur lesquels les cristaux ont été cultivés sont taillés sur mesure à l'aide d'un laser et directement utilisés comme support de l'échantillon27.
Dans le travail décrit ici, l'objectif était de développer un support d'échantillon, qui permettrait à un utilisateur de déplacer l'échantillon cristallin de sa chambre de croissance vers le dispositif de collecte de données sans le toucher et qui permettrait à l'utilisateur de manipuler l'échantillon facilement. Étant donné que de nombreux chercheurs dans le domaine de la cristallographie macromoléculaire utilisent encore le format de cristallisation à 24 puits pour optimiser la croissance des cristaux en modifiant les conditions identifiées dans les grandes campagnes de dépistage, le nouveau porte-échantillon a été conçu pour être compatible avec ce format. Dans ce qui suit, la conception du nouveau porte-échantillon sera décrite et la manipulation et le rendement du titulaire de l'échantillon pour la collecte de données in situ et le trempage de ligand seront démontrés. Enfin, la pertinence de ce nouveau titulaire d'échantillon ainsi que ses limites pour les différentes étapes de travail seront discutées.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1167px;" width="1167">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">AF Satetiss</td>
			<td style="width:253px;">RS Components</td>
			<td style="width:207px;">101-5738</td>
			<td style="width:485px;">lint-free paper, multiple retailer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:221px;">Cannula</td>
			<td style="width:253px;">Dispomed Neoject</td>
			<td style="width:207px;">25 G 5/8&#34; 0.5 x 16, Ref:10026</td>
			<td>multiple retailer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">COC foil</td>
			<td style="width:253px;">HJ-Bioanalytik GmbH</td>
			<td style="width:207px;">900360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:221px;">ComboPlate</td>
			<td style="width:253px;">Greiner Bio-one / Jena Bioscience</td>
			<td style="width:207px;">662050 / CPL-131</td>
			<td>pre-greased plate, multiple retailer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Cryo Vials</td>
			<td style="width:253px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:207px;">CV-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Eppendorf Research Plus&#160;</td>
			<td style="width:253px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:207px;">3123000012</td>
			<td>0.1 - 2.5 &#181;L volume</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Eppendorf Tubes</td>
			<td style="width:253px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:207px;">30125150</td>
			<td>1.5 mL g-Safe Eppendorf Quality, manufacturer reference number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Forceps Usbeck</td>
			<td style="width:253px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:207px;">10750313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">GELoader Eppendorf Quality</td>
			<td style="width:253px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:207px;">30001222</td>
			<td>extruded&#160; tips (0.2 - 20 &#181;L), manufacturer reference number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Magnetic CryoVials</td>
			<td style="width:253px;">Molecular Dimension</td>
			<td style="width:207px;">MD7-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Microfuge Thermo</td>
			<td style="width:253px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;">R21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Paper wicks</td>
			<td style="width:253px;">dental2000</td>
			<td style="width:207px;">64460</td>
			<td>Set of paper wicks, multiple retailer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Rotiprotect Nitril-eco&#160;</td>
			<td style="width:253px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:207px;">TC14.1</td>
			<td>powder free, multiple retailer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">SuperClear Plates</td>
			<td style="width:253px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:207px;">CPL-132</td>
			<td>pre-greased plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">UHU super glue</td>
			<td style="width:253px;">UHU GmbH &#38; Co KG</td>
			<td style="width:207px;">45545</td>
			<td>manufacturer reference number, multiple retailer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">VeroBlackPlus</td>
			<td style="width:253px;">Alphacam</td>
			<td style="width:207px;">OBJ-40963</td>
			<td>manufacturer reference number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">XtalTool&#160;</td>
			<td style="width:253px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:207px;">X-XT-101</td>
			<td>sample holder set</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">XtalTool HT</td>
			<td style="width:253px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:207px;">X-XT-103 / X-XT-104</td>
			<td>SPINE compatible sample holder set</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">XtalToolBases</td>
			<td style="width:253px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:207px;">X-XT-105</td>
			<td>Magnetic sample holder bases set</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an all-in-one sample holder for macromolecular x-ray crystallography with minimal background scattering

La cristallographie macromoléculaire de rayon X (MX) est la méthode la plus en avant pour obtenir la connaissance tridimensionnelle à haute résolution des macromolécules biologiques. Une condition préalable à la méthode est que le spécimen cristallin hautement ordonné doit être cultivé à partir de la macromolécule à étudier, qui doivent ensuite être préparés pour l'expérience de diffraction. Cette procédure de préparation implique généralement l'enlèvement du cristal de la solution, dans laquelle il a été cultivé, le trempage du cristal dans la solution ligand ou la solution cryo-protectrice, puis l'immobilisation du cristal sur une monture adaptée à l'expérience. Un problème sérieux pour cette procédure est que les cristaux macromoléculaires sont souvent mécaniquement instables et plutôt fragiles. Par conséquent, la manipulation de ces cristaux fragiles peut facilement devenir un goulot d'étranglement dans une tentative de détermination de la structure. Toute force mécanique appliquée à des cristaux aussi délicats peut perturber l'emballage régulier des molécules et peut entraîner une perte de puissance de diffraction des cristaux. Ici, nous présentons un nouveau porte-échantillon tout-en-un, qui a été développé afin de minimiser les étapes de manipulation des cristaux et donc de maximiser le taux de réussite de l'expérience de détermination de la structure. Le porte-échantillon soutient la configuration des gouttes de cristal en remplaçant les feuillets de couvercle de microscope couramment utilisés. En outre, il permet la manipulation de cristal en place tels que le trempage de ligand, la cryo-protection et la formation complexe sans n'importe quelle ouverture de la cavité de cristallisation et sans manipulation de cristal. Enfin, le porte-échantillon a été conçu afin de permettre la collecte de données in situ de diffraction des rayons X à la fois à température ambiante et cryogénique. En utilisant ce support d'échantillon, les chances d'endommager le cristal sur son chemin de la cristallisation à la collecte de données de diffraction sont considérablement réduites puisque la manipulation directe des cristaux n'est plus nécessaire.

Le support d'échantillon de type 1 a été conçu de sorte qu'il s'adapte sur un puits d'une plaque de style Linbro de 24 puits. Chaque porte-échantillon contient des aides de positionnement de chaque côté de la jante extérieure afin d'assurer un positionnement optimal sur le bord du puits (Figure 1A, Figure 2A). Jusqu'à trois gouttes de cristallisation individuelle de volume maximum de 2 L chacune peuvent être placées sur le papier d'aluminium jaune en polyimide (figure 2B). Pour les détenteurs d'échantillons de types 2 et 3, il est recommandé de fixer un maximum de deux gouttes de volume maximum de 2 L chacun. 24 porte-échantillons peuvent être installés sur une plaque Linbro de 24 puits (figure3D).
Une expérience de cristallisation sur une plaque Linbro de 24 puits utilisant le type 1 du support d'échantillon a été mise en place. 1 l de solution de lysozyme blanc d'œuf (15 mg/mL) a été mélangée à 1 l de liqueur mère comprenant 50 mM NaAc pH 4,7, 500 mM NaCl et 25 % (w/v) PEG-6000 sur le papier d'aluminium jaune sur le support de l'échantillon (tableau 1). La baisse a été acquiétions à 293 K contre 500 L de mère-alcool et des cristaux de la taille 40-50 m ont été observés après 5 heures (Figure 4). La croissance du cristal peut être observée à l'aide d'un microscope à lumière de transmission (Figure 4) avec ou sans polariseur. Les films à haute transparence assurent la meilleure observation et la meilleure surveillance des conditions de croissance des cristaux à l'aide des deux, d'un microscope à lumière conventionnel ou d'un système automatisé d'imagerie cristalline. L'observation de croissance de cristal utilisant la lumière UV n'a pas été examinée.
Après avoir enlevé l'alcool mère autour des cristaux, un porte-échantillon avec des cristaux de lysozyme blanc d'œuf a été prélevé dans la plaque de cristallisation et placé dans un courant d'air contrôlé par l'humidité sur la ligne de faisceau HZB-MX 14.332. Les données de diffraction ont été recueillies à température ambiante par incréments de 1 o- à l'aide d'un faisceau de 150 m à 13,8 keV d'énergie avec 4 x 1010 photons/s et un temps d'exposition de 5 s par image. Une image de diffraction typique est montrée dans la figure 5. Aucune diffusion de fond élevée sur l'image de diffraction ne peut être détectée. D'autres détails expérimentaux ainsi que des statistiques de traitement de données connexes sont énumérés dans le tableau 2.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59722/59722fig1.jpg"> Figure 1 : Vue schématique des nouveaux détenteurs d'échantillons. Les supports d'échantillon se composent d'un support en plastique noir, qui est couvert sur le côté extérieur avec un comère cyclic amorphe (COC) feuille. Ce papier d'aluminium (coloré en bleu) est très transparent et auto-guérison. Il assure également l'étanchéité au gaz de l'expérience. Le papier d'aluminium intérieur (coloré en jaune) est fait de polyimide bio-iner, qui est très transparent pour les rayons X. Sur ce papier d'aluminium, les gouttes de cristallisation peuvent être placées. Le rebord extérieur du support de l'échantillon contient deux aides de positionnement indiquées par la flèche rouge (panneau A), qui permet un placement précis du support de l'échantillon sur la cavité prégraissée individuelle de la plaque de cristallisation. (A) Support d'échantillon (type 1) de 22 mm de diamètre avec un anneau de soutien externe fixe. (B) Support d'échantillon (type 2) avec 22 mm de diamètre avec anneau de soutien externe amovible. (C) Support d'échantillon (type 3) avec 18 mm de diamètre avec anneau de soutien externe amovible. Ces deux derniers ont été développés pour les utiliser de manière à haut débit avec des robots de montage d'échantillons automatisés utilisant la norme SPINE. Les points de rupture désignés sont mis en évidence par les flèches rouges dans le panneau B. La flèche noire dans le panneau C indique le marqueur de positionnement. Les broches saillantes au périmètre extérieur de la feuille jaune sont nécessaires pour aligner le papier d'aluminium de polyimide pendant le processus de production. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59722/59722fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59722/59722fig2.jpg"> Figure 2 : Le porte-échantillon peut être utilisé sur une plaque Linbro de 24 puits de la même manière que les feuillets de couvercle de microscope couramment utilisés. Il scelle la cavité étanche à l'air. Les aides de positionnement assurent le positionnement correct du support de l'échantillon sur la cavité (flèches rouges dans le panneau A). Jusqu'à trois gouttes individuelles peuvent être placées sur un porte-échantillon de type 1(panneau B), alors que le nombre maximum recommandé de gouttes placées sur un porte-échantillon de type 2 ou 3 est de deux. Le volume maximum recommandé pour chaque goutte est de 2 L. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59722/59722fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59722/59722fig3.jpg"> Figure 3 : 24 porte-échantillons de type 1 s'adaptent sur une plaque de 24 puits. Les porte-échantillons peuvent être placés en deux orientations sur la plaque de 24 puits comme indiqué (panneau D). Une canule est utilisée pour percer le papier d'aluminium du COC arrière afin d'éliminer l'excès de liqueur d'une goutte de cristallisation (panneaux A et C) en utilisant une mèche de papier délicatement insérée dans le même trou (panneau B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59722/59722fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59722/59722fig4.jpg"> Figure 4 : Image des cristaux de lysozyme blancs d'oeuf de poule observés par un microscope de transmission équipé d'un polariseur. Les cristaux individuels sont facilement discriminés de la solution de protéine précipitée. Les cristaux de cette image sont d'une taille moyenne de 40 m x 50 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59722/59722fig4large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59722/59722fig5.jpg"> Figure 5 : Image typique de diffraction de rayon X d'un cristal de lysozyme cultivé sur le support d'échantillon. Avant l'exposition aux rayons X, tout l'excès d'alcool maternel était retiré du cristal. Des données de diffraction ont été recueillies à la température ambiante sur BL14.3 à l'anneau de stockage d'électrons BESSY II32 à l'aide d'un environnement d'échantillon contrôlé par l'humidité avec une humidité relative de 97,5 %. Aucun arrière-plan élevé dû aux porte-échantillons ne peut être observé. Les lignes pointillées de l'image indiquent les anneaux de résolution. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59722/59722fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59722/59722fig6.jpg"> Figure 6 : Le titulaire de l'échantillon est préparé pour la collecte de données de diffraction. Tout d'abord, le film COC est soulevé doucement à l'aide d'un forceps, puis décollé (panneau A). Par la suite, le support de l'échantillon est retiré de la cavité et inséré dans le trou central d'une base magnétique jusqu'à indication du marqueur (panneau B). En s'accrochant à la partie centrale, une légère pression est appliquée sur l'anneau extérieur pour libérer la partie centrale à l'aide des points de rupture désignés disposés symétriquement (panneau C). Après l'enlèvement, le porte-échantillon peut être plongé dans l'azote liquide et transféré dans des flacons SPINE standard. Placés, par exemple, dans les rondelles, ils peuvent être transportés vers des sites de synchrotron où les robots de montage automatique s'accumulent comme des échantillons réguliers (panneau D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59722/59722fig6large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Détails de cristallisation</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>méthode</td>
			<td>Chute suspendue, méthode de diffusion de vapeur</td>
		</tr>
<tr>
<td>Type de plaque</td>
			<td>Plaques SuperClear</td>
		</tr>
<tr>
<td>Température (K)</td>
			<td>293, états-unis</td>
		</tr>
<tr>
<td>Concentration protéique (mg mL-1)</td>
			<td>15 Annonces</td>
		</tr>
<tr>
<td>Composition de la solution réservoir</td>
			<td>50 mM NaAc pH 4,7, 500 mM NaCl, 25 % (w/v) PEG-6000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume et ratio de baisse</td>
			<td>2 l au total, 1:1 ratio (protéine : liqueur mère</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume de réservoir</td>
			<td>500 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temps d'incubation</td>
			<td>12 heures</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Détails expérimentaux de l'expérience de cristallisation décrite.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Collecte et traitement des données</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Longueur d'onde (en)</td>
			<td>0,89429</td>
		</tr>
<tr>
<td>Température (K)</td>
			<td>293, états-unis</td>
		</tr>
<tr>
<td>détecteur</td>
			<td>Rayonix MX225 CCD</td>
		</tr>
<tr>
<td>Distance de détecteur de cristal (mm)</td>
			<td>120 Ans et plus</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gamme de rotation par image ()</td>
			<td>0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gamme de rotation totale (MD)</td>
			<td>120 Ans et plus</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temps d'exposition par image (s)</td>
			<td>5 Annonces</td>
		</tr>
<tr>
<td>Groupe spatial</td>
			<td>P43212</td>
		</tr>
<tr>
<td>Paramètres unitaires de cellules (en)</td>
			<td>a 79,01 euros, b 79,01, c 37,95</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mosaïcité (En)</td>
			<td>0,07</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gamme de résolution (en)</td>
			<td>39.50 - 1.35 (1.37 - 1.35)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nombre total de réflexions</td>
			<td>en 191940 (8932)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nombre de réflexions uniques</td>
			<td>27020 (1292)</td>
		</tr>
<tr>
<td>L'exhaustivité (%)</td>
			<td>99,88 (99,20)</td>
		</tr>
<tr>
<td>multiplicité</td>
			<td>7,1 (6,9)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Moyenne I/(I)</td>
			<td>15,0 (1,9)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmeas35 (%)</td>
			<td>6,3 (107,0)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rpim36 (%)</td>
			<td>2,4 (40,4)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC1/237 </td>
			<td>99,9 (68,5)</td>
		</tr>
<tr>
<td>ISa38 Annonces
</td>
			<td>16,1 Annonces</td>
		</tr>
<tr>
<td>Wilson B-facteur(no 2)</td>
			<td>17,0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : Statistiques de collecte et de traitement des données de diffraction.

Watch this Scientific Journal Video about An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering at JoVE.com

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Un porte-échantillon tout-en-un pour la cristallographie macromoléculaire de rayon X avec la diffusion minimale de fond

Un nouveau support d'échantillon pour la cristallographie macromoléculaire de rayon X avec un protocole approprié de manipulation est présenté. Le système permet la croissance des cristaux, le trempage des cristaux et la collecte in situ de données de diffraction à la fois, température ambiante et cryogénique sans avoir besoin de manipulation de cristal ou de montage.

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Ce support d’échantillon peut être utilisé pour la culture de cristaux et la collecte de données de diffraction des rayons X. Ce porte-échantillon a été utilisé sur des plaques de 24 puits qui sont largement utilisées dans la communauté MX. L’aspect très important est qu’il n’y a pas de manipulation nécessaire.Un porte-échantillon comportant ces aspects décrits ici n’existait pas auparavant. Voir quelque chose est toujours beaucoup mieux que de simplement lire à ce sujet. En regardant la vidéo, un utilisateur potentiel peut saisir immédiatement les fonctionnalités et les subtilités du nouveau porte-échantillon.Pour commencer, créez une surface propre et exempte de poussière à l’aide d’un chiffon humide et sans peluche. Prenez un porte-échantillon de sa boîte et placez-le doucement, feuille jaune face vers le haut, sur la surface propre pour éviter les dommages ou la ponction non désirée du papier d’aluminium COC arrière. Installez les gouttes de cristallisation sur le papier d’aluminium jaune comme cela se ferait sur les diapositives de couverture couramment utilisées.Placez doucement les gouttes pour éviter toute rupture ou perçage de la feuille à l’aide d’une pipette. Sur les porte-échantillons de type 2 et 3, deux gouttes sont le maximum recommandé. Sur un porte-échantillon de type 1, jusqu’à trois gouttes peuvent être placées.Retournez le porte-échantillon et placez-le sur une cavité pré graissée d’une plaque de style Linbro de 24 puits. Utilisez les aides au positionnement du porte-échantillon pour le guider vers sa position optimale. Assurez-vous de la position correcte du porte-échantillon afin d’éviter l’évaporation non désirée.En plaçant la plaque de cristallisation sous un microscope à lumière de transmission, sans polariseurs ou sans polariseurs, surveillez la croissance du cristal sans aucune perturbation de l’expérience. Effectuez la cryoprotection au microscope à lumière de transmission. Percer délicatement le papier d’aluminium extérieur COC à l’aide d’une canule fine.Assurez-vous que le papier d’aluminium jaune intérieur reste intact. La ponction doit être juste à côté de la chute qui doit être manipulée. Insérez une mèche de papier fin dans le trou piqué.Poussez soigneusement la mèche vers l’avant jusqu’à ce qu’elle touche le papier d’aluminium polyimide jaune. Gardez la mèche en contact avec le papier d’aluminium perforé. La mèche va sucer toute solution excédentaire.Le temps nécessaire pour l’enlèvement complet du liquide dépend de la viscosité des solutions et de la composition de l’alcool mère. Une fois que tout le liquide est aspiré, retirez doucement la mèche de papier. Rappelez-vous la position de la baisse, car il peut ne pas être visible après l’enlèvement de l’alcool mère.Prenez une pipette standard pour appliquer un petit volume de solution cryo-protectant, à l’aide d’une pointe extrudée à travers le même trou. Pour réséaliser le papier d’aluminium COC auto-cicatrisation, placez doucement un doigt protégé sur le trou pendant environ une seconde et faites-le glisser à travers la perforation. La légère pression combinée à la température élevée favorisera le resealing des perforations qui ne sont pas trop grandes.Dissoudre le ligand dans la liqueur mère dans la concentration désirée dans un tube de réaction. Faites tourner la solution pendant 10 minutes à 12 000 fois g afin d’éliminer les particules insolubles. Utilisez une centrifugeuse à température contrôlée si nécessaire.Placez délicatement un maximum de trois microlitres de solution contenant du ligand dans l’espace entre le papier d’aluminium COC et le film polyimide à l’aide d’une longue pointe de pipette extrudée; rétractez la pointe. Pour réséaliser le papier d’aluminium COC auto-cicatrisation, placez doucement un doigt protégé sur le trou pendant environ une seconde et faites-le glisser à travers la perforation. Incuber l’expérience pendant un certain temps pour permettre la diffusion à travers la membrane.Le temps de trempage dépend fortement de la viscosité de la solution de diffusion et de ses composants. Répétez les étapes de trempage ligand plusieurs fois pour tremper par la suite différents ligands. Pour réduire au minimum la dispersion des solvants, retirez l’excès de solution avant la collecte de données.Assurer un environnement de faisceaux stable et contrôlé par l’humidité avec des conditions prééditées. Pour effectuer la collecte de données de diffraction in situ à température ambiante, soulevez doucement la feuille transparente du COC au point désigné à l’aide de forceps et pelez-la. Maintenant, soulevez doucement le porte-échantillon de sa cavité et insérez-le immédiatement dans une base de support d’échantillon magnétique pré-préparée.Aucune colle n’est nécessaire pour cette étape. Appliquez une pression douce pour assurer le positionnement correct du porte-échantillon à l’intérieur de la base. Pour les porte-échantillons avec un anneau extérieur amovible, appliquez une pression douce en vous accronant à l’anneau extérieur et brisez-le aux points de rupture désignés.L’échantillon est maintenant prêt pour la collecte de données de centrage et de diffraction. Montez le porte-échantillon sur un goniomètre beamline et assurez-vous d’un positionnement correct du support. Selon la géométrie du goniomètre, le support de l’échantillon peut être tourné jusqu’à 160 degrés sans causer d’ombre pendant l’expérience de diffraction.Utilisez une mèche de papier et touchez doucement le papier d’aluminium polyimide jaune de l’arrière pour enlever l’excès de liqueur mère. L’échantillon est maintenant prêt pour la collecte de données de centrage et de diffraction. Préparez-vous à la collecte in situ de données de diffraction à température cryogénique comme cela a été fait pour la température ambiante, puis plongez l’échantillon dans de l’azote liquide et transférez-le dans un flacon compatible AVEC LA COLONNE VERTÉBRALE.La géométrie des types 2 et 3 du porte-échantillon permet leur transfert dans des flacons d’échantillons SPINE standard, qui peuvent être utilisés pour le montage d’échantillons assistés par robot. Le porte-échantillon de type 1 et de type 2 a été conçu pour s’insérer sur un puits d’une plaque de style Linbro de 24 puits. Chaque porte-échantillon contient des aides au positionnement de chaque côté de la jante extérieure afin d’assurer un positionnement optimal sur le bord du puits.Une plaque de style Linbro de 24 puits a été utilisée avec le porte-échantillon de type 1 pour équilibrer une goutte à 293 Kelvin contre 500 microlitres d’alcool mère. Des cristaux de 40 à 50 microns ont été observés après cinq heures à l’aide d’un microscope à lumière de transmission avec ou sans polariseur. Un porte-échantillon avec des cristaux de lysozyme blanc d’œuf de poule a été placé dans un flux d’air contrôlé par l’humidité sur la ligne de faisceau HZB-MX 14,3.Une image typique de diffraction est montrée ici. Aucune diffusion arrière-plan élevée sur l’image de diffraction ne peut être détectée. Il est essentiel d’éviter les contaminations du papier d’aluminium polyimide.De plus, il est important que le porte-échantillon soit positionné avec précision et que la manipulation du cristal soit effectuée avec soin. Le porte-échantillons permet la manipulation de cristaux très délicats, l’une des étapes les plus importantes de la cristallographie micromoléculaire. Son utilisation diminue considérablement les chances de détruire l’échantillon.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combinant la diffractométrie de rayons x avec la diffusion des rayons x petit Angle pour modéliser des régions non structurées de Nsa1 de S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Recherche

Biochimie

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Des cristaux de protéine croissante avec des Dimensions distinctes à l’aide d’automatisé cristallisation couplée avec In Situ diffusion dynamique de la lumière

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Caractérisation des glycoprotéines dont le pli d’immunoglobuline par cristallographie aux rayons x et Techniques biophysiques

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Études structurale des macromolécules en Solution à l’aide de petite diffusion des rayons x Angle

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Préparation d’un échantillon de plasma pour la spectrométrie de masse à l’aide d’un poste de travail automatisé

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

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Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Cristallographie aux rayons X pour étudier la transition oligomérique de l’État de la Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

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Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Optimisation de la croissance des cristaux d’endothiapepsine pour les expériences de cristallographie en série

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

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Préparation d’échantillons de plantes pour la mesure de la teneur en nucléosides/nucléotides avec une CLHP-MS/MS

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Cristallisation et détermination structurale d’une enzyme : complexe de substrat par cristallographie sérielle dans une puce microfluidique polyvalente

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...