Name: an all-in-one sample holder for macromolecular x-ray crystallography with minimal background scattering
Uploaded: 2019-07-06T14:30:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить BESSY II, управляемую Helmholtz-Центрум Берлине для доступа к лучу времени и поддержки, и департаментов образца окружающей среды и технического дизайна за их помощь в проектировании и строительстве и доступ к 3D-принтер объектов.

ПРЕДАУП: Для всех последующих работ очень важно, чтобы фольга желтого цвета полиимида не касалась незащищенными пальцами из-за возможных загрязнений держателя образца. Кроме того, настоятельно рекомендуется использовать защищенные щипки.
1. Держатель образца
<ol><li>Используйте один из трех типов образца держателя. ПРИМЕЧАНИЕ: Три различные версии нового разработанного держателя образца показаны на рисунке 1. Все они содержат черную пластиковую опорную структуру, герметичную фольгу COC снаружи и микропористую структурированную полиимидную фольгу внутри. Тип 1(Рисунок 1A) содержит фиксированное внешнее пластиковое кольцо, в то время как для типов 2 и 3 (рисунок1B,1C) внешнее кольцо может быть разорвано механически в назначенных соответствующих точках разрыва для использования в автоматизированных системах передачи образцов (см. красный стрелки на рисунке 1B). Конструкция оценок образца позволяет настраивать несколько кристаллизуемых капель на желтую полиимидную фольгу. Это не ставит под угрозу мониторинг эксперимента по кристаллизации, так как материал очень прозрачный для видимого света. 21 мкм толщиной полиимидной фольги также имеет 5 мкм поры, что позволяет простой кристалл манипуляции путем замачивания позже. Так как передача рентгеновских лучей близка к 1,0 при всех широко используемых энергиях сбора данных дифракции в макромолекулярной кристаллографии,вклад фольги в фоновое рассеяние в эксперименте дифракции ничтожно мал.</li>
</ol>2. Настройка кристаллизации капель
<ol><li>Создайте чистую и свободную от пыли поверхность с помощью влажной ткани без ворса. Возьмите один образец держателя из коробки и аккуратно поместите его, желтая фольга вверх, на очищенной поверхности, чтобы избежать повреждения или нежелательных прокол задней фольги COC.</li>
	<li>Настройка кристаллизации капель с максимальным рекомендуемый объем 2 л на желтой фольге, как это было бы сделано на широко используемых слайдах покрытия. Поместите капли осторожно, чтобы избежать разрыва или пирсинга фольги с помощью пипетки. На выборке держателя типа 1(рисунок 2A) может быть размещено до трех капель, в то время как на образцах держателей типа 2 и 3 две капли являются рекомендуемым максимумом (рисунок2С).</li>
	<li>Переверните держатель образца и поместите его на предварительно смазанную полость 24-хорошо пластины в стиле Linbro. Используйте средства позиционирования (см. красные стрелки на рисунке 1A) держателя образца, чтобы направить его в оптимальное положение.</li>
	<li>Обеспечьте правильное положение держателя образца, чтобы избежать нежелательного испарения(рисунок 2A).</li>
</ol>3. Наблюдение за ростом кристалла
<ol><li>Поместив пластину кристаллизации под световой микроскоп передачи, с или без поляризаторов, контролировать рост кристалла без каких-либо нарушений эксперимента (Рисунок 4).</li>
	<li>При использовании меньших 18-мм образцов ытачек типа 3(рисунок 1С),которые были разработаны для использования на пластинах SBS след, используйте робота-изображения, способного обрабатывать SBS-след пластин для мониторинга роста кристалла в более автоматизированным способом.</li>
</ol>4. Кристаллическая манипуляция
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется выполнять все последующие шаги под световым микроскопом передачи.
<ol><li>
Криозащита
	<ol>
<li>Аккуратно проткните внешнюю фольгу COC, используя тонкую канюлу. Убедитесь, что внутренняя желтая фольга остается нетронутой. Прокол должен быть рядом с каплей, которым нужно манипулировать(рисунок 3A,3C).</li>
		<li>Используйте тонкий бумажный фитиль и вставьте его в ткнул отверстие. Аккуратно нажмите фитиль вперед, пока он не коснется желтой фольги полиимидов. Держите фитиль в контакте с перфорированной фольги. Фитиль будет сосать все избыточное решение. Время, необходимое для полного удаления жидкости, зависит от вязкости растворов и состава материнского спиртного(рисунок 3B).</li>
		<li>В конце концов жидкость высосана, аккуратно убирать бумажный фитиль. Помните положение капли, так как она не может быть видна после удаления материнского ликера.</li>
		<li>Возьмите стандартную пипетку, чтобы применить небольшой объем криозащитного раствора, макс. 3 ЗЛ, используя экструдированный наконечник (например, наконечник погрузки геля) через то же отверстие. После того, как жидкость распределяется, убирать кончик. Пористость желтой фольги позволяет диффузии через фольгу. Время достижения криозащиты кристаллов во многом зависит от используемого раствора и его компонентов.</li>
		<li>Чтобы запечатать самовосстановление COC фольги, аккуратно поместите защищенный палец на отверстие около 1 с и сдвиньте его через прокол. Небольшое давление в сочетании с повышенной температурой будет способствовать повторной запечатыванию проколов, которые не слишком велики.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Лиганд замачивания ПРИМЕЧАНИЕ: Избыток материнского ликера может быть удален до замачивания лиганда. Для этого следуйте шагам, описанным в 4.1.1 до 4.1.3.<ol>
<li>Растворите лиганду в материнском ликере в нужной концентрации в реакционной трубке.</li>
		<li>Спин раствор в течение 10 минут на 12000 х г для того, чтобы удалить нерастворимые частицы. При необходимости используйте центрифугу, контролируемую температурой.</li>
		<li>Аккуратно поместите объем макс. 3 зл лиганда, содержащего раствор в зазоре между фольгой COC и полиимидной пленкой с помощью длинного, экструдированного наконечника трубача. Уречку кончика.</li>
		<li>Чтобы запечатать самовосстановление COC фольги, аккуратно поместите защищенный палец на отверстие около 1 с и сдвиньте его через прокол (см. также 4.1.5).</li>
		<li>Инкубировать эксперимент в течение некоторого времени для того, чтобы обеспечить диффузию по всей мембране. Время замачивания сильно зависит от вязкости рассеянного раствора и его компонентов29.</li>
		<li>Повторите шаги 4.2.1 до 4.2.5 несколько раз, чтобы впоследствии замочить различные лиганды.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. На месте сбор данных дифракции при температуре окружающей среды
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму рассеяние растворителей, удалите избыток раствора перед сбором данных.
<ol><li>Обеспечить стабильную влажность контролируемой среды луча с заранее установленными условиями30.</li>
	<li>Аккуратно поднимите прозрачную фольгу COC в назначенном пункте с помощью щипц и снимите ее, как можно было бы удалить крышку из чашки йогурта (рисунок 6B).</li>
	<li>Аккуратно поднимите держатель образца из полости и вставьте его сразу в заранее подготовленную магнитную основу держателя образца. Для этого шага не требуется клей(рисунок 6B).</li>
	<li>Применить мягкое давление, чтобы обеспечить правильное позиционирование образца держателя в пределах базы.</li>
	<li>Установите держатель образца на лучного гониометра и обеспечите правильное позиционирование держателя. В зависимости от геометрии гониометра держатель образца может вращаться на 160 градусов, не вызывая никаких затенений во время эксперимента по дифракции.</li>
	<li>Используйте бумажный фитиль и осторожно коснитесь желтой полиимидной фольги с обратной стороны, чтобы удалить излишки материнского ликера. Пожалуйста, обратите внимание, что на этом этапе ligand замачивания или крио-защиты могут быть выполнены так же хорошо. Образец готов к центрированию и сбору данных дифракции.</li>
	<li>При использовании образца держателя со съемным внешним кольцом, применять мягкое давление, держась за внешнее кольцо и разорвать его на назначенных точках разрыва(рисунок 6C). Образец готов к центрированию и сбору данных дифракции.</li>
</ol>6. На месте сбор данных дифракции при криогенной температуре
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется удалить остаточный материнский ликер из образца, выполняя шаги 4.1.1. до 4.1.3. прежде чем приэтом следующие шаги по минимизации рассеяния растворителей. Большинство образцов могут быть переданы в жидкий азот без предварительной криозащиты31. Если необходима криозащита, см. до 4.1.5.
<ol><li>Аккуратно поднимите фольгу COC в назначенной точке с помощью щипц и снимите ее (см. шаг 5.1.2)(рисунок 6A).</li>
	<li>Снимите держатель образца с полости и установите его на основание держателя магнитного образца. Мягкое давление может быть применено для того, чтобы обеспечить правильную и плотную установку (см. шаг 5.1.5, рисунок 6B). ПРИМЕЧАНИЕ: Симметрично расположенные обозначенные точки разрыва позволяют просто удалить внешнее кольцо держателя образца, применяя мягкое давление (см. шаг 5.1.8., рисунок 6C). Теперь держатель образца готов и может быть погружен в жидкий азот. Геометрия образца держателя типов 2 и 3(рисунок 1B,1C) позволяет их передачи в стандартные флаконы образца SPINE, которые могут быть использованы для робота помощь образца монтажа (рисунок6D).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Berman, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protein+Data+Bank.">The Protein Data Bank.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).</li><li>Mac Sweeney, A., D'Arcy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+method+for+mounting+protein+crystals+at+room+temperature.">A simple and rapid method for mounting protein crystals at room temperature.</a> Journal of Applied Crystallography. 36 (1), 165-166 (2003).</li><li>Kalinin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+sample+mounting+technique+for+room-temperature+macromolecular+crystallography.">A new sample mounting technique for room-temperature macromolecular crystallography.</a> Journal of Applied Crystallography. 38 (2), 333-339 (2005).</li><li>Basavappa, R., Petri, E. T., Tolbert, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quick+and+gentle+method+for+mounting+crystals+in+capillaries.">A quick and gentle method for mounting crystals in capillaries.</a> Journal of Applied Crystallography. 36 (5), 1297-1298 (2003).</li><li>Pflugrath, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+cryocrystallography-methods+for+cooling+and+mounting+protein+crystals+at+cryogenic+temperatures.">Macromolecular cryocrystallography-methods for cooling and mounting protein crystals at cryogenic temperatures.</a> Methods. 34 (3), 415-423 (2004).</li><li>Garman, E. F., Schneider, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+Cryocrystallography.">Macromolecular Cryocrystallography.</a> Journal of Applied Crystallography. 30 (3), 211-237 (1997).</li><li>Gavira, J. A., Toh, D., Lop&#233;z-Jaramillo, J., Garc&#237;a-Ruiz, J. M., Ng, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ab+initio+crystallographic+structure+determination+of+insulin+from+protein+to+electron+density+without+crystal+handling.">Ab initio crystallographic structure determination of insulin from protein to electron density without crystal handling.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 58 (7), 1147-1154 (2002).</li><li>Mart&#237;nez-Rodr&#237;guez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+crystallographic+studies+of+an+active-site+mutant+hydantoin+racemase+from+Sinorhizobium+meliloti+CECT4114.">Crystallization and preliminary crystallographic studies of an active-site mutant hydantoin racemase from Sinorhizobium meliloti CECT4114.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 64 (Pt 1), 50-53 (2007).</li><li>Hope, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryocrystallography+of+biological+macromolecules:+a+generally+applicable+method.">Cryocrystallography of biological macromolecules: a generally applicable method.</a> Acta Crystallographica Section B: Structural Science. 44 (1), 22-26 (1988).</li><li>Teng, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mounting+of+crystals+for+macromolecular+crystallography+in+a+free-standing+thin+film.">Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a free-standing thin film.</a> Journal of Applied Crystallography. 23 (5), 387-391 (1990).</li><li>Thorne, R. E., Stum, Z., Kmetko, J., O'Neill, K., Gillilan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+mounts+for+high-throughput+macromolecular+cryocrystallography.">Microfabricated mounts for high-throughput macromolecular cryocrystallography.</a> Journal of Applied Crystallography. 36 (6), 1455-1460 (2003).</li><li>Jian-Xun, Q., Fan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+loopless+mounting+method+for+cryocrystallography.">An improved loopless mounting method for cryocrystallography.</a> Chinese Physics B. 19 (1), 010601 (2010).</li><li>Kitatani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Technique+of+Manipulating+a+Protein+Crystal+Using+Adhesive+Material.">New Technique of Manipulating a Protein Crystal Using Adhesive Material.</a> Applied Physics Express. 1 (3), 037002 (2008).</li><li>Mazzorana, M., Sanchez-Weatherby, J., Sandy, J., Lobley, C. M. C., Sorensen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+adhesive+sample+holders+for+advanced+crystallographic+experiments.">An evaluation of adhesive sample holders for advanced crystallographic experiments.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 70 (Pt 9), 2390-2400 (2014).</li><li>Wierman, J. L., Alden, J. S., Kim, C. U., McEuen, P. L., Gruner, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphene+as+a+protein+crystal+mounting+material+to+reduce+background+scatter.">Graphene as a protein crystal mounting material to reduce background scatter.</a> Journal of Applied Crystallography. 46 (5), 1501-1507 (2013).</li><li>Parkin, S., Hope, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+Cryocrystallography:+Cooling,+Mounting,+Storage+and+Transportation+of+Crystals.">Macromolecular Cryocrystallography: Cooling, Mounting, Storage and Transportation of Crystals.</a> Journal of Applied Crystallography. 31 (6), 945-953 (1998).</li><li>Papp, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+compact+and+precise+sample+holder+for+macromolecular+crystallography.">Towards a compact and precise sample holder for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (10), 829-840 (2017).</li><li>Roedig, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+micro-patterned+silicon+chip+as+sample+holder+for+macromolecular+crystallography+experiments+with+minimal+background+scattering.">A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering.</a> Scientific Reports. 5, 10451 (2015).</li><li>Roedig, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room-temperature+macromolecular+crystallography+using+a+micro-patterned+silicon+chip+with+minimal+background+scattering.">Room-temperature macromolecular crystallography using a micro-patterned silicon chip with minimal background scattering.</a> Journal of Applied Crystallography. 49 (3), 968-975 (2016).</li><li>Zarrine-Afsar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallography+on+a+chip.">Crystallography on a chip.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (3), 321-323 (2012).</li><li>Mueller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixed+target+matrix+for+femtosecond+time-resolved+and+in+situ+serial+micro-crystallography.">Fixed target matrix for femtosecond time-resolved and in situ serial micro-crystallography.</a> Structural Dynamics. 2 (5), 054302 (2015).</li><li>Feld, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-Z+polymer+sample+supports+for+fixed-target+serial+femtosecond+X-ray+crystallography.">Low-Z polymer sample supports for fixed-target serial femtosecond X-ray crystallography.</a> Journal of Applied Crystallography. 48 (4), 1072-1079 (2015).</li><li>le Maire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-plate+protein+crystallization,+in+situ+ligand+soaking+and+X-ray+diffraction.">In-plate protein crystallization, in situ ligand soaking and X-ray diffraction.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (9), 747-755 (2011).</li><li>Soliman, A. S. M., Warkentin, M., Apker, B., Thorne, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+high-performance+X-ray+transparent+crystallization+plates+for+in+situ+protein+crystal+screening+and+analysis.">Development of high-performance X-ray transparent crystallization plates for in situ protein crystal screening and analysis.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (7), 646-656 (2011).</li><li>Aller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+in+situ+diffraction+in+high-throughput+structure+determination+platforms.">Application of in situ diffraction in high-throughput structure determination platforms.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1261, 233-253 (2015).</li><li>Cipriani, F., R&#246;wer, M., Landret, C., Zander, U., Felisaz, F., M&#225;rquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CrystalDirect:+a+new+method+for+automated+crystal+harvesting+based+on+laser-induced+photoablation+of+thin+films.">CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 68 (Pt 10), 1393-1399 (2012).</li><li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+harvesting+and+processing+of+protein+crystals+through+laser+photoablation.">Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).</li><li>Antimonov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-area+Kapton+x-ray+windows.">Large-area Kapton x-ray windows.</a> Advances in X-Ray/EUV Optics and Components X. 9588, 95880F (2015).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetration+of+dyes+into+protein+crystals.">Penetration of dyes into protein crystals.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 75 (2), 132-140 (2019).</li><li>Bowler, M. G., Bowler, D. R., Bowler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raoult's+law+revisited:+accurately+predicting+equilibrium+relative+humidity+points+for+humidity+control+experiments.">Raoult's law revisited: accurately predicting equilibrium relative humidity points for humidity control experiments.</a> Journal of Applied Crystallography. 50 (2), 631-638 (2017).</li><li>Pellegrini, E., Piano, D., Bowler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cryocooling+of+naked+crystals:+are+cryoprotection+agents+always+necessary?.">Direct cryocooling of naked crystals: are cryoprotection agents always necessary?.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (10), 902-906 (2011).</li><li>Mueller, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macromolecular+crystallography+beamlines+at+BESSY+II+of+the+Helmholtz-Zentrum+Berlin:+Current+status+and+perspectives.">The macromolecular crystallography beamlines at BESSY II of the Helmholtz-Zentrum Berlin: Current status and perspectives.</a> The European Physical Journal Plus. 130 (7), 141 (2015).</li><li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+and+Experience+of+Controlled+Crystal+Dehydration:+Results+from+the+European+Synchrotron+HC1+Collaboration.">Automation and Experience of Controlled Crystal Dehydration: Results from the European Synchrotron HC1 Collaboration.</a> Crystal Growth &amp; Design. 15 (3), 1043-1054 (2015).</li><li>Yano, O., Yamaoka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryogenic+properties+of+polymers.">Cryogenic properties of polymers.</a> Progress in Polymer Science. 20 (4), 585-613 (1995).</li><li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MeshAndCollect:+an+automated+multi-crystal+data-collection+workflow+for+synchrotron+macromolecular+crystallography+beamlines.">MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 71 (Pt 11), 2328-2343 (2015).</li></ol>

Патентные заявки в отношении зарегистрированного владельца выборки были поданы Helmholtz-Центрум Берлине со следующими регистрационными номерами и датами регистрации в Германском бюро патентов и товарных знаков: DE 10 2018 129 125.6, дата регистрации 20 ноября 0,2018; DE 10 2018 125 129.7, дата регистрации 11октября2018; DE 10 2017 129 761.8,дата регистрации 13 декабря 2017 года. Последующая международная патентная заявка по маршруту РСТ, используя приоритет DE 10 2017 129 761.8 была подана, РСТ/DE2018/101007. Регистрация коммунальной модели с номером DE 20 2018 106 955.1 была подана 6 декабря 2018 года. Держатель образца был доступен на коммерческой стадии под торговыми названиями XtalTool и XtalTool/HT от Jena Bioscience, Jena, Германия.

Пригодность для экспериментов по кристаллизации. Новые держатели образцов могут быть использованы для стандартных экспериментов кристаллизации висячих капель, используя либо 24-колодские пластины типа Linbro (типы 1 и 2), либо 24-хорошо SBS след пластин, в которых каждая скважина имеет диаметр 18 мм (тип 3). Они могут быть использованы вместо стандартного микроскопа крышка скользит. Аморфная фольга COC обеспечивает герметичность системы. Мониторинг эксперимента по кристаллизации возможен с помощью светового микроскопа передачи, благодаря использованию фольги высокой ясности. Насколько нам известно, для 24-ну хорошо кристаллизующих пластин не существует других держателей образцов, что позволило бы проводить кристаллические манипуляции или эксперименты по дифракции, не удаляя кристалл из капли, в которой он выращивается. Это имеет особое значение, так как многие исследователи в этой области по-прежнему полагаются на такие пластины для оптимизации кристалла, в связи с тем, что большие объемы падения могут быть использованы по сравнению с 96-хорошо сидя падения пластин. С этими большими объемами падения, более большие кристаллы могут быть получены.
Пригодность для кристаллических манипуляций. Благодаря самовосстановлению свойств внешней фольги COC и микропористой структуре внутренней желтой полиимидной фольги, кристаллическая среда доступна, и кристаллами можно манипулировать без механически переноса их в другие контейнеры. Это делает выборку держателей очень удобно. Единственной другой системой, которую мы знаем, которая позволяет этот косвенный и нежный доступ к кристаллу, является CrystalDirect системы26. Тем не менее, CrystalDirect является менее гибким, поскольку специальные 96-хорошо кристаллизации пластины должны быть использованы. Фольга, на которой растут кристаллы, такая же, что и эксперимент по кристаллизации, и она не является самоисцеляющимся. Это означает, что диафрагма, которая была пробита в фольгу лазерной абляцией для лиганда или крио-защиты доставки кристаллов будет оставаться открытой, увеличивая вероятность жидкого испарения. Это в отличие от нашего дизайна, где кристаллы не будут непосредственно подвергаться воздействию окружающей среды, даже если фольга COC получает пронзили несколько раз.
Пригодность для экспериментов по дифракции на месте при температуре окружающей среды. Держатель образца можно удалить из кристаллизации пластины прямо вперед, приклеиться к магнитному основанию и поставить на луч гониометра. Для эксперимента дифракции при комнатной температуре, рекомендуется положить образец в воздушный поток определенной влажности33. Мать ликер ателье вокруг кристалла могут быть удалены до сдачи образца держатель на гониометр для того, чтобы уменьшить рассеяние фона. Такая настройка стабильна в течение нескольких часов.
Пригодность использованного материала для эксплуатации и хранения при 100К. Ни материал, используемый для производства образца держателя, ни полиимидной пленки отрицательно влияет на охлаждение их до низких температур34. Таким образом, работа с держателем образца при низкой температуре (например, 100 К) не представляет серьезной проблемы.
Пригодность для экспериментов дифракции на месте на 100 K. Для сбора данных при потоке азота 100 К держатель образца должен быть удален из кристаллизации пластины, как и в предыдущем пункте, застрял на магнитной базе и помещен в газообразный поток азота при 100 K на лучевом гониометре. При желании образец также может быть криозащищен, хотя вполне вероятно, что для обнаженных образцов это может не быть необходимым в большинстве случаев31. Для экспериментов на 100 K, образцы держателей типа 2 и 3 лучше подходят, потому что внешнее пластиковое кольцо может быть удалено. Следовательно, они меньшего размера и поэтому должны быть менее склонны к обледенению. Тем не менее, даже выборка держателя типа 1 могут быть использованы. Учитывая не слишком высокую влажность в экспериментальной загон и правильно выровнены крио-системы обледенения до держателя на самом деле не проблема.
Ограничения. Геометрия владельца образца позволяет беспрепятственно ею данные дифракции сбора методом вращения в пределах общего диапазона вращения 160 ". Этого достаточно для того, чтобы для большинства кристаллических систем можно было получить полные наборы данных о дифракции. В тех случаях, когда это невозможно, данные из более чем кристалла должны быть объединены вместе. Когда кристаллы растут вместе, можно настроить размер инцидента рентгеновский луч так, что только части отдельных кристаллов подвергаются. В крайних случаях, возможно, придется прибегнуть к стратегии сбора данных, аналогичной подходу MeshAndCollect35. Таким образом, хотя существуют определенные ограничения, связанные с держателями выборки, они могут быть преодолены в большинстве случаев. Конечно, всегда возможно, что ситуации встречаются, в которых все это невозможно. В таких случаях, возможно, придется прибегнуть к другим методам кристаллического монтажа.
Мы описали новый тип держателя образца для макромолекулярной кристаллографии и продемонстрировали пригодность держателей образцов для различных применений. Принимая во внимание простое и воспроизводимое обращение с кристаллами белка, а также уникальные свойства держателей образцов, мы считаем, что эти держатели образцов окажутся ценным дополнением к арсеналу держателей образцов для макромолекулярных Кристаллографии.

Знание трехмерной структуры биологических макромолекулов является важным краеугольным камнем во всех основных биологических, биохимических и биомедицинских исследованиях. Это даже распространяется на некоторые трансляционные аспекты таких исследований, такие как, например, открытие наркотиков. Среди всех методов получения такой трехмерной информации при атомном разрешении рентгеновская кристаллография является самой мощной и наиболее заметной, о чем свидетельствует тот факт, что 90% всей имеющейся структурной информации вносит рентгеновский снимок кристаллография1. Основным условием рентгеновской кристаллографии, которая в то же время является ее основным ограничением, является то, что кристаллы дифракционного качества должны быть произведены и подготовлены к эксперименту дифракции. Этот шаг по-прежнему является одним из основных узких мест метода.
Исторически сложилось так, что данные о дифракции из белковых кристаллов собирались при температуре окружающей среды. Индивидуальные кристаллы были тщательно переданы в стеклянные или кварцевые капилляры до сбора данных, мать ликер был добавлен в капилляры так, что кристаллы не высохнут и капилляры были запечатаны2,3, 4. С 1980-х годов становится все более очевидным, что из-за ионизирующих свойств Х-излучения и неизбежной радиационной чувствительности макромолекулярных кристаллов сбор данных при температуре окружающей среды создает серьезные ограничения на метод. Следовательно, были разработаны подходы к смягчению последствий радиационного ущерба путем охлаждения макромолекулярных кристаллов до 100 К и сбора данных о дифракции при такой низкой температуре5,6. Для работы при низких температурах монтаж проб в капиллярах стал нецелесообразным из-за низкой скорости передачи тепла. Несмотря на это, в настоящее время предпринимаются усилия по использованию капилляров, в частности,в ходе экспериментов по кристаллизации против диффузии, для низкотемпературных дифракционных работ 7,8, но, независимо от этого, это стало стандартом подход в макромолекулярной кристаллографии для установки макромолекулярных кристаллов, удерживаемых тонкой пленкой материнского ликера внутри тонкой проводной петли9,10. Несмотря на то, что с течением времени в эту петлю на основе монтажа был внесен ряд улучшений (например, введение литографических циклов и аналогичных структур11),основные принципы, разработанные в начале 90-х годов, по-прежнему используются и сегодня. Можно с уверенностью сказать, что большинство дифракционных данных о сборах макромолекулярных кристаллов в настоящее время по-прежнему полагаются на этот подход5.
Со временем появились некоторые интересные новые разработки и изменения метода монтажа на основе циклов, однако эти подходы до сих пор не получили широкого распространения в общине. Одним из них является так называемый цикл менее монтажа кристаллов, который был разработан для достижения нижнего фона рассеяния12,13,14. Еще один - использование графеновых оболочек для обертывания кристаллических образцов и защиты их от высыхания. Графен является хорошо подходит материал в этом отношении из-за его очень низкий рентгеновский рассеяния фон15.
В последнее время разработки в области выборочных креплений были в основном сосредоточены на стандартизации креплений с целью увеличения пропускной записи выборки16 или на проектировании креплений, которые могут содержать более одной выборки17,например узорчатые мембраны на кремниевой раме, которые способны вмещать сотни мелких кристаллов в основном в области серийной кристаллографии18,19,20,21,22.
Все методы установки образцов, обсуждавшиеся до сих пор, по-прежнему требуют определенной степени ручного вмешательства, а это означает, что существует врожденная опасность нанесения механических повреждений образцу. Таким образом, новые подходы ищутся путем проектирования выборки среды таким образом, что дифракционные данные кристаллов могут быть собраны в их среде роста. Один из таких методов называется на месте или пластины скрининга23,24 и он уже реализован в ряде макромолекулярных кристаллических лучей в различных источниках синхротронов во всем мире25. Однако использование этого метода ограничено геометрическими параметрами кристаллической пластины и пространством, доступным вокруг точки образца прибора.
Еще один подход реализуется в так называемой системе CrystalDirect26. Здесь все кристаллизуемые капли собирают автоматически. Фольги, на которых были выращены кристаллы, специально вырезаны с помощью лазера и непосредственно используются в качестве держателя образца27.
В описанной здесь работе цель заключалась в разработке держателя образца, который позволил бы пользователю перемещать кристаллический образец из камеры роста в устройство сбора данных, не касаясь его и что позволило бы пользователю легко манипулировать образцом. Поскольку многие исследователи в области макромолекулярной кристаллографии все еще используют 24-ну хорошо кристаллизации формат для оптимизации роста кристалла путем изменения условий, определенных в крупных кампаний скрининга, новый держатель образца был разработан, чтобы быть совместим с этим форматом. В следующем, дизайн нового держателя образца будет описан и обработки и производительности выборки держателя для сбора данных in situ и лиганд замачивания будут продемонстрированы. Наконец, будет обсуждаться пригодность этого нового держателя образца, а также его ограничения для различных этапов работы.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1167px;" width="1167">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">AF Satetiss</td>
			<td style="width:253px;">RS Components</td>
			<td style="width:207px;">101-5738</td>
			<td style="width:485px;">lint-free paper, multiple retailer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:221px;">Cannula</td>
			<td style="width:253px;">Dispomed Neoject</td>
			<td style="width:207px;">25 G 5/8&#34; 0.5 x 16, Ref:10026</td>
			<td>multiple retailer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">COC foil</td>
			<td style="width:253px;">HJ-Bioanalytik GmbH</td>
			<td style="width:207px;">900360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:221px;">ComboPlate</td>
			<td style="width:253px;">Greiner Bio-one / Jena Bioscience</td>
			<td style="width:207px;">662050 / CPL-131</td>
			<td>pre-greased plate, multiple retailer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Cryo Vials</td>
			<td style="width:253px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:207px;">CV-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Eppendorf Research Plus&#160;</td>
			<td style="width:253px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:207px;">3123000012</td>
			<td>0.1 - 2.5 &#181;L volume</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Eppendorf Tubes</td>
			<td style="width:253px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:207px;">30125150</td>
			<td>1.5 mL g-Safe Eppendorf Quality, manufacturer reference number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Forceps Usbeck</td>
			<td style="width:253px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:207px;">10750313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">GELoader Eppendorf Quality</td>
			<td style="width:253px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:207px;">30001222</td>
			<td>extruded&#160; tips (0.2 - 20 &#181;L), manufacturer reference number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Magnetic CryoVials</td>
			<td style="width:253px;">Molecular Dimension</td>
			<td style="width:207px;">MD7-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Microfuge Thermo</td>
			<td style="width:253px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;">R21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Paper wicks</td>
			<td style="width:253px;">dental2000</td>
			<td style="width:207px;">64460</td>
			<td>Set of paper wicks, multiple retailer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Rotiprotect Nitril-eco&#160;</td>
			<td style="width:253px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:207px;">TC14.1</td>
			<td>powder free, multiple retailer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">SuperClear Plates</td>
			<td style="width:253px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:207px;">CPL-132</td>
			<td>pre-greased plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">UHU super glue</td>
			<td style="width:253px;">UHU GmbH &#38; Co KG</td>
			<td style="width:207px;">45545</td>
			<td>manufacturer reference number, multiple retailer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">VeroBlackPlus</td>
			<td style="width:253px;">Alphacam</td>
			<td style="width:207px;">OBJ-40963</td>
			<td>manufacturer reference number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">XtalTool&#160;</td>
			<td style="width:253px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:207px;">X-XT-101</td>
			<td>sample holder set</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">XtalTool HT</td>
			<td style="width:253px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:207px;">X-XT-103 / X-XT-104</td>
			<td>SPINE compatible sample holder set</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">XtalToolBases</td>
			<td style="width:253px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:207px;">X-XT-105</td>
			<td>Magnetic sample holder bases set</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an all-in-one sample holder for macromolecular x-ray crystallography with minimal background scattering

Макромолекулярная рентгеновская кристаллография (MX) является наиболее известным методом получения трехмерных знаний о биологических макромолекулах с высоким разрешением. Предпосылкой для метода является то, что высоко упорядоченный кристаллический образец должен быть выращен из макромолекулы для изучения, которые затем должны быть подготовлены к эксперименту дифракции. Эта процедура приготовления обычно включает в себя удаление кристалла из раствора, в котором он был выращен, замачивание кристалла в растворе лиганда или крио-защитного раствора, а затем обездвижение кристалла на горе, подходящем для эксперимента. Серьезная проблема для этой процедуры заключается в том, что макромолекулярные кристаллы часто механически нестабильны и довольно хрупки. Следовательно, обработка таких хрупких кристаллов может легко стать узким местом в попытке определения структуры. Любая механическая сила, применяемая к таким тонким кристаллам, может нарушить регулярную упаковку молекул и может привести к потере дифракционной силы кристаллов. Здесь мы представляем новый все-в-одном держатель образца, который был разработан для того, чтобы свести к минимуму шаги обработки кристаллов и, следовательно, максимизировать скорость успеха эксперимента определения структуры. Держатель образца поддерживает установку кристаллических капель, заменяя широко используемые микроскопие крышки скользит. Кроме того, он позволяет на месте кристалла манипуляции, такие как лиганд замачивания, крио-защиты и комплексного образования без каких-либо открытия кристаллизации полости и без обработки кристалла. Наконец, держатель образца был разработан для того, чтобы обеспечить сбор данных о дифракции рентгеновского излучения на месте при температуре окружающей среды и криогенной. С помощью этого образца держателя, шансы повредить кристалл на своем пути от кристаллизации до сбора данных дифракции значительно уменьшаются, так как прямая обработка кристалла больше не требуется.

Образец держателя типа 1 был разработан таким образом, чтобы он вписывается в колодец 24-хорошо Linbro стиле пластины. Каждый индивидуальный держатель образца содержит средства позиционирования по обе стороны от внешнего обода для того, чтобы обеспечить оптимальное позиционирование на краю скважины(рисунок 1A, Рисунок 2A). До трех индивидуальных выпадений кристаллизации максимального объема 2 ЗЛ каждый может быть помещен на желтую полиимидовую фольгу(рисунок 2B). Для выборочных держателей типов 2 и 3 рекомендуется установить максимум две капли максимального объема по 2 л каждый. 24 образца держателей могут быть установлены на один 24-колодец Linbro пластины(рисунок 3D).
Был налажен эксперимент по кристаллизации на 24-колодной пластине Linbro с использованием образца держателя типа 1. 1 кл. куриного яичного белого лизозима (15 мг/мл) был смешан с 1 qL материнского спирта, состоящего из 50 мм NaAc pH 4,7, 500 мМ NaCl и 25% (w/v) PEG-6000 на желтой полиимидной фольге на образце(Таблица 1). Падение было уравновешлено на уровне 293 К против 500 кЛ материнского спирта и кристаллы размером 40-50 мкм наблюдались через 5 часов(рисунок 4). Рост кристалла можно наблюдать с помощью светового микроскопа передачи(Рисунок 4) с или без поляризатора. Пленки высокой прозрачности обеспечивают наилучшее наблюдение и мониторинг условий кристаллического выращивания с использованием обычного светового микроскопа или автоматизированной системы кристаллической визуализации. Наблюдение за ростом кристалла с использованием УФ-света не было протестировано.
После удаления матери ликера из вокруг кристаллов, образец держатель с курицей яичного яичного белка лизозима кристаллов был взят из кристаллизации пластины и помещены в влажности контролируемых воздушных потоков на H'B-MX луч 14,332. Данные о дифракции были собраны при температуре окружающей среды с шагом в 1 "с шагом" с использованием 150 мкм пучка при энергии 13,8 кэВ с 4 х 1010 фотонами/с и временем экспозиции 5 с на изображение. Типичное изображение дифракции показано на рисунке 5. Нет повышенного рассеяния фона на изображении дифракции не может быть обнаружено. Более дополнительные экспериментальные детали, а также связанные статистические данные обработки данных перечислены в таблице 2.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59722/59722fig1.jpg"> Рисунок 1 : Схематический вид новых держателейобразцов. Держатели образца состоят из черной пластиковой опоры, которая покрыта на внешней стороне аморфной циклической олейфином copolymer (COC) фольгой. Эта фольга (окрашенная в синий цвет) очень прозрачна и самовосстановления. Это также обеспечивает герметичность газа эксперимента. Внутренняя фольга (окрашенная в желтый цвет) изготовлена из био-инертного полиимида, который очень прозрачдля для рентгеновских лучей. На этой фольге можно поместить кристаллизуя капли. Внешний край держателя образца содержит два средства позиционирования, указанные красной стрелкой (панель А),что позволяет точно разместить держатель образца на индивидуальной предварительно смазанную полость кристаллизации пластины. (A) Держатель образца (тип 1) с диаметром 22 мм с фиксированным внешним кольцом поддержки. (B) Образец держателя (тип 2) с диаметром 22 мм со съемным внешним кольцом поддержки. (C) Держатель образца (тип 3) с диаметром 18 мм со съемным внешним кольцом поддержки. Последние два были разработаны для использования их в высокой пропускной форме с автоматизированной выборки монтажа роботов с использованием стандарта SPINE. Обозначенные точки разрыва выделены красными стрелками в панели B. Черная стрелка в панели C указывает на маркер позиционирования. Выступающие булавки на внешнем периметре желтой фольги необходимы для выравнивания полиимидной фольги во время производственного процесса. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59722/59722fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59722/59722fig2.jpg"> Рисунок 2 : Держатель образца может быть использован на 24-хорошей пластине Linbro так же, как широко используемый микроскоп крышки скользит. Он герметит полость герметичной. Средства позиционирования обеспечивают правильное позиционирование держателя образца на полости (красные стрелки в панели А). До трех отдельных капель могут быть помещены на тип 1 выборки держателя (панель B), в то время как рекомендуемое максимальное количество капель, размещенных на тип 2 или 3 выборки держателя составляет два. Максимальный рекомендуемый объем для каждой капли составляет 2 л. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59722/59722fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59722/59722fig3.jpg"> Рисунок 3 : 24 тип 1 образца держатели помещаются на 24-колодец пластины. Держатели образца могут быть помещены в две ориентации на 24-хорошо пластины, как указано (панель D). Канюля используется для прокалывание задней фольги COC для того, чтобы удалить избыток ликера из выпадения кристаллизации (панели A и C) с помощью бумажного фитиля, мягко вставленного в то же отверстие (панель B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59722/59722fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59722/59722fig4.jpg"> Рисунок 4 : Изображение кристаллов куриного яичного белого лиззима наблюдается с помощью трансмиссионного микроскопа, оснащенного поляризатором. Индивидуальные кристаллы легко дискриминируются от осажденного белкового раствора. Кристаллы на этом изображении среднего размера 40 мкм х 50 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59722/59722fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a> 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59722/59722fig5.jpg"> Рисунок 5 : Типичное рентгеновское дифракционное изображение кристалла lysozyme, выращенного на держателе образца. До контакта с рентгеновскими лучами все излишки материнского спирта были удалены из-за кристалла. Данные о дифракции были собраны при температуре окружающей среды на BL14.3 на электронном кольце хранения BESSY II32 с использованием влажности контролируемой среды образца с 97.5% относительной влажности. Повышенный фон из-за держателей выборки не наблюдается. Разбитые линии на изображении указывают на кольца разрешения. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59722/59722fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59722/59722fig6.jpg"> Рисунок 6 : Держатель образца подготовлен для сбора данных дифракции. Во-первых, COC пленка поднимается осторожно с помощью щипц, а затем отслаивается (панель А). Впоследствии держатель образца удаляется из полости и вставляется в центральное отверстие магнитного основания до тех пор, пока не будет указан маркером (панель B). Держась за центральную часть, мягкое давление применяется к внешнему кольцу, чтобы освободить центральную часть с помощью симметрично расположенных назначенных точек разрыва (панель C). После удаления держатель образца можно погрузить в жидкий азот и перенести в стандартные флаконы SPINE. Размещенные, например, в шайбы они могут быть перевезены на синхротронные сайты, где автоматизированные роботы-монтажники распознают их как обычные образцы (панель D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59722/59722fig6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a> 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Детали кристаллизации</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Метод</td>
			<td>Висячие капли, метод диффузии пара</td>
		</tr>
<tr>
<td>Тип плиты</td>
			<td>СуперКлир плиты</td>
		</tr>
<tr>
<td>Температура (K)</td>
			<td>293 г.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Концентрация белка (мг мл Л.1)</td>
			<td>15 лет</td>
		</tr>
<tr>
<td>Состав раствора резервуара</td>
			<td>50 мМ NaAc рН 4,7, 500 мМ NaCl, 25 % (w/v) PEG-6000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Объем и соотношение падения</td>
			<td>2 итог, 1:1 соотношение (белок : материнский ликер</td>
		</tr>
<tr>
<td>Объем водохранилища</td>
			<td>500 л</td>
		</tr>
<tr>
<td>Время инкубации</td>
			<td>12 часов</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Экспериментальные детали описанного эксперимента по кристаллизации.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Сбор и обработка данных</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Длина волны (К)</td>
			<td>0.89429</td>
		</tr>
<tr>
<td>Температура (K)</td>
			<td>293 г.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Детектор</td>
			<td>Rayonix MX225 CCD</td>
		</tr>
<tr>
<td>Расстояние кристалл-детектор (мм)</td>
			<td>120 г.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Диапазон вращения на изображение (к)</td>
			<td>0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Общий диапазон вращения (к)</td>
			<td>120 г.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Время экспозиции на изображение (ы)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Космическая группа</td>
			<td>P43212</td>
		</tr>
<tr>
<td>Параметры единицы ячейки (К)</td>
			<td>79,01, б 79,01, с 37,95</td>
		</tr>
<tr>
<td>Мосасити (К)</td>
			<td>0,07</td>
		</tr>
<tr>
<td>Диапазон разрешений (К)</td>
			<td>39.50 - 1.35 (1.37 - 1.35)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Общее количество отражений</td>
			<td>191940 (8932)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Количество уникальных отражений</td>
			<td>27020 (1292)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Полнота (%)</td>
			<td>99.88 (99.20)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Разносторонность</td>
			<td>7.1 (6.9)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Среднее i/я (I)</td>
			<td>15.0 (1.9)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmeas35 (%)</td>
			<td>6.3 (107.0)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rпим36 (%)</td>
			<td>2.4 (40.4)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC1/237 </td>
			<td>99,9 (68,5)</td>
		</tr>
<tr>
<td>ISa38
</td>
			<td>16.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Уилсон B-фактор (No2)</td>
			<td>17.0</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 2: Статистика сбора и обработки данных дифракции.

Watch this Scientific Journal Video about An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering at JoVE.com

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Универсальный выборочный держатель для макромолекулярной рентгеновской кристаллографии с минимальным рассеянием фона

Представлен новый образец для макромолекулярной рентгеновской кристаллографии вместе с подходящим протоколом обработки. Система позволяет кристаллический рост, кристалл замачивания и на месте дифракции сбора данных на обоих, окружающей и криогенной температуры без необходимости каких-либо кристалл манипуляции или монтажа.

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Этот держатель образца может быть использован для выращивания кристаллов и сбора рентгеновских данных дифракции. Этот держатель образца был сделан для использования на 24-хорошо пластин, которые широко используются в сообществе MX. Очень важным аспектом является то, что нет никаких манипуляций необходимо.Владельца образца с этими аспектами, описанными здесь, раньше не существовало. Увидеть что-то всегда гораздо лучше, чем просто читать об этом. Посмотрев видео, потенциальный пользователь может сразу понять особенности и тонкости нового держателя образца.Для начала создайте чистую и свободную от пыли поверхность с помощью влажной ткани без ворса. Возьмите один образец держателя из коробки и аккуратно поместите его, желтая фольга лицом вверх, на чистой поверхности, чтобы избежать повреждения или нежелательного прокола задней фольги COC. Настройка кристаллизации капель на желтую фольгу, как это было бы сделано на широко используемых слайдов покрытия.Поместите капли осторожно, чтобы избежать разрыва или прокалывания фольги с помощью пипетки. На держателях образца типа 2 и типа 3 рекомендуемые максимум две капли. На держатель образца типа 1 можно поместить до трех капель.Переверните держатель образца и поместите его на предварительно смазанную полость пластины в стиле Linbro. Используйте средства позиционирования держателя образца, чтобы вести его к оптимальному положению. Обеспечь правильное положение держателя образца, чтобы избежать нежелательного испарения.Помещая кристаллизацию пластины под трансмиссионный микроскоп, без или без поляризаторов, контролировать рост кристалла без каких-либо нарушений эксперимента. Выполняем криопротезцию под световым микроскопом передачи. Аккуратно проколите внешнюю фольгу COC с помощью тонкой канулы.Убедитесь, что внутренняя желтая фольга остается нетронутой. Прокол должен быть рядом с каплей, которой нужно манипулировать. Вставьте тонкий бумажный фитиль в ткнул отверстие.Аккуратно нажмите фитиль вперед, пока он не коснется желтой полиимидной фольги. Держите фитиль в контакте с перфорированной фольгой. Фитиль будет отсосать все излишки раствора.Время, необходимое для полного удаления жидкости, зависит от вязкости растворов и состава материнского ликера. После того, как вся жидкость высосется, аккуратно убирайте бумажный фитиль. Помните положение падения, так как оно может быть не видно после удаления материнского спиртного.Возьмите стандартную пипетку, чтобы применить небольшой объем крио-защитного раствора, используя экструдированную наконечник через то же отверстие. Чтобы запечатать самовосстановляющуюся фольгу COC, аккуратно поместите защищенный палец на отверстие в течение одной секунды и сдвиньте его через прокол. Небольшое давление в сочетании с повышенной температурой будет способствовать повторному пропечатыванию проколов, которые не слишком велики.Растворите лиганд в материнском ликере в нужной концентрации в реакционной трубке. Спин раствор в течение 10 минут при 12000 раз г для того, чтобы удалить нерастворимые частицы. При необходимости используйте центрифугу, контролируемую температурой.Аккуратно поместите максимум три микролитера лигандсодержащего раствора в зазор между фольгой COC и полиимидной пленкой, используя длинный экструдированный наконечник пипетки; убирайте наконечник. Чтобы запечатать самовосстановляющуюся фольгу COC, аккуратно поместите защищенный палец на отверстие в течение одной секунды и сдвиньте его через прокол. Инкубировать эксперимент в течение некоторого времени, чтобы обеспечить диффузию через мембрану.Время замачивания во многом зависит от вязкости диффузного раствора и его компонентов. Повторите лиганд замачивания шаги несколько раз, чтобы впоследствии впитать различные лиганды. Чтобы свести к минимуму рассеяние растворителей, удалите избыточное решение перед сбором данных.Обеспечь стабильную, контролируемую влажностью среду луча с заранее установленными условиями. Для выполнения сбора данных на месте при температуре окружающей среды аккуратно поднимите прозрачную фольгу COC в назначенной точке с помощью типсов и снимите ее. Теперь аккуратно поднимите держатель образца из его полости и вставьте его немедленно в заранее подготовленную магнитную основу держателя образца.Для этого шага не требуется клей. Нанесите мягкое давление, чтобы обеспечить правильное позиционирование держателя образца в пределах базы. Для держателей образцов со съемным внешним кольцом, применять мягкое давление, держась за внешнее кольцо и разорвать его в назначенных точках перерыва.Образец готов к центру и сбору данных дифракции. Намонтировать держатель образца на гониометре луча и обеспечить правильное позиционирование держателя. В зависимости от геометрии гониометра, держатель образца может вращаться до 160 градусов, не вызывая никакой тени во время эксперимента дифракции.Используйте бумажный фитиль и осторожно коснитесь желтой полиимидной фольги с задней стороны, чтобы удалить избыток материнского ликера. Образец готов к центру и сбору данных дифракции. Подготовьтесь к сбору данных на месте при криогенной температуре, как это делается для температуры окружающей среды, затем окунив образец в жидкий азот и перенесите его в совместимый с SPINE флакон.Геометрия держательа образца типов 2 и 3 позволяет их перенос в стандартные флаконы образца SPINE, которые могут быть использованы для роботизированного монтажа образца. Тип держателя образца 1 и тип 2 были конструированы для того чтобы приспосабливать на наилучшим образом плиты 24-наилучшим образом Linbro-типа. Каждый отдельный держатель образца содержит средства позиционирования по обе стороны внешнего обода, чтобы обеспечить оптимальное позиционирование на краю хорошо.24-хорошо Linbro стиле пластины был использован с типом 1 образца держатель для equilibrate падение на 293 Кельвин против 500 микролитров материнского ликера. Кристаллы от 40 до 50 микрон наблюдались через пять часов с помощью светового микроскопа передачи с поляризатором или без него. Образец держателя с куриным яично-белыми кристаллами лизозима был помещен в контролируемый влажностью воздушный поток на луче 14,3 H'B-MX.Здесь отображается типичное дифракционное изображение. Никакого повышенного рассеяния фона на дифракционном изображении обнаружить нельзя. Крайне важно избегать загрязнения полиимидной фольги.Кроме того, важно, чтобы держатель образца был расположен точно и кристалл манипуляции проводятся тщательно. Держатель образца позволяет обрабатывать очень деликатные кристаллы, один из самых важных шагов в микромолекулярной кристаллографии. Его использование значительно снижает вероятность уничтожения образца.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Сочетая рентгеноструктурного анализа с малоуглового рентгеновского рассеяния для моделирования неструктурированных регионов Nsa1 от S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Растущий белок кристаллы с отдельных измерений с помощью автоматизированных кристаллизации, в сочетании с в Situ Динамическое рассеяние света

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Характеристика гликопротеины с складке иммуноглобулина рентгеноструктурного анализа и биофизических методов

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Структурные исследования макромолекул в решения с помощью небольшой угол рентгеновского рассеяния

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Подготовка образца плазмы для масс-спектрометрии с использованием автоматизированной рабочей станции

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Клеточная культура на силиконовых нитридных мембранах и криопрепарат для синхротронного рентгеновского флуоресценции Нано-анализа

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Рентгеновская кристаллография для изучения олигомерского государства Переход Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Оптимизация роста кристаллов эндотиапепсина для серийных кристаллографических экспериментов

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Plant Sample Preparation for Nucleoside/Nucleotide Content Measurement with An HPLC-MS/MS

Заводская пробоподготовка для измерения содержания нуклеозидов/нуклеотидов с помощью ВЭЖХ-MS/MS

Nucleosides/nucleotides are building blocks of nucleic acids, parts of cosubstrates and coenzymes, cell signaling molecules, and energy carriers, which ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Кристаллизация и структурное определение фермента: Субстратный комплекс по серийной кристаллографии в универсальном микрофлюидной чипе

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...