Name: analysis of interactions between endobiotics and human gut microbiota using in vitro bath fermentation systems
Uploaded: 2019-08-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems at JoVE.com

Questo studio è stato finanziato dalla National Nature Science Foundation of China (n. 31741109), dalla Hunan Natural Science Foundation (n. 2018JJ3200), e dal programma di costruzione di disciplina caratteristica applicata presso l'Università Hunan di Scienza e Ingegneria. Ringraziamo LetPub (www.letpub.com) per la sua assistenza linguistica durante la preparazione di questo manoscritto.

Questo protocollo segue le linee guida del comitato etico dell'Università di Scienza e Ingegneria dell'Università Hunan (Hunan, Cina), e dell'Università di Gongshang dello zhejiang.
1. Preparazione di batteri
<ol><li>Preparazione del brodo medio bifidobacterium<ol>
<li>Unire i seguenti componenti in 950 mL di acqua distillata: estratto di carne, 5 g/L; estratto di lievito, 5 g/L; peptone di caseina, 10 g/L; soytone, 5 g/L; glucosio, 10 g/L; K2HPO4, 2,04 g/L; MgSO<sub...

<ol>
	<li>Maarten, V. D. G., Blotti&#232;re Herv&#233;, M., Dor&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humans+as+holobionts:+implications+for+prevention+and+therapy.">Humans as holobionts: implications for prevention and therapy.</a> Microbiome. 6 (1), 81 (2018).</li><li>Allen, A. P., Dinan, T. G., Clarke, G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+psychology+of+the+human+brain-gut-microbiome+axis.">A psychology of the human brain-gut-microbiome axis.</a> Social and Personality Psychology Compass. 11 (4), e12309 (2017).</li><li>Arora, T., B&#228;ckhed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+and+metabolic+disease:+current+understanding+and+future+perspectives.">The gut microbiota and metabolic disease: current understanding and future perspectives.</a> Journal of Internal Medicine. 280, 39-349 (2016).</li><li>Maurice, C., Haiser, H., Turnbaugh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenobiotics+shape+the+physiology+and+gene+expression+of+the+active+human+gut+microbiome.">Xenobiotics shape the physiology and gene expression of the active human gut microbiome.</a> Cell. 152 (1-2), 39-50 (2013).</li><li>Carmody, R. N., Turnbaugh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-microbial+interactions+in+the+metabolism+of+therapeutic+and+diet-derived+xenobiotics.">Host-microbial interactions in the metabolism of therapeutic and diet-derived xenobiotics.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4173-4181 (2014).</li><li>Lu, K., Mahbub, R., Fox, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenobiotics:+interaction+with+the+intestinal+microflora.">Xenobiotics: interaction with the intestinal microflora.</a> ILAR Journal. 56 (2), 218-227 (2015).</li><li>Taguer, M., Maurice, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+interplay+of+diet,+xenobiotics,+and+microbial+metabolism+in+the+gut:+implications+for+clinical+outcomes.">The complex interplay of diet, xenobiotics, and microbial metabolism in the gut: implications for clinical outcomes.</a> Clinical Pharmacology &amp; Therapeutics. 99 (6), 588-599 (2016).</li><li>Anubhav, D., Meenakshi, S., Shankar, G. T., Mande, S. S., Wilson, B. 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D., Boers, S. A., van der Spek, P. J., Jansen, R., Hays, J. P., Stubbs, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galaxy+mothur+Toolset+(GmT):+a+user-friendly+application+for+16S+rRNA+gene+sequencing+analysis+using+mothur.">Galaxy mothur Toolset (GmT): a user-friendly application for 16S rRNA gene sequencing analysis using mothur.</a> GigaScience. , (2018).</li><li>Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na&#239;ve+Bayesian+classifier+for+rapid+assignment+of+rRNA+sequences+into+the+new+bacterial+taxonomy.">Na&#239;ve Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5261-5267 (2007).</li><li>Schloss, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introducing+mothur:+open-source,+platform-independent,+community-supported+software+for+describing+and+comparing+microbial+communities.">Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7537-7541 (2009).</li><li>Bai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+on+the+in+vitro+effects+of+pseudomonas+aeruginosa+and+seaweed+alginates+on+human+gut+microbiota.">Comparative study on the in vitro effects of pseudomonas aeruginosa and seaweed alginates on human gut microbiota.</a> Plos One. 12 (2), e0171576 (2017).</li><li>Zhang, Z., Xie, J., Zhang, F., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-layer+chromatography+for+the+analysis+of+glycosaminoglycan+oligosaccharides.">Thin-layer chromatography for the analysis of glycosaminoglycan oligosaccharides.</a> Analytical Biochemistry. 371, 118-120 (2007).</li><li>Simon, J. C., Marchesi, J. R., Mougel, C., Selosse, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-microbiota+interactions:+from+holobiont+theory+to+analysis.">Host-microbiota interactions: from holobiont theory to analysis.</a> Microbiome. 7 (5), (2019).</li><li>Postler, T. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Holobiont:+how+microbial+metabolites+affect+human+health+and+shape+the+immune+system.">Understanding the Holobiont: how microbial metabolites affect human health and shape the immune system.</a> Cell Metabolism. 26 (1), 110-130 (2017).</li><li>Kramer, P., Bressan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humans+as+superorganisms:+how+microbes,+viruses,+imprinted+genes,+and+other+selfish+entities+shape+our+behavior.">Humans as superorganisms: how microbes, viruses, imprinted genes, and other selfish entities shape our behavior.</a> Perspectives on Psychological Science. 10 (4), 464-481 (2015).</li><li>Malfertheiner, P., Nardone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbiota:+the+forgotten+organ.">Gut microbiota: the forgotten organ.</a> Digestive Diseases. 29 (6), (2011).</li><li>Andoh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+is+a+new+organ+in+our+body.">The gut microbiota is a new organ in our body.</a> The Japanese journal of Gastro-Enterology. 112 (11), 1939-1946 (2015).</li><li>Mika, A., Van, W. T., Gonz&#225;lez, A., Herrera, J. J., Knight, R., Fleshner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+is+more+effective+at+altering+gut+microbial+composition+and+producing+stable+changes+in+lean+mass+in+juvenile+versus+adult+male+f344+rats.">Exercise is more effective at altering gut microbial composition and producing stable changes in lean mass in juvenile versus adult male f344 rats.</a> PLoS One. 10 (5), e0125889 (2015).</li><li>Hugenholtz, F., de Vos, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+human+intestinal+microbiota+research:+a+critical+evaluation.">Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).</li><li>Takagi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-batch+fermentation+system+to+simulate+human+colonic+microbiota+for+high-throughput+evaluation+of+prebiotics.">A single-batch fermentation system to simulate human colonic microbiota for high-throughput evaluation of prebiotics.</a> PLoS One. 11 (8), e0160533 (2016).</li><li>Ning, T., Gong, X., Xie, L., Ma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbiota+analysis+in+rats+with+methamphetamine-induced+conditioned+place+preference.">Gut microbiota analysis in rats with methamphetamine-induced conditioned place preference.</a> Frontiers in Microbiology. 8 (1), 1620 (2017).</li></ol>

Sono stati compiuti progressi significativi verso la comprensione della composizione e delle attività del microbiota intestinale umano nell'ultimo decennio. Come conseguenza di questi studi, è emerso il concetto olobionte, che rappresenta le interazioni tra gli ospiti e le comunità microbiche associate, come tra gli esseri umani e il loro microbiota intestinale19,20. Inoltre, gli esseri umani sono ancora ora considerati come superorganismi21<...

Il microbiota intestinale svolge un ruolo importante nel funzionamento dell'intestino umano e nella salute dell'ospite. Di conseguenza, il microbiota intestinale è recentemente diventato un importante obiettivo per la prevenzione delle malattie e la terapia1. Inoltre, i batteri intestinali interagiscono con le cellule intestinali dell'ospite e regolano i processi fondamentali dell'ospite, comprese le attività metaboliche, le disponibilità dei nutrienti, la modulazione del sistema immunitario e persino la funzione cerebrale e il processo decisionale2,3 . Gli endobiotici hanno un notevole potenziale per influenzare la composizione batterica e la diversità del microbiota intestinale. Così, le interazioni tra endobiotici e microbiota intestinale umano hanno attirato l'attenzione crescente della ricerca4,5,6,7,8,9.
È difficile valutare le interazioni tra endobiotici e microbiota intestinali umani in vivo a causa della bioetica e dei vincoli economici. Ad esempio, gli esperimenti che studiano le interazioni tra endobiotici e microbiota intestinali umani non possono essere eseguiti senza il permesso della Food and Drug Administration, e il reclutamento di volontari è costoso. Di conseguenza, i modelli animali sono spesso utilizzati per tali indagini. Tuttavia, l'uso di modelli animali è limitato a causa di diverse composizioni di microbiota e diversità nelle comunità animali contro umane. Un metodo alternativo in vitro per esplorare le interazioni tra endobiotici e microbiota intestinale umano è attraverso l'uso di esperimenti di coltura batch.
Gli esopolioaccaridi (EPS) sono prebiotici che contribuiscono in modo significativo al mantenimento della salute umana10. EPS distinti che consistono in diverse composizioni monosaccoridi e strutture possono presentare funzioni distinte. Le analisi precedenti hanno determinato la composizione degli EPS Bif, che sono la xenobiotica rappresentativa mirata nell'attuale studio11. Tuttavia, gli effetti metabolici associati all'ospite non sono stati considerati per quanto riguarda la composizione e la diversità dell'EPS.
Il protocollo qui descritto utilizza il microbiota fecale di 12 volontari per fermentare gli EPS Bif. La cromatografia a strato sottile (TLC), il sequenziamento ad alta velocità a livello rRNA 16S e la cromatografia a gas (GC) vengono quindi utilizzati in combinazione per studiare le interazioni tra EPS e microbiota intestinale umano. I vantaggi distinti di questo protocollo rispetto agli esperimenti in vivo sono il suo basso costo ed evitare gli effetti interferenti dal metabolismo dell'ospite. Inoltre, il protocollo descritto può essere utilizzato in altri studi che studiano le interazioni tra endobiotici e microbiota intestinale umano.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>Use to filter samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4-mm Sieve</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>308080-99-1</td>
			<td>Use to prepare human fecal samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl &#946;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>X1010</td>
			<td>Use to prepare color plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71251</td>
			<td>Standard sample for SCFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YZ-1012214</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic chamber</td>
			<td>Electrotek&#160;</td>
			<td>AW 400SG</td>
			<td>Bacteria culture and fermentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>SANYO</td>
			<td>MLS-3750</td>
			<td>Use to autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto soytone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70178</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baking oven</td>
			<td>Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd</td>
			<td>DHG-9240A</td>
			<td>Use to heat and bake</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beef Extract</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8270</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bifidobacterium longum Reuter</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#174; 51870&#8482;</td>
			<td>Bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bile Salts</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YZ-1071304</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butyric</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>19215</td>
			<td>Standard sample for SCFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>C7250</td>
			<td>Salt solution of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary column</td>
			<td>SHIMADZU-GL</td>
			<td>InertCap FFAP (0.25 mm &#215; 30 m &#215; 0.25 &#956;m)</td>
			<td>Used to SCFA detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein Peptone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>39396</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Sorvall ST 8</td>
			<td>Use for centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoSO4.7H2O</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>C7490</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4.5H2O</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>203165</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine-HCl</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>L1550</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>Use to prepare vitamin K1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4.7H2O</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YZ-111614</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>399388</td>
			<td>Used to TLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas chromatography</td>
			<td>Shimadzu Corporation</td>
			<td>GC-2010 Plus</td>
			<td>Used to SCFA detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB10050</td>
			<td>Used for slurry preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8760</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>H8130</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30721</td>
			<td>Basic solution used to adjust the pH of the buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isobutyric</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46935-U</td>
			<td>Standard sample for SCFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isovaleric Acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>129542</td>
			<td>Standard sample for SCFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D9880</td>
			<td>Salt solution of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P9921</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P7392</td>
			<td>Salt solution of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl.3H2O</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>C8380</td>
			<td>Use to prepare color plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meat Extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich-Aldrich</td>
			<td>70164</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metaphosphoric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7350</td>
			<td>Standard sample for SCFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H2O</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>M8160</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>M8300</td>
			<td>Salt solution of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISEQ</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MiSeq 300PE system</td>
			<td>DNA sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnSO4.H20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8179</td>
			<td>Salt solution of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mupirocin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YZ-1448901</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YZ-100376</td>
			<td>Salt solution of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>792519</td>
			<td>Salt solution of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-2000</td>
			<td>NanoDrop Technologies</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>Determine DNA concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30620</td>
			<td>Basic solution used to adjust the pH of the buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-butanol</td>
			<td>ChemSpider</td>
			<td>71-36-3</td>
			<td>Used to TLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiCl2</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>746460</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orcinol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>447420</td>
			<td>Used to prepare orcinol reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>94425</td>
			<td>Standard sample for SCFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Stool Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>51504</td>
			<td>Extract bacterial genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ready-to-use PBS powder</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A610100-0001</td>
			<td>Used to prepare the lipid suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resazurin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>R8150</td>
			<td>Anaerobic Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Vacuum Concentrator</td>
			<td>LABCONCO</td>
			<td>CentriVap</td>
			<td>Use to prepare EPSs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starch</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YZ-140602</td>
			<td>Use to the carbon source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>150692</td>
			<td>Used to prepare orcinol reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 PCR</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1861096</td>
			<td>PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC aluminium sheets</td>
			<td>MerckMillipore</td>
			<td>116835</td>
			<td>Used to TLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Peptone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z699209</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7293</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8360</td>
			<td>Salt solution of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valeric</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75054</td>
			<td>Standard sample for SCFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin K1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V3501</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex oscillator</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>Vortex.Genie2</td>
			<td>Use to vortexing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1625</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4.7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z0251</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of interactions between endobiotics and human gut microbiota using in vitro bath fermentation systems

I microrganismi intestinali umani sono recentemente diventati un importante obiettivo di ricerca nella promozione della salute umana e nella prevenzione delle malattie. Di conseguenza, le indagini sulle interazioni tra endobiotici (ad esempio, farmaci e prebiotici) e microbiota intestinali sono diventate un importante argomento di ricerca. Tuttavia, gli esperimenti in vivo con volontari umani non sono ideali per tali studi a causa della bioetica e dei vincoli economici. Di conseguenza, sono stati utilizzati modelli animali per valutare queste interazioni in vivo. Tuttavia, gli studi sui modelli animali sono ancora limitati da considerazioni bioetica, oltre a diverse composizioni e diversità di microbiota negli animali rispetto all'uomo. Una strategia di ricerca alternativa è l'uso di esperimenti di fermentazione in batch che consentono di valutare le interazioni tra endobiotici e microbiota intestinale in vitro. Per valutare questa strategia, gli esocriteri bifidobatterici (Bif) sono stati utilizzati come xenobiotici rappresentativi. Poi, le interazioni tra Bif EPS e microbiota intestinale umano sono state studiate utilizzando diversi metodi come la cromatografia a strato sottile (TLC), l'analisi compositiva della comunità batterica con il sequenziamento ad alto valore del gene rRNA 16S e la cromatografia a gas di acidi grassi a catena corta (SCFA). Presentato qui è un protocollo per studiare le interazioni tra endobiotici e microbiota intestinale umano utilizzando sistemi di fermentazione in vitro. È importante sottolineare che questo protocollo può anche essere modificato per studiare le interazioni generali tra altri endobiotici e microbiota intestinali.

La produzione di Mucoid EPS potrebbe essere osservata nelle colture B. longum su piastre PYG dopo l'incubazione anaerobica per 72 h (Figura 1A). La centrifugazione dei graffi di coltura, seguita da precipitazioni enole e essiccazione, ha portato alla raccolta di EPS simili alla cellulosa (Figura 1B). L'EPS essiccato e l'amido solubile sono stati poi utilizzati come fonti di carbonio per le colture di fermentazione. TLC è stato utilizzato per l'analisi ...

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Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

Analisi delle interazioni tra endobiotici e microbiota intestinale umana utilizzando sistemi di fermentazione bagno in vitro

Descritto qui è un protocollo per studiare le interazioni tra endobiotici e microbiota intestinale umano utilizzando sistemi di fermentazione in vitro.

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...

Il nostro protocollo può essere ampiamente utilizzato per l'alta produttività e lo screening rapido delle interazioni tra endobiotici e microbiota intestinale umana. Basso costo ed evitare effetti di interferenza dal metabolismo dell'ospite. Questa procedura ha il potenziale per essere utilizzata nella diagnosi.In primo luogo, sciogliere BIF EPS e amido singolarmente in acqua calda su un agitatore magnetico per fare sia la concentrazione di otto grammi per litro. Nel mezzo di coltura di base preparato, VI, aggiungere 100 millilitri della soluzione BIF EPS per realizzare la soluzione coltura VI BIF. Aggiungere 100 millilitri della soluzione di amido per fare coltura VI amido soluzione.Autoclave i due supporti con fonte di carbonio, e il mezzo senza fonte di carbonio come controllo, a 121 gradi Celsius per 15 minuti. Lasciare raffreddare a temperatura ambiente e aggiungere fieno e cisteina. Trasferire un sottocampo di cinque millilitri di ogni tubi di media e coltura.E conservare in un'incubatrice anaerobica. Archiviare i supporti rimanenti a quattro gradi Celsius. Per preparare il campione fecale umano, trasferire un grammo di campione fecale fresco in 10 millilitri di PBS anaerobico molare 0,1 a pH sette in un bicchiere.Quindi utilizzare un'asta di vetro per mescolarla per ottenere un liquame. In una camera anaerobica, aggiungere 500 microlitri del liquame fecale filtrato nei tre mezzi di fermentazione preparati, singolarmente. Quindi, incubare a 37 gradi Celsius.Dopo 24 ore e 48 ore, raccogliere due millilitri di campioni fermentati nella camera anaerobica. E poi centrifugare fuori dalla camera a 6000 volte G, per tre minuti. Trasferire con cura i supernaganti in nuovi tubi di centrifuga che verranno utilizzati per l'analisi della degradazione del polisaccaride e le misurazioni degli acidi grassi a catena corta.Conservare i pellet di centrifugazione a 80 gradi Celsius. Caricare 0,2 microlitri dei supernaganti fermentati su ogni piastra di alluminio 60 TLC in gel di silice pre-rivestito e ruotare per diffondersi. Quindi utilizzare un asciugacapelli con aria calda per asciugare.Immergere un'estremità delle piastre campiostite in 20 millilitri di acido formico:n-butanolo:soluzione d'acqua per diversi minuti, fino a quando l'elettroforesi si estende quasi fino all'altra estremità. Quindi eserti i piatti con le forcette e asciugare con un asciugacapelli. Quindi immergere i piatti nel reagente orcinolo per due minuti per tingere.E asciugare di nuovo. Trasferire le piastre in un forno da forno a 120 gradi Celsius per riscaldare per tre minuti. Quindi scattare foto della piastra per valutare la degradazione dell'EPS misurando le bande TLC.Per studiare gli effetti dell'EPS sulla produzione di SCFA, aggiungere un millilitro dei supernatanti fermentati ai tubi di centrifuga a due millilitri e aggiungere 0,2 millilitri del 25% di peso/volume di acido metafosforico a ciascun campione. Vortice per mescolare accuratamente le soluzioni. Centrifugare le miscele a 13.000 volte G per 20 minuti.Nel frattempo, preparare soluzioni di acidi acetico, propionico, butirrico, isobutirrico, valerico e isovalerico da 120 millimolare in tubi. Aggiungere quindi un millilitro di ogni acido preparato ad un tubo contenente 1,2 millilitri di 25 peso/volume di acido metafosforico. E caricarli nella bottiglia campione dello strumento gascromatografico come cocktail standard.Togliere i tubi dalla centrifuga e trasferire i supernatanti in tubi freschi. Utilizzare una siringa dotata di filtro da 0,22 micron per filtrare i supernaganti in nuovi tubi per l'analisi gascromatografica. In questo studio, la produzione di mucoide EPS è stata osservata nelle colture di bifidobacterium longum su piastre PYG, dopo l'incubazione anaerobica per 72 ore.La centrifugazione dei graffi di coltura, seguita dalla precipitazione e dall'essiccazione dell'etanolo, ha portato alla raccolta di EPS simile alla cellulosa. L'analisi tlc ha rivelato che il tasso di degradazione dell'amido da parte del microbiota fecale umano era più veloce di quello del BIF EPS. Principal Coordinate Analysis mostra la cultura VI BIF e i gruppi di amido della coltura VI, raggruppati separatamente l'uno dall'altro, indicando che l'EPS e la disponibilità di amido modellano in modo differenziato le comunità batteriche fecali umane.L'analisi discriminante lineare sulle dimensioni degli effetti mostra che i generi collinsella, coprococcus, parabacteroides e rhodopseudomonas erano significativamente più abbondanti nei campioni di coltura VI BIF che nei campioni di amido della coltura VI. Inoltre, le misurazioni gc mostrano SCFA che sono stati misurati da colture di fermentazione incluse acidi acetico, propionico, isobutirrico, butirrico, isovalerico e valerico. Dopo la fermentazione per 24 ore e 48 ore, cinque delle sei concentrazioni di SCFA erano simili e non statisticamente diverse tra i gruppi di coltura VI BIF, coltura VI amido e coltura VI.Tuttavia, le concentrazioni di acido proprionico erano significativamente più elevate nel gruppo coltura VI BIF che nel gruppo dell'amido della coltura VI, dopo 48 ore di fermentazione. Eseguire questo esperimento in condizioni anaerobiche e quindi trasferire i campioni fissi in un incubatore anaerobico il prima possibile. Alcuni dei reagenti TLC sono pericolosi.Dovresti stare attento a usarli.

Research

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A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Modello per lo studio delle interazioni tra l&#39;uomo di sangue intero e l&#39;endotelio

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Un nuovo metodo per l&#39;analisi qualitativa multi-scala batterica biofilm su filamentose Fungal Colonies Utilizzando confocale e microscopia elettronica

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

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