Name: analysis of interactions between endobiotics and human gut microbiota using in vitro bath fermentation systems
Uploaded: 2019-08-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems at JoVE.com

本研究は、中国国家自然科学財団(No.31741109)、湖南自然科学財団(No.2018JJ3200)、湖南理工学大学応用特性規律の構築プログラムによって資金提供されました。私たちは、この原稿の準備中にその言語的援助のためにLetPub(www.letpub.com)に感謝します。

このプロトコルは、湖南理工学大学(中国湖南省)と浙江省権江大学(浙江省)の倫理委員会のガイドラインに従っています。
1. 細菌の調製
<ol><li>ビフィズス菌培地ブロスの調製<ol>
<li>蒸留水の950 mLで以下の成分を組み合わせる:肉エキス、5グラム/L。酵母エキス, 5グラム/L;カゼインペプトン, 10 g/L;大豆色, 5グラム/L;ブドウ糖, 10 グラム/L;K2HPO4,2.04 g/L;MgSO4</...

<ol>
	<li>Maarten, V. D. G., Blotti&#232;re Herv&#233;, M., Dor&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humans+as+holobionts:+implications+for+prevention+and+therapy.">Humans as holobionts: implications for prevention and therapy.</a> Microbiome. 6 (1), 81 (2018).</li><li>Allen, A. P., Dinan, T. G., Clarke, G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+psychology+of+the+human+brain-gut-microbiome+axis.">A psychology of the human brain-gut-microbiome axis.</a> Social and Personality Psychology Compass. 11 (4), e12309 (2017).</li><li>Arora, T., B&#228;ckhed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+and+metabolic+disease:+current+understanding+and+future+perspectives.">The gut microbiota and metabolic disease: current understanding and future perspectives.</a> Journal of Internal Medicine. 280, 39-349 (2016).</li><li>Maurice, C., Haiser, H., Turnbaugh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenobiotics+shape+the+physiology+and+gene+expression+of+the+active+human+gut+microbiome.">Xenobiotics shape the physiology and gene expression of the active human gut microbiome.</a> Cell. 152 (1-2), 39-50 (2013).</li><li>Carmody, R. N., Turnbaugh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-microbial+interactions+in+the+metabolism+of+therapeutic+and+diet-derived+xenobiotics.">Host-microbial interactions in the metabolism of therapeutic and diet-derived xenobiotics.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4173-4181 (2014).</li><li>Lu, K., Mahbub, R., Fox, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenobiotics:+interaction+with+the+intestinal+microflora.">Xenobiotics: interaction with the intestinal microflora.</a> ILAR Journal. 56 (2), 218-227 (2015).</li><li>Taguer, M., Maurice, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+interplay+of+diet,+xenobiotics,+and+microbial+metabolism+in+the+gut:+implications+for+clinical+outcomes.">The complex interplay of diet, xenobiotics, and microbial metabolism in the gut: implications for clinical outcomes.</a> Clinical Pharmacology &amp; Therapeutics. 99 (6), 588-599 (2016).</li><li>Anubhav, D., Meenakshi, S., Shankar, G. T., Mande, S. S., Wilson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenobiotic+metabolism+and+gut+microbiomes.">Xenobiotic metabolism and gut microbiomes.</a> PLoS One. 11 (10), e0163099 (2016).</li><li>Koppel, N., Rekdal, V. M., Balskus, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+transformation+of+xenobiotics+by+the+human+gut+microbiota.">Chemical transformation of xenobiotics by the human gut microbiota.</a> Science. 356 (6344), 1246-1257 (2017).</li><li>Hidalgo-Cantabrana, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+overview+and+biological+functions+of+exopolysaccharide+biosynthesis+in+Bifidobacterium+spp.">Genomic overview and biological functions of exopolysaccharide biosynthesis in Bifidobacterium spp.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 9-18 (2014).</li><li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+bifidobacteria-produced+exopolysaccharides+on+human+gut+microbiota+in+vitro.">Effects of bifidobacteria-produced exopolysaccharides on human gut microbiota in vitro.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. , 1-10 (2018).</li><li>Tang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbial+profile+is+altered+in+primary+biliary+cholangitis+and+partially+restored+after+UDCA+therapy.">Gut microbial profile is altered in primary biliary cholangitis and partially restored after UDCA therapy.</a> Gut. 67 (3), 534-541 (2018).</li><li>Kuczynski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+QIIME+to+analyze+16S+rRNA+gene+sequences+from+microbial+communities.">Using QIIME to analyze 16S rRNA gene sequences from microbial communities.</a> Current Protocols in Microbiology. 27 (1), 1-28 (2012).</li><li>Hiltemann, S. D., Boers, S. A., van der Spek, P. J., Jansen, R., Hays, J. P., Stubbs, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galaxy+mothur+Toolset+(GmT):+a+user-friendly+application+for+16S+rRNA+gene+sequencing+analysis+using+mothur.">Galaxy mothur Toolset (GmT): a user-friendly application for 16S rRNA gene sequencing analysis using mothur.</a> GigaScience. , (2018).</li><li>Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na&#239;ve+Bayesian+classifier+for+rapid+assignment+of+rRNA+sequences+into+the+new+bacterial+taxonomy.">Na&#239;ve Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5261-5267 (2007).</li><li>Schloss, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introducing+mothur:+open-source,+platform-independent,+community-supported+software+for+describing+and+comparing+microbial+communities.">Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7537-7541 (2009).</li><li>Bai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+on+the+in+vitro+effects+of+pseudomonas+aeruginosa+and+seaweed+alginates+on+human+gut+microbiota.">Comparative study on the in vitro effects of pseudomonas aeruginosa and seaweed alginates on human gut microbiota.</a> Plos One. 12 (2), e0171576 (2017).</li><li>Zhang, Z., Xie, J., Zhang, F., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-layer+chromatography+for+the+analysis+of+glycosaminoglycan+oligosaccharides.">Thin-layer chromatography for the analysis of glycosaminoglycan oligosaccharides.</a> Analytical Biochemistry. 371, 118-120 (2007).</li><li>Simon, J. C., Marchesi, J. R., Mougel, C., Selosse, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-microbiota+interactions:+from+holobiont+theory+to+analysis.">Host-microbiota interactions: from holobiont theory to analysis.</a> Microbiome. 7 (5), (2019).</li><li>Postler, T. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Holobiont:+how+microbial+metabolites+affect+human+health+and+shape+the+immune+system.">Understanding the Holobiont: how microbial metabolites affect human health and shape the immune system.</a> Cell Metabolism. 26 (1), 110-130 (2017).</li><li>Kramer, P., Bressan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humans+as+superorganisms:+how+microbes,+viruses,+imprinted+genes,+and+other+selfish+entities+shape+our+behavior.">Humans as superorganisms: how microbes, viruses, imprinted genes, and other selfish entities shape our behavior.</a> Perspectives on Psychological Science. 10 (4), 464-481 (2015).</li><li>Malfertheiner, P., Nardone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbiota:+the+forgotten+organ.">Gut microbiota: the forgotten organ.</a> Digestive Diseases. 29 (6), (2011).</li><li>Andoh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+is+a+new+organ+in+our+body.">The gut microbiota is a new organ in our body.</a> The Japanese journal of Gastro-Enterology. 112 (11), 1939-1946 (2015).</li><li>Mika, A., Van, W. T., Gonz&#225;lez, A., Herrera, J. J., Knight, R., Fleshner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+is+more+effective+at+altering+gut+microbial+composition+and+producing+stable+changes+in+lean+mass+in+juvenile+versus+adult+male+f344+rats.">Exercise is more effective at altering gut microbial composition and producing stable changes in lean mass in juvenile versus adult male f344 rats.</a> PLoS One. 10 (5), e0125889 (2015).</li><li>Hugenholtz, F., de Vos, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+human+intestinal+microbiota+research:+a+critical+evaluation.">Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).</li><li>Takagi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-batch+fermentation+system+to+simulate+human+colonic+microbiota+for+high-throughput+evaluation+of+prebiotics.">A single-batch fermentation system to simulate human colonic microbiota for high-throughput evaluation of prebiotics.</a> PLoS One. 11 (8), e0160533 (2016).</li><li>Ning, T., Gong, X., Xie, L., Ma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbiota+analysis+in+rats+with+methamphetamine-induced+conditioned+place+preference.">Gut microbiota analysis in rats with methamphetamine-induced conditioned place preference.</a> Frontiers in Microbiology. 8 (1), 1620 (2017).</li></ol>

過去10年間にわたり、ヒト腸内微生物叢の組成と活動の理解に向けて大きな進歩が見られました。これらの研究の結果として、ホロビオエント概念が出現し、ヒトと腸内微生物叢19、20との間のような宿主および関連する微生物群相との相互作用を表す。さらに、ヒトは現在でも超生物21とみなされ、腸内微生物叢はヒト22、23にお?...

腸内細菌叢は、人間の腸の機能と宿主の健康に重要な役割を果たしています。その結果、腸内微生物叢は最近、疾患予防と治療の重要な標的となっている1.さらに、腸内細菌は宿主腸細胞と相互作用し、代謝活動、栄養利用性、免疫系変調、さらには脳機能と意思決定を含む基本的な宿主プロセスを調節する2、3.内生生物は、腸内微生物叢の細菌組成と多様性に影響を与えるかなりの可能性を持っています。したがって、内生生物とヒト腸内微生物叢との相互作用は、研究の注目を集めている 4,5,6,7, 8,9.
生体倫理と経済的制約のために生体内の内生生物とヒト腸内微生物叢との相互作用を評価することは困難である。例えば、内生生物とヒト腸内微生物叢の相互作用を調べた実験は、食品医薬品局の許可なしには行うことができず、ボランティアの募集は高価です。その結果、動物モデルは、多くの場合、このような調査のために使用されます。しかし、動物モデルの使用は、異なる微生物叢組成物と動物対ヒト関連のコミュニティにおける多様性のために制限される。内生生物とヒト腸内微生物叢との相互作用を探索するインビトロ法は、バッチ培養実験を用いて行う。
外食糖(EPS)は、ヒトの健康の維持に著しく寄与するプレバイオティクスである10.異なる単糖組成物と構造からなる異なるEPSは、異なる機能を示すことができます。これまでの分析では、現在の研究11で標的とされる代表的な異種生物学であるBif EPSの組成を決定した。しかし、宿主関連代謝効果はEPS組成および多様性に関して考慮されていない。
ここで説明するプロトコルは、12人のボランティアからBif EPSを発酵させるfecal微生物叢を使用する。薄層クロマトグラフィー(TLC)、16S rRNA遺伝子ハイスループットシーケンシング、およびガスクロマトグラフィー(GC)を組み合わせて、EPSとヒト腸内微生物叢との相互作用を調べます。生体内実験と比較して、このプロトコルの明確な利点は、ホストの代謝からの干渉効果の低コストおよび回避である。さらに、記載されたプロトコルは、内生生物とヒト腸内微生物叢との相互作用を調査する他の研究で使用することができる。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>Use to filter samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4-mm Sieve</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>308080-99-1</td>
			<td>Use to prepare human fecal samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl &#946;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>X1010</td>
			<td>Use to prepare color plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71251</td>
			<td>Standard sample for SCFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YZ-1012214</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic chamber</td>
			<td>Electrotek&#160;</td>
			<td>AW 400SG</td>
			<td>Bacteria culture and fermentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>SANYO</td>
			<td>MLS-3750</td>
			<td>Use to autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto soytone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70178</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baking oven</td>
			<td>Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd</td>
			<td>DHG-9240A</td>
			<td>Use to heat and bake</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beef Extract</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8270</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bifidobacterium longum Reuter</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#174; 51870&#8482;</td>
			<td>Bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bile Salts</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YZ-1071304</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butyric</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>19215</td>
			<td>Standard sample for SCFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>C7250</td>
			<td>Salt solution of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary column</td>
			<td>SHIMADZU-GL</td>
			<td>InertCap FFAP (0.25 mm &#215; 30 m &#215; 0.25 &#956;m)</td>
			<td>Used to SCFA detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein Peptone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>39396</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Sorvall ST 8</td>
			<td>Use for centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoSO4.7H2O</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>C7490</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4.5H2O</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>203165</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine-HCl</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>L1550</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>Use to prepare vitamin K1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4.7H2O</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YZ-111614</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>399388</td>
			<td>Used to TLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas chromatography</td>
			<td>Shimadzu Corporation</td>
			<td>GC-2010 Plus</td>
			<td>Used to SCFA detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB10050</td>
			<td>Used for slurry preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8760</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>H8130</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30721</td>
			<td>Basic solution used to adjust the pH of the buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isobutyric</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46935-U</td>
			<td>Standard sample for SCFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isovaleric Acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>129542</td>
			<td>Standard sample for SCFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D9880</td>
			<td>Salt solution of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P9921</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P7392</td>
			<td>Salt solution of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl.3H2O</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>C8380</td>
			<td>Use to prepare color plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meat Extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich-Aldrich</td>
			<td>70164</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metaphosphoric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7350</td>
			<td>Standard sample for SCFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H2O</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>M8160</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>M8300</td>
			<td>Salt solution of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISEQ</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MiSeq 300PE system</td>
			<td>DNA sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnSO4.H20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8179</td>
			<td>Salt solution of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mupirocin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YZ-1448901</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YZ-100376</td>
			<td>Salt solution of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>792519</td>
			<td>Salt solution of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-2000</td>
			<td>NanoDrop Technologies</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>Determine DNA concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30620</td>
			<td>Basic solution used to adjust the pH of the buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-butanol</td>
			<td>ChemSpider</td>
			<td>71-36-3</td>
			<td>Used to TLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiCl2</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>746460</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orcinol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>447420</td>
			<td>Used to prepare orcinol reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>94425</td>
			<td>Standard sample for SCFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Stool Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>51504</td>
			<td>Extract bacterial genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ready-to-use PBS powder</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A610100-0001</td>
			<td>Used to prepare the lipid suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resazurin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>R8150</td>
			<td>Anaerobic Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Vacuum Concentrator</td>
			<td>LABCONCO</td>
			<td>CentriVap</td>
			<td>Use to prepare EPSs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starch</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YZ-140602</td>
			<td>Use to the carbon source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>150692</td>
			<td>Used to prepare orcinol reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 PCR</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1861096</td>
			<td>PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC aluminium sheets</td>
			<td>MerckMillipore</td>
			<td>116835</td>
			<td>Used to TLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Peptone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z699209</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7293</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8360</td>
			<td>Salt solution of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valeric</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75054</td>
			<td>Standard sample for SCFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin K1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V3501</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex oscillator</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>Vortex.Genie2</td>
			<td>Use to vortexing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1625</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4.7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z0251</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of interactions between endobiotics and human gut microbiota using in vitro bath fermentation systems

近年、ヒトの腸内微生物は、人間の健康を促進し、病気を予防する研究の重要なターゲットとなっています。その結果、内生生物(例えば、薬物およびプレバイオティクス)と腸内微生物叢との相互作用の研究は重要な研究テーマとなっている。しかし、人間のボランティアとの生体内実験では、生命倫理と経済的制約のために、このような研究には理想的ではありません。その結果、動物モデルは、生体内でのこれらの相互作用を評価するために使用されている。それにもかかわらず、動物モデル研究は、動物とヒトの微生物叢の組成や多様性に加えて、生物倫理の考慮事項によって依然として制限されています。別の研究戦略は、インビトロで内生生物と腸内微生物叢の相互作用の評価を可能にするバッチ発酵実験の使用です。この戦略を評価するために、ビフィズス菌(Bif)外糖(EPS)を代表的な異生物性として使用した。次に、Bif EPSとヒト腸内微生物叢との相互作用を、薄層クロマトグラフィー(TLC)、16S rRNA遺伝子ハイスループットシーケンシングによる細菌コミュニティ組成解析、ガスクロマトグラフィーなどのいくつかの方法を用いて検討した。短鎖脂肪酸(SCFA)の。ここでは、インビトロバッチ発酵システムを用いて内生生物とヒト腸内微生物叢との相互作用を調査するプロトコルを提示する。重要なことに、このプロトコルは、他の内生生物と腸内微生物叢間の一般的な相互作用を調査するために変更することもできます。

粘膜EPSの産生は、72時間の嫌気性インキュベーション後のPYGプレート上のB.ロング培養において観察された(図1A)。培養スクローの遠心分離は、続いてエタノール沈殿および乾燥、セルロース様EPSの採取をもたらした(図1B)。乾燥EPSおよび可溶性デンプンは、次いで発酵培養のための炭素源として使用された。TLCは、その低コストおよび迅速な?...

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Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

インビトロバス発酵システムを用いて内生生物とヒト腸内細菌叢との相互作用の解析

ここで説明する内生生物とヒト腸内微生物叢との相互作用をインビトロバッチ発酵システムを用いて調べるプロトコルである。

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...

当社のプロトコルは、高スループットと内生剤とヒト腸内微生物叢の相互作用の迅速なスクリーニングに広く使用することができます。低コストで、ホストの新陳代謝による干渉効果の回避この手順は、診断に使用される可能性があります。まず、BIF EPSとデンプンを磁気攪拌機の熱湯に個別に溶解し、1リットル当たり8グラムの濃度を両立させます。調製した塩基性培養培地に、VI、BIF EPS溶液を100ミリリットル加えて、培養VI BIF溶液を作る。培養VIデンプン溶液を作るためにデンプン溶液の100ミリリットルを追加します。炭素源で2つの媒体をオートクレーブし、炭素源を制御しない媒体を摂氏121度で15分間オートクレーブする。彼らは室温に冷却し、干し草とシステインを追加することができます。各培地の5ミリリットルのサブサンプルを培養管に移す。そして嫌気性のインキュベーターで保管してください。残りのメディアは摂氏4度で保存します。ヒトの便サンプルを調製するには、新鮮な便サンプルの1グラムをガラスビーカーのpH 7で0.1モル嫌気性PBSの10ミリリットルに移します。その後、スラリーを達成するためにそれを攪拌するためにガラス棒を使用しています。嫌気性チャンバーでは、3つの調製された発酵培地に、濾過された便スラリーの500マイクロリットルを個別に加える。その後、摂氏37度でインキュベートします。24時間と48時間後、嫌気室に発酵サンプルを2ミリリットル収集します。そして、チャンバーの外の遠心分離機を6000倍Gで、3分間行う。上清を多糖類分解解析および短鎖脂肪酸測定に使用する新しい遠心管に慎重に移します。遠心分離ペレットを摂氏80度で保存します。各プレコートシリカゲル60 TLCアルミニウム板に発酵上清の0.2マイクロリットルをロードし、広げるために渦巻く。その後、乾燥するために熱気とヘアドライヤーを使用してください。サンプルプレートの一方の端を20ミリリットルのギ酸に浸します:n-ブタノール:水溶液は、電気泳動がほぼ他方の端まで延びるまで数分間浸します。その後、鉗子でプレートを取り出し、ヘアドライヤーで乾燥させます。その後、オルシノール試薬にプレートを2分間浸して染めます。そして、再び乾燥します。プレートを120度のベーキングオーブンに移し、3分間加熱します。次に、プレートの写真を撮って、TLCバンドを測定してEPSの劣化を評価します。SCFA生産に対するEPSの効果を調べるために、発酵した上清の1ミリリットルを2ミリリットルの遠心管に加え、各サンプルに25重量/体積%の25重量/体積%を0.2ミリリットル加えます。溶液を完全に混合する渦。混合物を13,000倍Gで20分間遠心分離する。その間、120ミリモル酢酸、プロピオン性、酪酸、同位体、バリック、およびイソ球酸の溶液をチューブに調製する。次に、調製した各酸の1ミリリットルを、25重量/体積%のメタリン酸の1.2ミリリットルを含むチューブに加えます。そして、標準的なカクテルとしてガスクロマトグラフィー器具のサンプルボトルにそれらをロードします。遠心分離機からチューブを取り出し、上清を新鮮なチューブに移します。0.22ミクロンフィルターを搭載したシリンジを使用して、ガスクロマトグラフィー分析のために上澄みを新しいチューブにフィルターします。本研究では、粘膜EPSの産生がPYGプレート上のビフィズス菌ロンガム培養で、72時間の嫌気性インキュベーション後に観察された。培養用擦り傷の遠心分離、続いてエタノール沈殿および乾燥により、セルロース様EPSの回収が行われた。TLC分析の結果、ヒトの便微小生物によるデンプンの分解速度はBIF EPSよりも速いことが明らかになった。主な座標分析は、培養VI BIFおよび培養VIデンプン群を示し、互いに別々にクラスター化し、EPSおよびデンプンの可用性がヒトの便細菌群を異なって形成することを示す。効果サイズに関する線形判別分析は、ジェネラコリンゼラ、コプロコッカス、パラバクテロイド、およびロドシュードモナスが培養VIデンプンサンプルよりも培養VI BIFサンプルに有意に豊富であったことを示す。さらに、GC測定は、酢酸、プロピオン性、同位体、酪酸、イソ球酸、およびババラ酸を含む発酵培養物から測定されたSCFAを示す。24時間48時間の発酵後、6つのSCFA濃度のうち5基は類似しており、培養VIBIF、培養VIデンプン、および培養VI群間で統計的に異ならなかった。しかしながら、培養VIデンプン基よりも培養VIBIF群においてプロプリオン酸濃度が有意に高く、48時間の発酵後であった。この実験を嫌気条件下で行い、固いサンプルをできるだけ早く嫌気性インキュベーターに移します。TLC試薬の一部は危険です。それらを使用するように注意する必要があります。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

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