Name: injecting gryllus bimaculatus eggs
Uploaded: 2019-08-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Injecting Gryllus bimaculatus Eggs at JoVE.com

وقد تم دعم البحوث الواردة في هذا المشروع من قبل جائزة التنمية المؤسسية (IDeA) من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم المنحة P20GM10342 إلى HH3، ورقم جائزة NSF IOS-1257217 إلى الفريق.

1. إعداد الأجهزة وإعداد المواد
ملاحظة: يرجى الاطلاع على الجدول 1 وجدول المواد لإعداد الحلول والكاشف وتفاصيل المعدات.
<ol><li>إعداد مجهر تشريح من أجل رؤية البيض وتوجيه إبرة الحقن. (الشكل1A يظهر مجهر تشريح مجهزة الفلورة.) القدرة على الفل...

<ol>
	<li>Abzhanov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+there+yet?+Tracking+the+development+of+new+model+systems.">Are we there yet? Tracking the development of new model systems.</a> Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).</li><li>Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+August+Krogh+principle:+&#8220;For+many+problems+there+is+an+animal+on+which+it+can+be+most+conveniently+studied.">The August Krogh principle: &#8220;For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied.</a> Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).</li><li>Krogh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Progress+of+Physiology.">The Progress of Physiology.</a> American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).</li><li>Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cricket neurobiology and behavior. , (1989).</li><li>Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , (2017).</li><li>Misof, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenomics+resolves+the+timing+and+pattern+of+insect+evolution.">Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution.</a> Science. 346 (6210), 763-767 (2014).</li><li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+transgenic+cricket+embryos+reveals+cell+movements+consistent+with+a+syncytial+patterning+mechanism.">Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism.</a> Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).</li><li>Shinmyo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac-mediated+somatic+transformation+of+the+two-spotted+cricket,+Gryllus+bimaculatus.">piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Development, growth &amp; differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).</li><li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-transgenic+genome+modifications+in+a+hemimetabolous+insect+using+zinc-finger+and+TAL+effector+nucleases.">Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases.</a> Nature communications. 3, 1017 (2012).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).</li><li>Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+crickets+for+the+study+of+learning+and+memory:+Dopamine+receptor+Dop1+mediates+aversive+but+not+appetitive+reinforcement+in+crickets.">Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets.</a> Scientific Reports. 5, 15885 (2015).</li><li>Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+in+the+Cricket.">Protocols in the Cricket.</a> The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).</li><li>Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Editing+in+the+Cricket,+Gryllus+bimaculatus.">Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).</li><li>Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch/Delta+signalling+is+not+required+for+segment+generation+in+the+basally+branching+insect+Gryllus+bimaculatus.">Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus.</a> Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).</li><li>Miyawaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Wingless/Armadillo+signaling+in+the+posterior+sequential+segmentation+in+the+cricket,+Gryllus+bimaculatus+(Orthoptera),+as+revealed+by+RNAi+analysis.">Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis.</a> Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).</li><li>Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+live-imaging+of+embryos+in+microwell+arrays+using+a+modular+specimen+mounting+system.">High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system.</a> Biology Open. 7 (7), bio031260 (2018).</li><li>Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+is+required+for+the+generation+of+primordial+germ+cells+in+an+insect.">BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect.</a> Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).</li><li>Larson, E., Andres, J., Harrison, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+male+ejaculate+on+post-mating+prezygotic+barriers+in+field+crickets.">Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets.</a> PLOS ONE. 7 (10), e46202 (2012).</li><li>Donoughe, S., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+development+of+the+cricket+Gryllus+bimaculatus.">Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus.</a> Developmental Biology. , (2016).</li><li>Matsuoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+germ+insects+utilize+both+the+ancestral+and+derived+mode+of+Polycomb+group-mediated+epigenetic+silencing+of+Hox+genes.">Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes.</a> Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).</li><li>Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heads+and+tails:+Evolution+of+antero-posterior+patterning+in+insects.">Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects.</a> Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).</li><li>Bacon, J., Strausfeld, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonrandom+resolution+of+neuron+arrangements.">Nonrandom resolution of neuron arrangements.</a> Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).</li></ol>

التحديات الرئيسية اثنين مع هذه التقنية هي القضايا ذات الصلة من حجم إبرة الأمثل والقدرة على البقاء. على الرغم من أن الإبر الصغيرة تحسن القدرة على البقاء على قيد الحياة، فإن الإبر ذات اللومن الأضيق لديها درجة أكبر من القوى الشعرية في العمل، مما يجعل من المرجح أن ينتقل صفار البيض إلى الإبرة م...

القدرة على تعديل الجينوم أو التأثير على التعبير الجيني في الكائنات الحية هو الأساس لتصميم أنواع كثيرة من التجارب اختبار السببية الوظيفية. ومن الأهمية بمكان أيضاً بالنسبة للعمل المقارن والتطوري ذي الصلة أن تكون تقنيات التعديل الجينومي وغير الجينومي متاحة في الكائنات الحية خارج النظم التقليدية النموذجية للمختبرات الوراثية الحيوانية (مثل موسوكولوس، ودانيو rerio, Drosophila melanogaster, وCaenorhabditis elegans). سواء كانت الرغبة في فهم التنوع الحي1 أو التزام المرء بمبدأ كروغ، أنه لكل سؤال بيولوجي هناك كائن أكثر ملاءمة لحلها 2،3،والقدرة على تعديل الجينوم أو التأثير على التعبير الجيني ضروري للتصاميم التجريبية الحديثة.
الكريكيت Gryllus bimaculatus هو نظام نموذج الناشئة. تستخدم في القرن الماضي في تجارب علم الأعصاب4، شهد العقدان الماضيان اهتماما تجريبيا متزايدا في الكريكيت ، وخاصة ركزت على تطور وتطور هذا الكائنالحي 5. الكريكيت هو حشرة هيمتابولوس التي تتفرع بشكل خاص إلى الحشرات الهولوميتابولوس مدروسة جيدا، مثل D. melanogaster وTribolium castaneum6. نظرا لموقعها المفيد على شجرة التطور ، والعلماء مهتمون في طرح الأسئلة التجريبية الحديثة والمتطورة في هذه الحشرة ، مما أدى إلى اهتمام متزايد في تكييف الأدوات الجزيئية للاستخدام في G. bimaculatus.
ويمكن استخدام حقن الكواشف الجزيئية في بيض الكريكيت لتجارب التعديل الجينومي وكذلك التلاعب اتلاف التعبير الجيني في الأجنة. على سبيل المثال، تم إنشاء المعدلة وراثيا G. bimaculatus تحمل الإدراج eGFP باستخدام piggyBactransposase7،8. وقد نجح المحققون في إنشاء ضربة قاضية G. bimaculatus باستخدام nucleases الزنك الإصبع (ZFNs) والنسخ المنشط مثل (TAL) تأثير nucleases (TALENs) لإدخال فواصل مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل في مناطق جينية محددة9. على الرغم من أن ZFNs وTALENs تسمح باستهداف مواقع محددة في الحيوانات خارج الأنظمة النموذجية الأربعة الكبيرة، إلا أن هذه الكواشف قد تم تجاوزها بسرعة من خلال نظام CRISPR/Cas9، الذي هو أبسط للاستخدام، وأكثر كفاءة، ومرنة للغاية10. وقد استخدم كريسبر في G. bimaculatus لإنتاج خروج المغلوب11 وكذلك ضرب في خطوط12،13 بالإضافة إلى تعديل الجينوم ، يمكن حقن dsRNA في البيض لهدم التعبير mRNA في تطوير الأجنة، مما يسمح للمحققين لفهم دور نسخ محددة في جميع أنحاء التنمية14،15. وقد نشرت بعض التفاصيل المحدودة حول كيفية حقن بيض الكريكيت سابقا12.
هنا، ونحن نصف بروتوكول مفصل لحقن البيض في وقت مبكر G. bimaculatus. هذا البروتوكول فعال وقابل للتكيف بسهولة مع مختلف البيئات المختبرية، ومواد الحقن، وربما مع الحشرات الأخرى. في حين تم نشر تفاصيل إضافية لتصميم وتنفيذ التعديل الجيني والتجارب ضربة قاضية في مكان آخر12,13, هذه النهج سوف تعتمد في نهاية المطاف على بروتوكول الحقن مفصلة هنا.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluorescent dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165 FC</td>
			<td>Stereomicroscope with fluorescence</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External light source for fluorescence</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EL 6000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-300</td>
			<td>-Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry filter cube</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M205FA/M165FC</td>
			<td>Filter cube for mCherry or similar red dye will work</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>M3301R</td>
			<td>Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MMO-202ND</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Holder (Needle holder)</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>HD-21</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Tubing to connect air source to microinjector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg well stamp</td>
			<td>3D printed</td>
			<td>custom</td>
			<td>3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator or temperature controlled room</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>Temperatures of 23.5-26&#176;C are needed.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cricket food</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>cat food or fish flakes are appropriate food.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cricket wter</td>
			<td>vairous</td>
			<td></td>
			<td>Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cricket shelter</td>
			<td>arious</td>
			<td></td>
			<td>Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary tubes</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>Item no. 1B100F-4</td>
			<td>Kwik-Fil&#8482; Borosilicate Glass Capillaries, 100mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Flaming/Brown</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td>Distributed by Sutter Instrument Co.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beveller/Micro grinder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>Model EG-45/EG-400</td>
			<td>EG-400 includes a microscope head</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>Product code 229693</td>
			<td>90mm diameter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Play Sand</td>
			<td>Sandtastik Products Ltd.</td>
			<td>B003U6QLVS</td>
			<td>White play sand</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB000972</td>
			<td>Agarose GPG/LE ultrapure</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers</td>
			<td>US Kitchen Supply</td>
			<td>Model SS-C123</td>
			<td>Pore size should be between 0.5 - 1.0 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>Ref 15070-063</td>
			<td>Pen Strep</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tweezers</td>
			<td>Sipel Electronic SA</td>
			<td>P3C-STD</td>
			<td>Black Static Dissipative, 118mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filters, 25mm diameter, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>725-2545</td>
			<td>Use with 1 ml syringe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309602</td>
			<td>Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air tank (optional)</td>
			<td>Midwest Products</td>
			<td>Air Works&#174;</td>
			<td>Portable air tank</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Rhodamine dye</td>
			<td rowspan="2">Thermofisher</td>
			<td rowspan="2">D-1817</td>
			<td rowspan="2">dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL loading tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Order no. 5242 956.003</td>
			<td>epT.I.P.S. 20uL Microloader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axioskope 2 plus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X objective</td>
			<td>Ziess</td>
			<td>Plan-Apochromat 20x/0.75 M27</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMC 5400</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite&#160; software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LAS</td>
			<td>Version 4.6.2 used here</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injecting gryllus bimaculatus eggs

تغيير وظيفة الجينات في كائن حي النامية أمر أساسي لأنواع مختلفة من التجارب. في حين تم تطوير أدوات وراثية قوية للغاية في أنظمة النماذج التقليدية، فإنه من الصعب التعامل مع الجينات أو رسول RNA (mRNA) في معظم الكائنات الحية الأخرى. وفي الوقت نفسه، تعتمد النُهج التطورية والمقارنة على استكشاف وظيفة الجينات في العديد من الأنواع المختلفة، مما يستلزم تطوير وتكييف تقنيات التلاعب بالتعبير خارج نطاق الحشرات حالياً. الانواع. يصف هذا البروتوكول طريقة لحقن الكواشف في بيض الكريكيت لاختبار آثار التلاعب معين على التنمية الجنينية أو اليرقات. يتم وصف تعليمات حول كيفية جمع وحقن البيض مع الإبر البكرة. هذه التقنية واضحة نسبيا مرنة ويمكن أن تتكيف مع الحشرات الأخرى. يمكن للمرء جمع وحقن العشرات من البيض في تجربة واحدة، ومعدلات البقاء على قيد الحياة لحقن العازلة فقط تحسين مع الممارسة ويمكن أن تكون عالية كما 80٪. هذه التقنية سوف تدعم عدة أنواع من النهج التجريبية بما في ذلك حقن العوامل الدوائية، في المختبر توج mRNA للتعبير عن الجينات ذات الاهتمام، RNA المزدوج الذين تقطعت بهم السبل (dsRNA) لتحقيق تدخل الحمض النووي الريبي، واستخدام مجمعة بانتظام يُكرّر البَرَدّم القصير المُتداخل (CRISPR) بالتنسيق مع الكواشف المرتبطة بالبروتين 9 (Cas9) المرتبطة بـ CRISPR لتعديل الجينوم، والعناصر القابلة للتبديل لتوليد خطوط جينية عابرة أو مستقرة.

الصراصير بسهولة وضع البيض في المواد الرطبة، وتوفير المواد الكافية، مثل الرمال الرطبة أو الأوساخ، يدفعهم إلى وضع عدد كبير من البيض. وهذا فعال بشكل خاص إذا تم حرمان الكريكيت أولا من المواد زرع البيض لمدة 8-10 ح. البيض وضعت في وسادة نظيفة يمكن فصلها بسهولة، وجمعها (الشكل<strong cla...

Watch this Scientific Journal Video about Injecting Gryllus bimaculatus Eggs at JoVE.com

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

حقن Gryllus بيماكولاتوس البيض

هنا نقدم بروتوكول لحقن بيض الكريكيت، وهي تقنية التي تعمل كطريقة تأسيسية في العديد من التجارب في الكريكيت، بما في ذلك، على سبيل المثال لا الحصر، تدخل الحمض النووي الريبي والتلاعب الجينومي.

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been ...

هذه التقنية بمثابة طريقة تأسيسية للتجارب المصممة لم مقايسة الجنينية أو اليرقات التنمية من لعبة الكريكيت. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها مرنة وستدعم عدة أنواع من النهج التجريبية، مثل تلك التي تستخدم تدخل الحمض النووي الريبي أو التلاعب الجينومي. ومن خلال هذا الإجراء، سيكون هادلي ويلسون هورش، الباحث الرئيسي في المختبر.لبدء هذا الإجراء الرطب الطائرة طاحونة الغزل من المطوق مع المياه نازف. ضع الإبرة المسحوبة في الممشوق وحولها إلى زاوية 20 درجة. خفض الإبرة حتى مجرد لمس لوحة طحن وت شطبها لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق.تقييم شطبة عن طريق وضع إبرة مشطوف على الشريط عصا مزدوجة التي تم الالتزام بها شريحة المجهر الزجاجي. ضع الشريحة على خشبة مسرح مجهر مركب مجهز بكاميرا وبرنامج للحصول على الصور. الحصول على صورة من الإبرة باستخدام هدف 20x.استخدام برنامج التصوير لقياس قطر التجويف الداخلي للإبرة فقط قريبة لفتح مشطوف. تخلص من أي إبر ذات فتحة أصغر من ثمانية ميكرومترات أو أكبر من 12 ميكرومتر. أولاً، اصنع 40 ملليلتر من 1٪ agarose في الماء وسكبه في طبق بيتري طوله 10 سنتيمترات.وضع ختم البيض جيدا على سطح agarose قبل أن يتجمد. بمجرد أن يتم ترسيخ agarose ، وإزالة الطابع للكشف عن الآبار. المقبل, ملء لوحة بئر agarose مع HBS تحتوي على 1٪ البنسلين ستريبتوميسين.ضع الغطاء على الطبق، ولفه في بارا فيلم واخزنه عند أربع درجات مئوية. بعد هذا، ملء طبق بيتري 35 ملليمتر مع رمال الملعب الأبيض لجعل طبق جمع البيض للصراصر لوضع البيض في. غطي طبق البيض بمنشفة ورقية مربعة تقطع إلى حوالي 18 في 18 سنتيمترًا.ملء مع مياه الصنبور من خلال منشفة ورقية. ثم، إمالة طبق بيتري والضغط بلطف على الجزء العلوي لإزالة المياه الزائدة. ثني زوايا ساحة منشفة ورقية تحت الطبق ووضع طبق البيض في غطاء مقلوب مما يساعد على الحفاظ على منشفة ورقية في مكانها.ضع طبق البيض في سلة الكريكيت واسمح للإناث البالغات ببويض البيض لمدة ساعة إلى ساعتين. وفي الوقت نفسه، تسمح لطبق agarose لتدفئة إلى درجة حرارة الغرفة استعدادا لعقد البيض للحقن. عندما تكون جاهزة، قم بإزالة طبق جمع البيض، الذي يحتوي الآن على بيض مُنْضَن حديثاً، من صندوق الكريكيت.إزالة منشفة ورقية ووضع مصفاة مع حجم المسام بين 0.5 ومتر واحد ملليمتر فوق منقار. شطف محتويات طبق وضع البيض في المصفاة تحت مياه الصنبور الجارية بلطف. سوف تسقط الحبوب الرملية من خلال شبكة المصفاة في القارس أدناه في حين أن بيض الكريكيت يبقى في سلة المصفاة.املأ الحاوية بماء التناضح العكسي وضعه في صينية. عكس مصفاة على الحاوية والاستفادة منه ضد الطبق لإزاحة البيض في الماء. البيض سوف يغرق في الجزء السفلي من الحاوية.بعد ذلك، استخدم المقص لقطع طرف P1000 ماصة لجعل فتحة ما يقرب من ثلاثة ملليمترات في القطر. ضع هذه النصيحة على طرّب P1000، واستخدمه لنقل البيض من الحاوية إلى طبق قوالب البيض agarose. باستخدام ملاقط بلاستيكية، يصطف البيض في آبار أغاروز.كل بيضة سوف تغرق في الجزء السفلي من بئر الفرد. غطي طبق بيتري بغطاء حتى يصبح جاهزاً للحقن. للبدء، ضع طبق البيض تحت المجهر التشريحي وحدد تكبيرًا منخفضًا يبلغ حوالي 10x.ارسم 1.5 ميكرولتراتر من محلول الحقن باستخدام 20 نصائح تحميل ميكرولتر وماصة P10 وأدخل طرف التحميل في الطرف الواسع من إبرة الحقن. طرد محلول الحقن في إبرة الحقن. أدخل الإبرة في مسكن الحقن وشدها ، مع التأكد من إدخال الإبرة بشكل صحيح وبحزم في السكن.ثم أدخل بعناية في مسكن الحقن في ميكرومانبولاتور، مع الحرص على عدم كسر أو التعرض للأذى من قبل الإبرة. أثناء النظر إلى كل من البيض والإبرة من خلال المجهر ، حرّك الإبرة بالقرب من X في الزاوية اليسرى العليا من شبكة الطبق. خفض الإبرة حتى تلميح يدخل HBS بالإضافة إلى البنسلين ستريبتوميسين حل المخزن المؤقت في الطبق.مركز الإبرة في مجال الرؤية وتحريك طبق البيض بحيث الإبرة هي بضعة ملليمترات أقرب إلى حافة الطبق من البيض. بعد ذلك، تعيين المجهر إلى مرشح مناسبة لرودامين لمراقبة الفلوريس في الإبرة والتركيز على طرف لها. على الحقن المجهري ببطء تحويل مقبض الباب التوازن في اتجاه عقارب الساعة حتى يبدأ حل الحقن لتسرب من الإبرة في حل التعليق.ثم بدوره مقبض الباب مرة أخرى عكس عقارب الساعة قليلا حتى صبغ فقط يتوقف تسرب من الإبرة. مع الإبرة لا تزال تتمحور في مجال الرؤية، ونقل طبق البيض بحيث يتم توجيه الإبرة في البيضة التي سيتم حقنها أولا. ضبط التكبير إلى حوالي 50x بحيث تملأ بيضة واحدة معظم مجال الرؤية.استخدام كل من micromanipulator ويد واحدة على طبق البيض لتحريك الإبرة في موقف للحقن. استخدم المايكرومانيبولاتر لتقدم الإبرة وأدخل الطرف في أول بيضة يتم حقنها، مع التأكد من إدخال الإبرة عند 20 إلى 30٪ من طول البيض من الطرف الخلفي لتعامد البيض على المحور الطويل للبيضة. حقن الحل مع إما دواسة القدم حقن أو زر الحقن على الحقن.تشير bolة صغيرة من المواد الفلورية داخل البيضة إلى الحقن الناجح. بعد ذلك، تراجع الإبرة من البيضة. إذا تم رفع البيضة عن غير قصد من بئرها عند التراجع عن الإبرة ، استخدم ملقطًا صغيرًا لدفع البيضة مرة أخرى إلى البئر أثناء سحب الإبرة.في هذه الدراسة، يتم حقن بيض الكريكيت باستخدام تقنية تعمل كطريقة تأسيسية في العديد من التجارب، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر، تدخل الحمض النووي الريبي والتلاعب الجينومي. معدل البقاء على قيد الحياة هو معلمة هامة لتقييم نجاح هذه التجربة. معظم البيض الميت يمكن بسهولة أن تحدد عن طريق البصر كما صفار والأنسجة الجنينية داخل البويضة تبدأ في التكتل بشكل غير متساو، وفي نهاية المطاف معظم صفار سوف تهاجر إلى جانب واحد من البيضة.عند تقييم بعد أربعة إلى ستة أيام، نجا أكثر من 85٪ من البيض غير المُصنَّع، في حين أن البيض المحقون بالكاشيف التجريبية كان معدل بقائه أقل بشكل عام. مطلوب السيطرة على جميع جوانب الحقن نفسه، بما في ذلك ثقب إبرة، وإدخال الصبغة والعزلة، أو وجود مركبة أو مزدوجة تقطعت بهم السبل RNA، من أجل فهم الآثار الحقيقية للتلاعب التجريبية حاول. الطريقة التي يقيم المرء نتائج phenotypic من الحقن يعتمد على ما تم حقنه.على سبيل المثال، قد تكون التغيرات الظاهرية نتيجة لضربات الميرنا المحددة واضحة على مستوى التشريح الإجمالي. من ناحية أخرى إذا تم إدراج cDNA ترميز EGFP الموسومة الجين histone 2B تحت سيطرة المروج أكتين G.bimaculatus في جينوم الكريكيت باستخدام transposase الظهر، يصبح من الممكن تصور كل نواة في البيض باستخدام الفلوريسنس لإثارة EGFP الموسومة hist 2B البروتين. ضبط التوازن بحيث لا تسد الإبر هو خطوة حاسمة في هذا الإجراء.قد تحتاج إلى إجراء عدة تعديلات بعد الحقن اللاحقة منذ صفار أحيانا تسد طرف إبرة. الكريكيت هو حشرة hemimetabolous التي فروع basally إلى الحشرات الهولوميتabolous درس جيدا مثل Drosophila. إن دراسة تطوير لعبة الكريكيت ستساعدنا على فهم المزيد عن التطور والتطور في جميع أنحاء المملكة الحيوانية.هذه التقنية تأخذ بعض الممارسة. نوصي بممارسة الحقن التحكم حتى معدل البقاء على قيد الحياة أربعة أو خمسة أيام بعد الحقن هو على الأقل 80٪

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

التي تعتمد على ملوحة سمية الفحص من الفضة Nanocolloids عن طريق الميداكا البيض

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

In Ovo Feeding of Commercial Broiler Eggs: An Accurate and Reproducible Method to Affect Muscle Development and Growth

In Ovo Feeding of Commercial Broiler Eggs: An Accurate and Reproducible Method to Affect Muscle Development and Growth

في أوفو تغذية بيض اللاحم التجاري: طريقة دقيقة وقابلة للتكرار للتأثير على نمو العضلات ونموها

Within the past three decades, red meat and poultry scientists focused on developing strategies and technologies to manipulate muscle development during ...

Investigating Development with Optogenetic Signaling Manipulation in Zebrafish

Optogenetic Signaling Activation in Zebrafish Embryos

Manipulating Signaling in Zebrafish Embryos to Decode Cell Fate Decisions (Video) | JoVE

تنشيط الإشارات البصرية الوراثية في أجنة الزرد

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally ...

Enhancing Protein Visualization with Antibody-Mediated Live Imaging

Visualizing Low-Abundance Proteins and Post-Translational Modifications in Living Drosophila Embryos via Fluorescent Antibody Injection

Unveiling the Dynamics of Mechanical and Biochemical Signals in Animal Morphogenesis Research (Video) | JoVE

تصور البروتينات منخفضة الوفرة والتعديلات اللاحقة للترجمة في أجنة ذبابة الفاكهة الحية عن طريق حقن الأجسام المضادة الفلورية

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein ...