Name: injecting gryllus bimaculatus eggs
Uploaded: 2019-08-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Injecting Gryllus bimaculatus Eggs at JoVE.com

Forskning rapporteret i dette projekt blev støttet af en institutionel udvikling Award (idé) fra National Institute of General Medical Sciences af de nationale institutter for sundhed under Grant nummer P20GM10342 til HH3, og af NSF Award nummer IOS-1257217 til Cge.

1. hardware opsætning og klargøring af materialer
Bemærk: Se tabel 1 og tabel over materialer til fremstilling af opløsninger, reagens og udstyrsdetaljer.
<ol><li>Indstil et dissekere mikroskop for at se æg og guide injektions nålen. (Figur 1a viser et dissekterende mikroskop, der er udstyret med fluorescens). Fluorescens evne er fordelagtig, men ikke nødvendig.</li>
	<li>Placer en 3-akset micromanipulato...

<ol>
	<li>Abzhanov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+there+yet?+Tracking+the+development+of+new+model+systems.">Are we there yet? Tracking the development of new model systems.</a> Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).</li><li>Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+August+Krogh+principle:+&#8220;For+many+problems+there+is+an+animal+on+which+it+can+be+most+conveniently+studied.">The August Krogh principle: &#8220;For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied.</a> Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).</li><li>Krogh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Progress+of+Physiology.">The Progress of Physiology.</a> American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).</li><li>Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cricket neurobiology and behavior. , (1989).</li><li>Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , (2017).</li><li>Misof, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenomics+resolves+the+timing+and+pattern+of+insect+evolution.">Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution.</a> Science. 346 (6210), 763-767 (2014).</li><li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+transgenic+cricket+embryos+reveals+cell+movements+consistent+with+a+syncytial+patterning+mechanism.">Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism.</a> Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).</li><li>Shinmyo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac-mediated+somatic+transformation+of+the+two-spotted+cricket,+Gryllus+bimaculatus.">piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Development, growth &amp; differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).</li><li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-transgenic+genome+modifications+in+a+hemimetabolous+insect+using+zinc-finger+and+TAL+effector+nucleases.">Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases.</a> Nature communications. 3, 1017 (2012).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).</li><li>Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+crickets+for+the+study+of+learning+and+memory:+Dopamine+receptor+Dop1+mediates+aversive+but+not+appetitive+reinforcement+in+crickets.">Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets.</a> Scientific Reports. 5, 15885 (2015).</li><li>Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+in+the+Cricket.">Protocols in the Cricket.</a> The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).</li><li>Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Editing+in+the+Cricket,+Gryllus+bimaculatus.">Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).</li><li>Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch/Delta+signalling+is+not+required+for+segment+generation+in+the+basally+branching+insect+Gryllus+bimaculatus.">Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus.</a> Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).</li><li>Miyawaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Wingless/Armadillo+signaling+in+the+posterior+sequential+segmentation+in+the+cricket,+Gryllus+bimaculatus+(Orthoptera),+as+revealed+by+RNAi+analysis.">Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis.</a> Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).</li><li>Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+live-imaging+of+embryos+in+microwell+arrays+using+a+modular+specimen+mounting+system.">High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system.</a> Biology Open. 7 (7), bio031260 (2018).</li><li>Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+is+required+for+the+generation+of+primordial+germ+cells+in+an+insect.">BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect.</a> Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).</li><li>Larson, E., Andres, J., Harrison, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+male+ejaculate+on+post-mating+prezygotic+barriers+in+field+crickets.">Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets.</a> PLOS ONE. 7 (10), e46202 (2012).</li><li>Donoughe, S., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+development+of+the+cricket+Gryllus+bimaculatus.">Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus.</a> Developmental Biology. , (2016).</li><li>Matsuoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+germ+insects+utilize+both+the+ancestral+and+derived+mode+of+Polycomb+group-mediated+epigenetic+silencing+of+Hox+genes.">Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes.</a> Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).</li><li>Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heads+and+tails:+Evolution+of+antero-posterior+patterning+in+insects.">Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects.</a> Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).</li><li>Bacon, J., Strausfeld, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonrandom+resolution+of+neuron+arrangements.">Nonrandom resolution of neuron arrangements.</a> Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).</li></ol>

De to vigtigste udfordringer med denne teknik er de relaterede spørgsmål af optimal nål størrelse og overlevelsesevne. Selv om mindre nåle forbedre overlevelsesevne, nåle med smallere lumen har en større grad af kapillar kræfter på arbejdspladsen, hvilket gør det mere sandsynligt, at æggeblomme vil bevæge sig ind i nålen forårsager det at tilstoppe. I bedste fald kan blokeringer ryddes ved blot at injicere et andet æg eller ved at rydde nålen som beskrevet ovenfor. Man kan også forsøge at øge balancen ...

Evnen til at ændre genomet eller påvirke genekspression i organismer er grundlaget for udformningen af mange typer eksperimenter, der tester funktionel kausalitet. Det er også afgørende for det komparative og evolutionært relevante arbejde, at genomiske og ikke-genomiske modifikations teknikker er tilgængelige i organismer uden for traditionelle genetiske laboratoriesystemer for dyremodeller (f. eks. mus musculus, Danio rerio, Drosophila melanogasterog Caenorhabditis elegans). Uanset om det er ønsket om at forstå organisme mangfoldighed1 eller ens tilslutning til Kroghs princip, at der for hvert biologisk spørgsmål er en organisme bedst egnet til sin løsning2,3, evnentil at ændre genomer eller indflydelse genekspression er afgørende for moderne eksperimentelle designs.
Cricket Gryllus bimaculatus er et spirende model system. Anvendes til det sidste århundrede i Neuro eksperimenter4, de sidste to årtier har været vidne til en øget eksperimentel interesse i cricket, især fokuseret på udviklingen og udviklingen af denne organisme5. Cricket er et hemimetabolous insekt, der grene basale til godt studeret holometabolous insekter, såsom D. melanogaster og tribolium castaneum6. På grund af sin nyttige position på det evolutionære træ, videnskabsfolk er interesseret i at spørge moderne, sofistikerede eksperimentelle spørgsmål i dette insekt, som har ført til en stigende interesse i at tilpasse molekylære værktøjer til brug i G. bimaculatus.
Injektioner af molekylære reagenser i cricket æg kan anvendes til genommodificering eksperimenter samt ikke-genomisk manipulationer af genekspression i embryoner. For eksempel, transgene G. bimaculatus transporterer egfp indsættelser er blevet oprettet ved hjælp af transposase piggybac7,8. Efterforskerne har med succes skabt knockout G. bimaculatus ved hjælp af zink finger-nukleaser (zfns) og transkriptionsaktivator-lignende (tal) Effector Nucleaser (talens) for at indføre dobbelt strandede pauser i specifikke genomområder9. Selvom ZFNs og TALENs tillader websteds specifik målretning i dyr ud over de fire store modelsystemer, er disse reagenser hurtigt blevet overgået af CRISPR/Cas9-systemet, som er enklere at bruge, mere effektivt og yderst fleksibelt10. Crispr har været anvendt i G. bimaculatus til at producere knock-out11 samt Knock-in linjer12,13 foruden genomisk modifikation kan dsRNA injiceres i æg for at vælte mRNA-ekspression i udviklings embryoer, så efterforskerne kan forstå rollen for specifikke udskrifter gennem udvikling14,15. Nogle begrænsede detaljer om, hvordan man injicere cricket æg er blevet offentliggjort tidligere12.
Her beskriver vi en detaljeret protokol til indsprøjtning af tidlige G. bimaculatus -æg. Denne protokol er effektiv og let at tilpasse til forskellige laboratorie indstillinger, injektion materialer, og eventuelt til andre insekter. Mens yderligere detaljer for at designe og gennemføre genomændringer og Knockdown eksperimenter er blevet offentliggjort andetsteds12,13, vil disse tilgange i sidste ende afhænge af injektion protokol detaljeret her.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluorescent dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165 FC</td>
			<td>Stereomicroscope with fluorescence</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External light source for fluorescence</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EL 6000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-300</td>
			<td>-Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry filter cube</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M205FA/M165FC</td>
			<td>Filter cube for mCherry or similar red dye will work</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>M3301R</td>
			<td>Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MMO-202ND</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Holder (Needle holder)</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>HD-21</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Tubing to connect air source to microinjector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg well stamp</td>
			<td>3D printed</td>
			<td>custom</td>
			<td>3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator or temperature controlled room</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>Temperatures of 23.5-26&#176;C are needed.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cricket food</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>cat food or fish flakes are appropriate food.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cricket wter</td>
			<td>vairous</td>
			<td></td>
			<td>Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cricket shelter</td>
			<td>arious</td>
			<td></td>
			<td>Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary tubes</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>Item no. 1B100F-4</td>
			<td>Kwik-Fil&#8482; Borosilicate Glass Capillaries, 100mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Flaming/Brown</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td>Distributed by Sutter Instrument Co.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beveller/Micro grinder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>Model EG-45/EG-400</td>
			<td>EG-400 includes a microscope head</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>Product code 229693</td>
			<td>90mm diameter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Play Sand</td>
			<td>Sandtastik Products Ltd.</td>
			<td>B003U6QLVS</td>
			<td>White play sand</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB000972</td>
			<td>Agarose GPG/LE ultrapure</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers</td>
			<td>US Kitchen Supply</td>
			<td>Model SS-C123</td>
			<td>Pore size should be between 0.5 - 1.0 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>Ref 15070-063</td>
			<td>Pen Strep</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tweezers</td>
			<td>Sipel Electronic SA</td>
			<td>P3C-STD</td>
			<td>Black Static Dissipative, 118mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filters, 25mm diameter, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>725-2545</td>
			<td>Use with 1 ml syringe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309602</td>
			<td>Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air tank (optional)</td>
			<td>Midwest Products</td>
			<td>Air Works&#174;</td>
			<td>Portable air tank</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Rhodamine dye</td>
			<td rowspan="2">Thermofisher</td>
			<td rowspan="2">D-1817</td>
			<td rowspan="2">dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL loading tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Order no. 5242 956.003</td>
			<td>epT.I.P.S. 20uL Microloader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axioskope 2 plus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X objective</td>
			<td>Ziess</td>
			<td>Plan-Apochromat 20x/0.75 M27</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMC 5400</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite&#160; software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LAS</td>
			<td>Version 4.6.2 used here</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injecting gryllus bimaculatus eggs

Ændring af genfunktion i en udvikler organisme er afgørende for forskellige former for eksperimenter. Mens uhyre kraftfulde genetiske værktøjer er blevet udviklet i traditionelle modelsystemer, er det vanskeligt at manipulere gener eller Messenger RNA (mRNA) i de fleste andre organismer. Samtidig er evolutionære og komparative tilgange afhængige af en udforskning af genfunktion i mange forskellige arter, hvilket nødvendiggør udvikling og tilpasning af teknikker til manipulation af udtryk uden for nuværende genetisk Tractable Arter. Denne protokol beskriver en metode til injektion af reagenser i cricket æg til analyse af virkningerne af en given manipulation på embryonale eller larve udvikling. Instruktioner til, hvordan man samler og injicerer æg med affasede nåle, er beskrevet. Denne relativt ligetil teknik er fleksibel og potentielt tilpasningsdygtig til andre insekter. Man kan samle og injicere snesevis af æg i et enkelt eksperiment, og overlevelsesrater for buffer-only injektioner forbedres med praksis og kan være så højt som 80%. Denne teknik vil understøtte flere typer af eksperimentelle tilgange, herunder injektion af farmakologiske midler, in vitro-udjævnet mRNA at udtrykke gener af interesse, dobbelt-strandede RNA (dsRNA) for at opnå RNA-interferens, brug af grupperet regelmæssigt hinanden korte palindromiske gentagelser (crispr) i koncert med crispr-associerede protein 9 (Cas9) reagenser til genomisk modifikation, og overføres elementer til at generere forbigående eller stabile transgene linjer.

Fårekyllinger let lægge æg i det fugtige materiale, og giver passende materiale, såsom fugtigt sand eller snavs, inducerer dem til at lægge et stort antal æg. Dette er især effektivt, hvis fårekyllinger først berøves æglægnings materiale i 8 – 10 timer. æg, der er lagt i rent sand, kan let adskilles, opsamles (figur 1b) og anbringes i specialdesignede ægbrønde til injektion (figur 1c). En dissekere mikroskop, en ...

Watch this Scientific Journal Video about Injecting Gryllus bimaculatus Eggs at JoVE.com

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Injektion af Gryllus-bimaculatus -æg

Her præsenterer vi en protokol til at injicere cricket æg, en teknik, der tjener som en fundamentale metode i mange eksperimenter i cricket, herunder, men ikke begrænset til, RNA-interferens og genommanipulation.

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been ...

Denne teknik tjener som en grundlæggende metode til eksperimenter designet til at analysere embryonale eller larve udvikling af cricket. Den største fordel ved denne teknik er, at den er fleksibel og vil understøtte flere typer af eksperimentelle tilgange, såsom dem, der anvender RNA-interferens eller genomisk manipulation. Demonstration af proceduren vil være Hadley Wilson Horch, den vigtigste investigator i laboratoriet.For at starte denne procedure våd spinding kværn plan af beveler med dryppende vand. Placer den trak nål ind i facetret og drej den til en 20 graders vinkel. Sænk nålen, indtil den bare rører slibepladen og facet det i to til tre minutter.Vurdere facet ved at placere den skrå nål på dobbelt stick tape, der er blevet holdt til et glas mikroskop dias. Placer dias på scenen af et sammensat mikroskop udstyret med et kamera og billede erhvervelse software. Få et billede af nålen ved hjælp af en 20x mål.Brug billedbehandlingssoftwaren til at måle nålens indvendige lumendiameter lige proksimale til den skrå åbning. Kassér eventuelle nåle med en åbning, der er mindre end otte mikrometer eller større end 12 mikrometer. Først skal du lave 40 milliliter 1% agarose i vand og hæld det i en 10 centimeter petriskål.Placer et æg godt stempel på overfladen af agarose, før det størkner. Når agarose er størknet, skal du fjerne stemplet for at afsløre brøndene. Dernæst fylde agarose godt plade med HBS indeholder 1% penicillin streptomycin.Placer låget på fadet, pak det ind i Parafilm og opbevar det ved fire grader Celsius. Efter dette, fylde en 35 millimeter petriskål med hvid legeplads sand til at lave et æg indsamling parabol for fårekyllinger at lægge æg i. Dæk ægget fad med en køkkenrulle firkantet skåret til ca 18 af 18 centimeter.Fyld med vand fra hanen gennem køkkenrulle. Derefter vippe petriskålen og forsigtigt presse toppen for at fjerne overskydende vand. Tuck hjørnerne af køkkenrulle pladsen under fadet og læg ægget parabol i en omvendt låg, som vil hjælpe med at holde køkkenrulle på plads.Placer ægget parabol i cricket bin og lad de voksne hunner til oviposit æggene i en til to timer. I mellemtiden, lad agarose skålen til at varme til stuetemperatur som forberedelse til at holde æggene til injektion. Når du er klar, skal du fjerne ægsamlingsskålen, der nu indeholder frisk lagdene æg, fra cricketspanden.Fjern køkkenrulle og placere en si med en pore størrelse mellem 0,5 og en millimeter over et bægerglas. Skyl indholdet af ægget æglæggende fad i semørke under forsigtigt rindende vand fra hanen. Sandet korn vil falde gennem si mesh i bægeret nedenfor, mens cricket æg forbliver i si kurv.Fyld en beholder med omvendt osmose vand og læg den i en bakke. Inverter syren over beholderen og bank den mod skålen for at løsne æggene i vandet. Æggene vil synke til bunden af beholderen.Dernæst skal du bruge en saks til at skære spidsen af en P1000 pipette spids til at gøre en åbning cirka tre millimeter i diameter. Placer denne spids på en P1000 pipetter, og bruge den til at overføre æg fra beholderen til agarose æg forme fad. Brug plast pincet, line up æggene i agarose brønde.Hvert æg vil synke til bunden af en individuel brønd. Dæk petriskålen med et låg, indtil den er klar til injektion. Til at begynde, placere skålen af æg under dissekere mikroskop og vælge en lav forstørrelse på omkring 10x.Der trækkes 1,5 mikroliter injektionsopløsning ved hjælp af 20 mikroliters læssespidser og en P10-pipette, og indføringsspidsen indsættes i den brede ende af injektionsnålen. Udvis injektionsopløsningen i injektionsnålen. Sæt nålen ind i injektionshuset, og stram, og sørg for, at nålen er korrekt og solidt indsat i huset.Sæt derefter injektionshuset i mikromanipulatoren, og pas på ikke at gå i stykker eller komme til skade ved nålen. Mens du ser på både æg og nål gennem mikroskopet, skal du flytte nålen nær X i øverste venstre hjørne af skålgitteret. Sænk nålen, indtil spidsen kommer ind i HBS plus penicillin streptomycin buffered opløsning i skålen.Centrer nålen i synsfeltet og flyt æggeskålen, så nålen er et par millimeter tættere på kanten af skålen end æggene. Derefter indstilles mikroskopet til det filter, der passer til Rhodamin, for at observere fluorescensen i nålen og fokusere på spidsen. Drej langsomt balanceknappen med uret på mikroinjektoren, indtil injektionsopløsningen begynder at sive ud af nålen i affjedringsopløsningen.Drej derefter knappen lidt mod uret, indtil farvestoffet bare holder op med at sive ud af nålen. Med nålen stadig centreret i synsfeltet, flytte ægget parabol, så nålen er rettet mod ægget, der skal injiceres først. Juster forstørrelsen til ca. 50x, så et enkelt æg fylder det meste af synsfeltet.Brug både mikromanipulatoren og ens hånd på æggeskålen til at flytte nålen på plads til injektionen. Brug mikromanipulatoren til at fremryde nålen og sæt spidsen ind i det første æg, der skal injiceres, og sørg for at indsætte nålen ved 20 til 30% af æggets længde fra æggets bageste ende vinkelret på æggets lange akse. Injicer opløsningen med enten injektionsfodpedalen eller injektionsknappen på mikroinjektoren.En lille bolus af fluorescerende materiale inde i ægget vil indikere en vellykket injektion. Derefter trækkes nålen tilbage fra ægget. Hvis ægget utilsigtet løftes ud af sin brønd ved tilbagetrækning af nålen, skal du bruge små kraftbepind til at skubbe ægget tilbage i brønden, mens nålen trækkes tilbage.I denne undersøgelse injiceres cricketæg ved hjælp af en teknik, der fungerer som en grundlæggende metode i mange eksperimenter, herunder, men ikke begrænset til, RNA-interferens og genomisk manipulation. Overlevelsesraten er et vigtigt parameter til vurdering af dette eksperiments succes. De fleste døde æg kan nemt identificeres ved synet som æggeblomme og embryonale væv i ægget begynder at klumpe ujævnt, og i sidste ende det meste af æggeblomme vil migrere til den ene side af ægget.Når det vurderes efter fire til seks dage, overlevede mere end 85 % af de ikke-injerede æg, mens æg, der blev injiceret med forsøgsreagenser, generelt havde en lavere overlevelsesrate. Kontrol for alle aspekter af selve injektionen, herunder nålen punktering, indførelse af farvestof og buffer, eller tilstedeværelsen af køretøj eller dobbelt strandede RNA, er nødvendig for at forstå de sande virkninger af den eksperimentelle manipulation forsøgt. Den måde, man vurderer fænotopyp resultaterne af injektion afhænger af, hvad der blev injiceret.For eksempel kan fænoypiske ændringer som følge af specifikke mRNA knockdowns være indlysende på bruttoanatominiveau. Hvis på den anden side en cDNA kodning en EGFP mærkede histone 2B gen under kontrol af en G.bimaculatus actin promotor er indsat i cricket genom ved hjælp piggyback transposase, bliver det muligt at visualisere hver kerne i ægget ved hjælp af fluorescens at ophidse EGFP mærkede hist 2B protein. Justering af balancen, så nålene ikke tilstopper er et kritisk skridt i denne procedure.Det kan være nødvendigt at foretage flere justeringer efter efterfølgende injektioner, da æggeblomme nogle gange træsko nålen spidsen. Cricket er en hemimetabolous insekt, der grene basalt til godt studeret holometabolous insekter såsom Drosophila. Studere cricket udvikling vil hjælpe os med at forstå mere om udvikling og udvikling i hele dyreriget.Denne teknik tager nogle praksis. Vi anbefaler, at du praktiserer kontrolinjektint, indtil overlevelsesraten fire eller fem dage efter injektionen er mindst 80 %

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Saltholdighed-afhængige Toksicitet Analyse af Silver Nanocolloids Brug Medaka Æg

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

In Ovo Feeding of Commercial Broiler Eggs: An Accurate and Reproducible Method to Affect Muscle Development and Growth

In Ovo Feeding of Commercial Broiler Eggs: An Accurate and Reproducible Method to Affect Muscle Development and Growth

I Ovo Fodring af kommercielle slagtekyllinger: En nøjagtig og reproducerbar metode til at påvirke muskeludvikling og vækst

Within the past three decades, red meat and poultry scientists focused on developing strategies and technologies to manipulate muscle development during ...

Investigating Development with Optogenetic Signaling Manipulation in Zebrafish

Optogenetic Signaling Activation in Zebrafish Embryos

Manipulating Signaling in Zebrafish Embryos to Decode Cell Fate Decisions (Video) | JoVE

Optogenetisk signalaktivering i zebrafiskembryoner

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally ...

Enhancing Protein Visualization with Antibody-Mediated Live Imaging

Visualizing Low-Abundance Proteins and Post-Translational Modifications in Living Drosophila Embryos via Fluorescent Antibody Injection

Unveiling the Dynamics of Mechanical and Biochemical Signals in Animal Morphogenesis Research (Video) | JoVE

Visualisering af proteiner med lav overflod og posttranslationelle modifikationer i levende Drosophila-embryoner via fluorescerende antistofinjektion

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein ...