Name: injecting gryllus bimaculatus eggs
Uploaded: 2019-08-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Injecting Gryllus bimaculatus Eggs at JoVE.com

Het onderzoek dat in dit project werd gerapporteerd, werd gesteund door een institutionele ontwikkelings prijs (IDeA) van het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder Grant Number P20GM10342 to HH3, en door NSF Award nummer IOS-1257217 aan Cge.

1. hardware instellen en voorbereiden van materialen
Opmerking: Zie tabel 1 en tabel met materialen voor de bereiding van oplossingen, reagens en apparatuurgegevens.
<ol><li>Stel een ontleed Microscoop in om eieren te zien en de injectienaald te geleideren. (Figuur 1a toont een ontleed Microscoop uitgerust met fluorescentie.) Fluorescentie vermogen is voordelig maar niet noodzakelijk.</li>
	<li>Plaats een 3-assi...

<ol>
	<li>Abzhanov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+there+yet?+Tracking+the+development+of+new+model+systems.">Are we there yet? Tracking the development of new model systems.</a> Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).</li><li>Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+August+Krogh+principle:+&#8220;For+many+problems+there+is+an+animal+on+which+it+can+be+most+conveniently+studied.">The August Krogh principle: &#8220;For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied.</a> Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).</li><li>Krogh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Progress+of+Physiology.">The Progress of Physiology.</a> American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).</li><li>Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cricket neurobiology and behavior. , (1989).</li><li>Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , (2017).</li><li>Misof, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenomics+resolves+the+timing+and+pattern+of+insect+evolution.">Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution.</a> Science. 346 (6210), 763-767 (2014).</li><li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+transgenic+cricket+embryos+reveals+cell+movements+consistent+with+a+syncytial+patterning+mechanism.">Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism.</a> Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).</li><li>Shinmyo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac-mediated+somatic+transformation+of+the+two-spotted+cricket,+Gryllus+bimaculatus.">piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Development, growth &amp; differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).</li><li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-transgenic+genome+modifications+in+a+hemimetabolous+insect+using+zinc-finger+and+TAL+effector+nucleases.">Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases.</a> Nature communications. 3, 1017 (2012).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).</li><li>Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+crickets+for+the+study+of+learning+and+memory:+Dopamine+receptor+Dop1+mediates+aversive+but+not+appetitive+reinforcement+in+crickets.">Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets.</a> Scientific Reports. 5, 15885 (2015).</li><li>Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+in+the+Cricket.">Protocols in the Cricket.</a> The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).</li><li>Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Editing+in+the+Cricket,+Gryllus+bimaculatus.">Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).</li><li>Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch/Delta+signalling+is+not+required+for+segment+generation+in+the+basally+branching+insect+Gryllus+bimaculatus.">Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus.</a> Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).</li><li>Miyawaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Wingless/Armadillo+signaling+in+the+posterior+sequential+segmentation+in+the+cricket,+Gryllus+bimaculatus+(Orthoptera),+as+revealed+by+RNAi+analysis.">Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis.</a> Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).</li><li>Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+live-imaging+of+embryos+in+microwell+arrays+using+a+modular+specimen+mounting+system.">High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system.</a> Biology Open. 7 (7), bio031260 (2018).</li><li>Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+is+required+for+the+generation+of+primordial+germ+cells+in+an+insect.">BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect.</a> Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).</li><li>Larson, E., Andres, J., Harrison, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+male+ejaculate+on+post-mating+prezygotic+barriers+in+field+crickets.">Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets.</a> PLOS ONE. 7 (10), e46202 (2012).</li><li>Donoughe, S., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+development+of+the+cricket+Gryllus+bimaculatus.">Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus.</a> Developmental Biology. , (2016).</li><li>Matsuoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+germ+insects+utilize+both+the+ancestral+and+derived+mode+of+Polycomb+group-mediated+epigenetic+silencing+of+Hox+genes.">Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes.</a> Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).</li><li>Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heads+and+tails:+Evolution+of+antero-posterior+patterning+in+insects.">Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects.</a> Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).</li><li>Bacon, J., Strausfeld, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonrandom+resolution+of+neuron+arrangements.">Nonrandom resolution of neuron arrangements.</a> Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).</li></ol>

De twee belangrijkste uitdagingen met deze techniek zijn de gerelateerde kwesties van optimale naald grootte en overlevingskansen. Hoewel kleinere naalden overlevingskansen verbeteren, hebben naalden met smallere lumen een grotere mate van capillaire krachten op het werk, wat het waarschijnlijker maakt dat dooier in de naald zal bewegen waardoor het verstopt is. In het beste geval kunnen blokkades eenvoudig worden gewist door een ander ei te injecteren of door de naald te verwijderen zoals hierboven beschreven. Men kan o...

Het vermogen om het genoom te wijzigen of de genexpressie in organismen te beïnvloeden is de basis voor het ontwerp van vele soorten experimenten die functionele causaliteit testen. Het is ook van cruciaal belang voor het vergelijkende en evolutionair relevante werk dat genomische en niet-genomische wijzigings technieken beschikbaar zijn in organismen buiten traditionele genetische laboratorium systemen voor diermodellen (bijv. Mus musculus, Danio rerio, Drosophila melanogasteren Caenorhabditis elegans). Of het nu gaat om het verlangen om de organisatorische diversiteit1 of iemands naleving van het principe van Krogh te begrijpen, dat er voor elke biologische vraag een organisme is dat het meest geschikt is voor zijn oplossing2,3, de mogelijkheid om genomen te wijzigen of invloed van de genexpressie is essentieel voor moderne experimentele ontwerpen.
De cricket gryllus krekel is een opkomend modelsysteem. Gebruikt voor de vorige eeuw in neuroethologie experimenten4, de laatste twee decennia zijn getuige geweest van een toegenomen experimentele interesse in de cricket, met name gericht op de evolutie en ontwikkeling van dit organisme5. De Cricket is een hemimetabolous insect dat basaal vertakt tot goed bestudeerde holometaboleuze insecten, zoals D. melanogaster en Tribolium castaneum6. Door zijn nuttige positie op de evolutionaire boom, zijn wetenschappers geïnteresseerd in het vragen van moderne, verfijnde experimentele vragen in dit insect, dat heeft geleid tot een groeiende interesse in het aanpassen van moleculaire gereedschappen voor het gebruik in G. krekel.
Injecties van moleculaire reagentia in Cricket eieren kunnen worden gebruikt voor genomische modificatie-experimenten en niet-genomische manipulaties van genexpressie in embryo's. Transgene G. krekel met EGFP-inserties is bijvoorbeeld gemaakt met behulp van de transposase piggybac7,8. Onderzoekers hebben met succes Knockout G. krekel gemaakt met behulp van zink-vinger nucleasen (zfns) en transcriptie Activator-achtige (tal) Effector nucleasen (Talens) om dubbel-gestrande pauzes in specifieke genomische regio's te introduceren9. Hoewel ZFNs en TALENs locatiespecifieke targeting mogelijk maken bij dieren buiten de grote vier modelsystemen, zijn deze reagentia snel overtroffen door het CRISPR/Cas9-systeem, dat eenvoudiger te gebruiken, efficiënter en zeer flexibel is10. Crispr is gebruikt in G. krekel voor de productie van Knock-out 11 evenals knock-in lijnen12,13 naast de genomische modificatie, kan dsRNA in eieren worden geïnjecteerd om mRNA-expressie op te nemen in het ontwikkelen embryo's, waardoor onderzoekers de rol van specifieke transcripten in de ontwikkeling14,15kunnen begrijpen. Enkele beperkte Details over het injecteren van Cricket eieren zijn eerder gepubliceerd12.
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het injecteren van vroege G. krekel -eieren. Dit protocol is effectief en gemakkelijk aanpasbaar aan verschillende laboratorium instellingen, injectiematerialen en mogelijk aan andere insecten. Hoewel aanvullende Details voor het ontwerpen en implementeren van genomische modificatie en knockdown-experimenten elders zijn gepubliceerd12,13, zullen deze benaderingen uiteindelijk afhankelijk zijn van het injectie protocol dat hier wordt beschreven.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluorescent dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165 FC</td>
			<td>Stereomicroscope with fluorescence</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External light source for fluorescence</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EL 6000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-300</td>
			<td>-Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry filter cube</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M205FA/M165FC</td>
			<td>Filter cube for mCherry or similar red dye will work</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>M3301R</td>
			<td>Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MMO-202ND</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Holder (Needle holder)</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>HD-21</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Tubing to connect air source to microinjector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg well stamp</td>
			<td>3D printed</td>
			<td>custom</td>
			<td>3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator or temperature controlled room</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>Temperatures of 23.5-26&#176;C are needed.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cricket food</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>cat food or fish flakes are appropriate food.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cricket wter</td>
			<td>vairous</td>
			<td></td>
			<td>Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cricket shelter</td>
			<td>arious</td>
			<td></td>
			<td>Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary tubes</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>Item no. 1B100F-4</td>
			<td>Kwik-Fil&#8482; Borosilicate Glass Capillaries, 100mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Flaming/Brown</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td>Distributed by Sutter Instrument Co.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beveller/Micro grinder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>Model EG-45/EG-400</td>
			<td>EG-400 includes a microscope head</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>Product code 229693</td>
			<td>90mm diameter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Play Sand</td>
			<td>Sandtastik Products Ltd.</td>
			<td>B003U6QLVS</td>
			<td>White play sand</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB000972</td>
			<td>Agarose GPG/LE ultrapure</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers</td>
			<td>US Kitchen Supply</td>
			<td>Model SS-C123</td>
			<td>Pore size should be between 0.5 - 1.0 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>Ref 15070-063</td>
			<td>Pen Strep</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tweezers</td>
			<td>Sipel Electronic SA</td>
			<td>P3C-STD</td>
			<td>Black Static Dissipative, 118mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filters, 25mm diameter, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>725-2545</td>
			<td>Use with 1 ml syringe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309602</td>
			<td>Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air tank (optional)</td>
			<td>Midwest Products</td>
			<td>Air Works&#174;</td>
			<td>Portable air tank</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Rhodamine dye</td>
			<td rowspan="2">Thermofisher</td>
			<td rowspan="2">D-1817</td>
			<td rowspan="2">dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL loading tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Order no. 5242 956.003</td>
			<td>epT.I.P.S. 20uL Microloader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axioskope 2 plus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X objective</td>
			<td>Ziess</td>
			<td>Plan-Apochromat 20x/0.75 M27</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMC 5400</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite&#160; software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LAS</td>
			<td>Version 4.6.2 used here</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injecting gryllus bimaculatus eggs

Het veranderen van de genfunctie in een zich ontwikkelende organisme staat centraal in verschillende soorten experimenten. Terwijl enorm krachtige genetische hulpmiddelen zijn ontwikkeld in traditionele modelsystemen, is het moeilijk om genen of boodschapper RNA (mRNA) in de meeste andere organismen te manipuleren. Tegelijkertijd zijn evolutionaire en vergelijkende benaderingen gebaseerd op een verkenning van de genfunctie in veel verschillende soorten, waardoor de ontwikkeling en aanpassing van technieken voor het manipuleren van expressie buiten de huidige genetisch Tractable Soort(en). Dit protocol beschrijft een methode voor het injecteren van reagentia in Cricket-eieren om de effecten van een bepaalde manipulatie op embryonale of larvale ontwikkeling te testen. Instructies voor het verzamelen en injecteren van eieren met afgeschuurd naalden worden beschreven. Deze relatief ongecompliceerde techniek is flexibel en mogelijk aanpasbaar aan andere insecten. Men kan verzamelen en injecteren van tientallen eieren in een enkel experiment, en de overlevingskansen voor buffer-only injecties verbeteren met de praktijk en kan zo hoog zijn als 80%. Deze techniek zal verschillende soorten experimentele benaderingen ondersteunen, waaronder injectie van farmacologische agentia, in vitro afgetopte mRNA om genen van belang te uiten, dubbel-streng RNA (dsRNA) om RNA-interferentie te bereiken, het gebruik van geclusterd regelmatig intergespreide korte palindroom herhalingen (CRISPR) in overleg met CRISPR-geassocieerde proteïne 9 (Cas9) reagentia voor genomische modificatie, en transposeer bare elementen om voorbijgaande of stabiele transgene lijnen te genereren.

Krekels leggen gemakkelijk eieren in het vochtige materiaal en zorgen voor voldoende materiaal, zoals vochtig zand of vuil, om een groot aantal eieren te leggen. Dit is vooral effectief als krekels voor het eerst worden beroofd van eierlegmateriaal voor 8 – 10 h. eieren die in schoon zand worden gelegd, kunnen gemakkelijk worden gescheiden, opgevangen (Figuur 1b) en in op maat ontworpen Eier putten voor injectie worden geplaatst (figuur...

Watch this Scientific Journal Video about Injecting Gryllus bimaculatus Eggs at JoVE.com

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Het injecteren van gryllus krekel eieren

Hier presenteren we een protocol om Cricket eieren te injecteren, een techniek die als basismethode dient in vele experimenten in de cricket, inclusief, maar niet beperkt tot, RNA-interferentie en genomische manipulatie.

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been ...

Deze techniek dient als een fundamentele methode voor experimenten ontworpen om de embryonale of larve ontwikkeling van de krekel te testen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het flexibel is en verschillende soorten experimentele benaderingen zal ondersteunen, zoals die met behulp van RNA-interferentie of genomische manipulatie. Het aantonen van de procedure zal Hadley Wilson Horch zijn, de hoofdonderzoeker in het laboratorium.Om te beginnen deze procedure nat de draaiende molen vlak van de schuine kant met druipend water. Plaats de getrokken naald in de schuine kant en draai deze in een hoek van 20 graden. Laat de naald zakken tot hij de slijpplaat aanraakt en twee tot drie minuten afschuift.Beoordeel de schuine kant door het plaatsen van de schuine naald op dubbele plak tape die is gehecht aan een glazen microscoop dia. Plaats de dia op het podium van een samengestelde microscoop uitgerust met een camera en beeldacquisitiesoftware. Verkrijg een afbeelding van de naald met behulp van een 20x doelstelling.Gebruik de beeldsoftware om de binnendiameter van de naald te meten, net proximaal tot de afgeschuinde opening. Gooi naalden weg met een opening kleiner dan acht micrometer of groter dan 12 micrometer. Maak eerst 40 milliliter van 1% agarose in water en giet het in een petrischaal van 10 centimeter.Plaats een ei goed stempel op het oppervlak van de agarose voordat het stolt. Zodra de agarose is gestold, verwijder de stempel om de putten te onthullen. Vul vervolgens de agarose goed plaat met HBS met 1%penicilline streptomycine.Leg het deksel op de schaal, wikkel het in Parafilm en bewaar het op vier graden Celsius. Vul hierna een petrischaaltje van 35 millimeter met wit speelterreinzand om een eierinzamelschaal te maken voor de krekels om er eieren in te leggen. Bedek de eierschaal met een papieren handdoek vierkant gesneden tot ongeveer 18 bij 18 centimeter.Vul met kraanwater door de papieren handdoek. Dan, kantel de petrischaal en knijp voorzichtig de top om overtollig water te verwijderen. Stop de hoeken van de papieren handdoek vierkant onder de schotel en plaats het ei schotel in een omgekeerde deksel die zal helpen houden de papieren handdoek op zijn plaats.Plaats het eischotel in de krekelbak en laat de volwassen vrouwtjes de eieren een tot twee uur oviposit. Laat ondertussen de agarose schotel op kamertemperatuur warmen ter voorbereiding op het vasthouden van de eieren voor injectie. Als je klaar bent, haal je de eierschaal, die nu vers gelegde eieren bevat, uit de krekelbak.Verwijder de papieren handdoek en plaats een zeef met een porie grootte tussen 0,5 en een millimeter over een beker. Spoel de inhoud van de eierlegschaal in de zeef onder zacht stromend kraanwater. De zandkorrels zullen door de zeef gaas in het bekerglas hieronder vallen, terwijl de krekeleieren in de zeefmand blijven.Vul een container met omgekeerd osmosewater en leg deze in een lade. Keer de zeef over de container en tik het tegen de schotel om de eieren los te maken in het water. De eieren zinken naar de bodem van de container.Gebruik vervolgens een schaar om de punt van een P1000 pipettip af te snijden om een opening van ongeveer drie millimeter in diameter te maken. Plaats deze tip op een P1000 pipetter, en gebruik het om de eieren van de container naar de agarose eivormgebak. Met behulp van plastic pincet, line-up van de eieren in de agarose putten.Elk ei zal zinken naar de bodem van een individuele put. Bedek de petrischaal met een deksel tot het klaar is om te injecteren. Om te beginnen, plaats de schotel van eieren onder de ontledende microscoop en selecteer een lage vergroting van ongeveer 10x.Maak 1,5 microliter injectieoplossing met 20 microliter laadtips en een P10-pipet en steek de laadpunt in het brede uiteinde van de injectienaald. Verdrijving van de injectieoplossing in de injectienaald. Steek de naald in de injectiebehuizing en draai aan, zodat de naald goed en stevig in de behuizing wordt gestoken.Steek vervolgens voorzichtig de injectiebehuizing in de micromanipulator, voorzichtig om niet te breken of gewond te raken door de naald. Terwijl het bekijken van zowel de eieren als de naald door de microscoop, beweegt u de naald dichtbij X in de hoogste linkerhoek van het schotelrooster. Laat de naald zakken totdat de punt de HBS plus penicilline streptomycine gebufferde oplossing in de schotel binnenkomt.Centreer de naald in het gezichtsveld en beweeg de eierschaal, zodat de naald is een paar millimeter dichter bij de rand van de schotel dan de eieren. Stel hierna de microscoop op het filter dat geschikt is voor Rhodamine om de fluorescentie in de naald te observeren en zich te concentreren op de punt. Draai op de microinjector langzaam de balansknop met de klok mee totdat de injectieoplossing uit de naald in de suspensieoplossing begint te lekken.Draai vervolgens de knop tegen de klok in iets totdat de kleurstof gewoon stopt met lekken uit de naald. Met de naald nog gecentreerd in het gezichtsveld, verplaats de schotel zodat de naald wordt gericht op het ei dat eerst moet worden geïnjecteerd. Pas de vergroting aan op ongeveer 50x, zodat een enkel ei het grootste deel van het gezichtsveld vult.Gebruik zowel de micromanipulator als de hand op de eierschaal om de naald in positie te brengen voor de injectie. Gebruik de micromanipulator om de naald vooruit te helpen en steek de punt in het eerste te injecteren ei, om de naald op 20 tot 30% van de eilengte van het achterste uiteinde van het ei loodrecht op de lange as van het ei te steken. Injecteer de oplossing met het injectievoetpedaal of de injectieknop op de microinjector.Een kleine bolus van fluorescerend materiaal in het ei zal wijzen op een succesvolle injectie. Trek hierna de naald uit het ei. Als het ei onbedoeld bij het intrekken van de naald uit zijn put wordt getild, gebruikt u kleine tangen om het ei terug in de put te duwen terwijl u de naald intrekt.In deze studie worden krekeleieren geïnjecteerd met behulp van een techniek die dient als een fundamentele methode in vele experimenten, waaronder maar niet beperkt tot, RNA interferentie en genomische manipulatie. De overlevingskans is een belangrijke parameter voor het beoordelen van het succes van dit experiment. De meeste dode eieren kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd door het zicht als de dooier en embryonale weefsel in het ei beginnen te klonteren ongelijk, en uiteindelijk het grootste deel van de dooier zal migreren naar een kant van het ei.Wanneer beoordeeld na vier tot zes dagen, meer dan 85% van de niet-geïnjecteerde eieren overleefd, terwijl eieren geïnjecteerd met experimentele reagentia over het algemeen had een lagere overlevingskans. Controle voor alle aspecten van de injectie zelf, met inbegrip van de naaldpunctie, de introductie van kleurstof en buffer, of de aanwezigheid van voertuig of dubbelstrengs RNA, is vereist om de ware effecten van de experimentele manipulatie geprobeerd te begrijpen. De manier waarop men beoordeelt de fenotypische resultaten van de injectie hangt af van wat werd geïnjecteerd.Bijvoorbeeld, fenotypische veranderingen als gevolg van specifieke mRNA knockdowns kan duidelijk zijn op het bruto anatomie niveau. Als aan de andere kant een cDNA codering van een EGFP gelabeld histone 2B gen onder de controle van een G.bimaculatus actin promotor wordt ingevoegd in de cricket genoom met behulp van piggyback transposase, wordt het mogelijk om elke kern in het ei te visualiseren met behulp van fluorescentie om de EGFP tagged hist 2B eiwit te prikkelen. Het aanpassen van de balans zodat de naalden niet verstoppen is een kritieke stap in deze procedure.Het kan nodig zijn om verschillende aanpassingen te maken na de daaropvolgende injecties, omdat dooier soms klompen de naald tip. De krekel is een hemimetabolous insect dat basaal takken tot goed bestudeerde holometabolous insecten zoals Drosophila. Het bestuderen van cricket ontwikkeling zal ons helpen meer te begrijpen over evolutie en ontwikkeling in het dierenrijk.Deze techniek vergt enige oefening. We raden aan controle-injecties te oefenen tot de overlevingskans vier of vijf dagen na de injectie ten minste 80% is

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Zoutgehalte-afhankelijke toxiciteit Test van Silver nanocolloïden gebruik van Medaka Eieren

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

In Ovo Feeding of Commercial Broiler Eggs: An Accurate and Reproducible Method to Affect Muscle Development and Growth

In Ovo Feeding of Commercial Broiler Eggs: An Accurate and Reproducible Method to Affect Muscle Development and Growth

In Ovo Voeding van commerciële vleeskuikeneieren: een nauwkeurige en reproduceerbare methode om spierontwikkeling en -groei te beïnvloeden

Within the past three decades, red meat and poultry scientists focused on developing strategies and technologies to manipulate muscle development during ...

Investigating Development with Optogenetic Signaling Manipulation in Zebrafish

Optogenetic Signaling Activation in Zebrafish Embryos

Manipulating Signaling in Zebrafish Embryos to Decode Cell Fate Decisions (Video) | JoVE

Optogenetische signaleringsactivering in zebravisembryo's

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally ...

Enhancing Protein Visualization with Antibody-Mediated Live Imaging

Visualizing Low-Abundance Proteins and Post-Translational Modifications in Living Drosophila Embryos via Fluorescent Antibody Injection

Unveiling the Dynamics of Mechanical and Biochemical Signals in Animal Morphogenesis Research (Video) | JoVE

Visualisatie van eiwitten met een lage abundantie en posttranslationele modificaties in levende Drosophila-embryo's via fluorescerende antilichaaminjectie

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein ...