Name: injecting gryllus bimaculatus eggs
Uploaded: 2019-08-22T13:00:00
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Les recherches rapportées dans le cadre de ce projet ont été soutenues par un prix de développement institutionnel (IDeA) de l'Institut national des sciences médicales générales des National Institutes of Health sous le numéro de subvention P20GM10342 à HH3, et par le numéro de prix de la NSF IOS-1257217 Cge.

1. Configuration et préparation de matériel
REMARQUE: Veuillez consulter le tableau 1 et le tableau des matériaux pour la préparation des solutions, du réactif et des détails de l'équipement.
<ol><li>Installez un microscope disséquant afin de voir les œufs et de guider l'aiguille d'injection. (La figure 1A montre un microscope disséquant équipé de fluorescence.) La capacité de fluorescence est avant...

<ol>
	<li>Abzhanov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+there+yet?+Tracking+the+development+of+new+model+systems.">Are we there yet? Tracking the development of new model systems.</a> Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).</li><li>Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+August+Krogh+principle:+&#8220;For+many+problems+there+is+an+animal+on+which+it+can+be+most+conveniently+studied.">The August Krogh principle: &#8220;For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied.</a> Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).</li><li>Krogh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Progress+of+Physiology.">The Progress of Physiology.</a> American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).</li><li>Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cricket neurobiology and behavior. , (1989).</li><li>Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , (2017).</li><li>Misof, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenomics+resolves+the+timing+and+pattern+of+insect+evolution.">Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution.</a> Science. 346 (6210), 763-767 (2014).</li><li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+transgenic+cricket+embryos+reveals+cell+movements+consistent+with+a+syncytial+patterning+mechanism.">Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism.</a> Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).</li><li>Shinmyo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac-mediated+somatic+transformation+of+the+two-spotted+cricket,+Gryllus+bimaculatus.">piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Development, growth &amp; differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).</li><li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-transgenic+genome+modifications+in+a+hemimetabolous+insect+using+zinc-finger+and+TAL+effector+nucleases.">Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases.</a> Nature communications. 3, 1017 (2012).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).</li><li>Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+crickets+for+the+study+of+learning+and+memory:+Dopamine+receptor+Dop1+mediates+aversive+but+not+appetitive+reinforcement+in+crickets.">Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets.</a> Scientific Reports. 5, 15885 (2015).</li><li>Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+in+the+Cricket.">Protocols in the Cricket.</a> The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).</li><li>Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Editing+in+the+Cricket,+Gryllus+bimaculatus.">Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).</li><li>Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch/Delta+signalling+is+not+required+for+segment+generation+in+the+basally+branching+insect+Gryllus+bimaculatus.">Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus.</a> Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).</li><li>Miyawaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Wingless/Armadillo+signaling+in+the+posterior+sequential+segmentation+in+the+cricket,+Gryllus+bimaculatus+(Orthoptera),+as+revealed+by+RNAi+analysis.">Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis.</a> Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).</li><li>Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+live-imaging+of+embryos+in+microwell+arrays+using+a+modular+specimen+mounting+system.">High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system.</a> Biology Open. 7 (7), bio031260 (2018).</li><li>Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+is+required+for+the+generation+of+primordial+germ+cells+in+an+insect.">BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect.</a> Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).</li><li>Larson, E., Andres, J., Harrison, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+male+ejaculate+on+post-mating+prezygotic+barriers+in+field+crickets.">Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets.</a> PLOS ONE. 7 (10), e46202 (2012).</li><li>Donoughe, S., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+development+of+the+cricket+Gryllus+bimaculatus.">Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus.</a> Developmental Biology. , (2016).</li><li>Matsuoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+germ+insects+utilize+both+the+ancestral+and+derived+mode+of+Polycomb+group-mediated+epigenetic+silencing+of+Hox+genes.">Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes.</a> Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).</li><li>Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heads+and+tails:+Evolution+of+antero-posterior+patterning+in+insects.">Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects.</a> Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).</li><li>Bacon, J., Strausfeld, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonrandom+resolution+of+neuron+arrangements.">Nonrandom resolution of neuron arrangements.</a> Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).</li></ol>

Les deux principaux défis de cette technique sont les questions connexes de taille optimale des aiguilles et de la survie. Bien que les aiguilles plus petites améliorent la survie, les aiguilles avec des lumens plus étroits ont un plus grand degré de forces capillaires à l'œuvre, ce qui rend plus probable que le jaune se déplacera dans l'aiguille provoquant son obstruement. Dans le meilleur des cas, les blocages peuvent être éliminés simplement en injectant un autre œuf ou en dégageant l'aiguille comme décri...

La capacité de modifier le génome ou d'influencer l'expression des gènes dans les organismes est à la base de la conception de nombreux types d'expériences testant la causalité fonctionnelle. Il est également essentiel pour les travaux comparatifs et évolutionnaires que les techniques de modification génomique et non génomique soient disponibles dans les organismes en dehors des systèmes traditionnels de modèle animal de laboratoire génétique (par exemple, Mus musculus, Danio rerio, Drosophila melanogaster, et Caenorhabditis elegans). Qu'il s'agisse du désir de comprendre la diversité organistique1 ou de l'adhésion au principe de Krogh, que pour chaque question biologique il existe un organisme le mieux adapté à sa solution2,3, la capacité de modifier les génomes ou l'influence de l'expression de gène est essentielle pour des conceptions expérimentales modernes.
Le cricket Gryllus bimaculatus est un système modèle émergent. Utilisé pour le siècle dernier dans les expériences de neuroéthologie4, les deux dernières décennies ont été témoins d'un intérêt expérimental accru pour le cricket, en particulier axé sur l'évolution et le développement de cet organisme5. Le cricket est un insecte hémimétabolous qui se ramifie basally à des insectes holometabolous bien étudiés, tels que D. melanogaster et Tribolium castaneum6. En raison de sa position utile sur l'arbre évolutif, les scientifiques sont intéressés à poser des questions expérimentales modernes et sophistiquées dans cet insecte, ce qui a conduit à un intérêt croissant dans l'adaptation des outils moléculaires pour l'utilisation dans G. bimaculatus.
Les injections de réactifs moléculaires dans les œufs de cricket peuvent être utilisées pour des expériences de modification génomique ainsi que des manipulations non génomiques de l'expression génique chez les embryons. Par exemple, transgénique G. bimaculatus portant des insertions eGFP ont été créés à l'aide de la transposase piggyBac7,8. Les chercheurs ont réussi à créer des nucléases knock-out G. bimaculatus à l'aide de nucléases de zinc-doigt (ZNN) et d'activateurs de transcription (TAL) nucléases effecteurs (TALENs) pour introduire des pauses à double brin dans des régions génomiques spécifiques9. Bien que les ZFN et les TALEN permettent un ciblage spécifique au site chez les animaux au-delà des quatre grands systèmes modèles, ces réactifs ont rapidement été dépassés par le système CRISPR/Cas9, qui est plus simple à utiliser, plus efficace et très flexible10. CRISPR a été utilisé dans G. bimaculatus pour produire knock-out11 ainsi que knock-in lignes12,13 En plus de la modification génomique, dsRNA peut être injecté dans les œufs pour renverser l'expression de l'ARNm en développement embryons, permettant aux chercheurs de comprendre le rôle de transcriptions spécifiques tout au long du développement14,15. Quelques détails limités sur la façon d'injecter des œufs de cricket ont été publiés précédemment12.
Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour injecter les oeufs tôt de G. bimaculatus. Ce protocole est efficace et facilement adaptable à divers milieux de laboratoire, matériaux d'injection, et peut-être à d'autres insectes. Bien que des détails supplémentaires pour la conception et la mise en œuvre de modifications génomiques et d'expériences de renversement ont été publiés ailleurs12,13, ces approches finiront par s'appuyer sur le protocole d'injection détaillé ici.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluorescent dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165 FC</td>
			<td>Stereomicroscope with fluorescence</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External light source for fluorescence</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EL 6000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-300</td>
			<td>-Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry filter cube</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M205FA/M165FC</td>
			<td>Filter cube for mCherry or similar red dye will work</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>M3301R</td>
			<td>Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MMO-202ND</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Holder (Needle holder)</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>HD-21</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Tubing to connect air source to microinjector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg well stamp</td>
			<td>3D printed</td>
			<td>custom</td>
			<td>3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator or temperature controlled room</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>Temperatures of 23.5-26&#176;C are needed.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cricket food</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>cat food or fish flakes are appropriate food.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cricket wter</td>
			<td>vairous</td>
			<td></td>
			<td>Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cricket shelter</td>
			<td>arious</td>
			<td></td>
			<td>Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary tubes</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>Item no. 1B100F-4</td>
			<td>Kwik-Fil&#8482; Borosilicate Glass Capillaries, 100mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Flaming/Brown</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td>Distributed by Sutter Instrument Co.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beveller/Micro grinder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>Model EG-45/EG-400</td>
			<td>EG-400 includes a microscope head</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>Product code 229693</td>
			<td>90mm diameter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Play Sand</td>
			<td>Sandtastik Products Ltd.</td>
			<td>B003U6QLVS</td>
			<td>White play sand</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB000972</td>
			<td>Agarose GPG/LE ultrapure</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers</td>
			<td>US Kitchen Supply</td>
			<td>Model SS-C123</td>
			<td>Pore size should be between 0.5 - 1.0 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>Ref 15070-063</td>
			<td>Pen Strep</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tweezers</td>
			<td>Sipel Electronic SA</td>
			<td>P3C-STD</td>
			<td>Black Static Dissipative, 118mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filters, 25mm diameter, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>725-2545</td>
			<td>Use with 1 ml syringe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309602</td>
			<td>Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air tank (optional)</td>
			<td>Midwest Products</td>
			<td>Air Works&#174;</td>
			<td>Portable air tank</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Rhodamine dye</td>
			<td rowspan="2">Thermofisher</td>
			<td rowspan="2">D-1817</td>
			<td rowspan="2">dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL loading tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Order no. 5242 956.003</td>
			<td>epT.I.P.S. 20uL Microloader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axioskope 2 plus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X objective</td>
			<td>Ziess</td>
			<td>Plan-Apochromat 20x/0.75 M27</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMC 5400</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite&#160; software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LAS</td>
			<td>Version 4.6.2 used here</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injecting gryllus bimaculatus eggs

La modification de la fonction génique dans un organisme en développement est au cœur de différents types d'expériences. Bien que des outils génétiques extrêmement puissants aient été développés dans les systèmes modèles traditionnels, il est difficile de manipuler des gènes ou de l'ARN messager (ARNM) dans la plupart des autres organismes. Dans le même temps, les approches évolutives et comparatives reposent sur une exploration de la fonction génique chez de nombreuses espèces différentes, nécessitant le développement et l'adaptation de techniques de manipulation de l'expression en dehors de la situation actuellement génétiquement traitable. espèce. Ce protocole décrit une méthode d'injection de réactifs dans les œufs de cricket pour évaluer les effets d'une manipulation donnée sur le développement embryonnaire ou larvaire. Des instructions sur la façon de recueillir et d'injecter des œufs avec des aiguilles bevées sont décrites. Cette technique relativement simple est flexible et potentiellement adaptable à d'autres insectes. On peut recueillir et injecter des dizaines d'œufs en une seule expérience, et les taux de survie pour les injections de tampon seulement s'améliorent avec la pratique et peuvent être aussi élevés que 80%. Cette technique soutiendra plusieurs types d'approches expérimentales, y compris l'injection d'agents pharmacologiques, l'ARNm plafonné in vitro pour exprimer des gènes d'intérêt, l'ARN à double brin (dsRNA) pour obtenir des interférences d'ARN, l'utilisation de grappes régulièrement répétitions palindromic courtes interspatiales (CRISPR) de concert avec des réactifs de protéines 9 (Cas9) associés au CRISPR (Cas9) pour la modification génomique, et des éléments transposables pour générer des lignes transgéniques transitoires ou stables.

Les grillons pondent facilement des œufs dans le matériau humide, et fournir des matériaux adéquats, comme le sable humide ou la saleté, les incite à pondre un grand nombre d'œufs. Ceci est particulièrement efficace si les grillons sont d'abord privés de matériel de ponte pendant 8 à 10 h. Les œufs pondus dans du sable propre peuvent être facilement séparés, recueillis (figure 1B) et placés dans des puits d'œufs conçus sur mesure pour être ...

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Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Injection d'œufs Gryllus bimaculatus

Ici, nous présentons un protocole pour injecter des œufs de cricket, une technique qui sert de méthode fondamentale dans de nombreuses expériences dans le cricket, y compris, mais sans s'y limiter, l'interférence de l'ARN et la manipulation génomique.

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been ...

Cette technique sert de méthode de base pour les expériences conçues pour apaiser le développement embryonnaire ou larvaire du cricket. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est flexible et qu’elle soutiendra plusieurs types d’approches expérimentales, telles que celles utilisant l’interférence arn ou la manipulation génomique. Hadley Wilson Horch, chercheuse principale au laboratoire, démontrera la procédure.Pour commencer cette procédure humide le plan de broyeur de filature du biseau avec de l’eau qui coule. Placez l’aiguille tirée dans le biseau et tournez-la à un angle de 20 degrés. Abaissez l’aiguille jusqu’à ce qu’elle touche simplement la plaque de broyage et biseauté pendant deux à trois minutes.Évaluez le biseau en plaçant l’aiguille biseauté sur du ruban adhésif double qui a été adhéré à une lame de microscope en verre. Placez la diapositive sur la scène d’un microscope composé équipé d’un logiciel d’acquisition d’appareils photo et d’images. Acquérir une image de l’aiguille à l’aide d’un objectif 20x.Utilisez le logiciel d’imagerie pour mesurer le diamètre intérieur lumen de l’aiguille juste proximale à l’ouverture biseauté. Jetez les aiguilles dont l’ouverture est inférieure à huit micromètres ou supérieure à 12 micromètres. Tout d’abord, faire 40 millilitres de 1% agarose dans l’eau et le verser dans une boîte de 10 centimètres Petri.Placer un timbre de puits d’œuf à la surface de l’agarose avant qu’il ne se solidifie. Une fois l’agarose solidifiée, retirez le timbre pour révéler les puits. Ensuite, remplissez la plaque de puits agarose avec HBS contenant 1% de streptomycine de pénicilline.Placez le couvercle sur le plat, enveloppez-le dans parafilm et rangez-le à quatre degrés Celsius. Après cela, remplissez une boîte de Petri de 35 millimètres de sable blanc de terrain de jeux pour faire un plat de collecte d’oeufs pour les grillons à pondre des œufs po Couvrir le plat d’oeufs d’un carré de serviette en papier coupé à environ 18 par 18 centimètres.Remplir d’eau du robinet à travers la serviette en papier. Ensuite, inclinez la boîte de Pétri et pressez doucement le dessus pour enlever l’excès d’eau. Rentrez les coins du carré de serviette en papier sous le plat et placez le plat d’oeufs dans un couvercle inversé qui aidera à maintenir la serviette en papier en place.Placer le plat d’oeufs dans le bac de cricket et laisser les femelles adultes oviposit les œufs pendant une à deux heures. Pendant ce temps, laisser chauffer le plat d’agarose à température ambiante en vue de la tenue des œufs pour injection. Une fois prêt, retirer le plat de collecte des œufs, qui contient maintenant des œufs fraîchement pondus, du bac de cricket.Retirer l’essuie-tout et placer une passoire avec une taille de pore comprise entre 0,5 et un millimètre sur un bécher. Rincer le contenu du plat de ponte dans la passoire sous l’eau du robinet qui fonctionne doucement. Les grains de sable tomberont à travers la maille de la passoire dans le bécher ci-dessous tandis que les oeufs de cricket resteront dans le panier de passoire.Remplissez un récipient d’eau d’osmose inverse et placez-le dans un plateau. Inverser la passoire sur le récipient et la tapoter contre le plat pour déloger les œufs dans l’eau. Les œufs couleront au fond du récipient.Ensuite, utilisez des ciseaux pour couper la pointe d’une pointe de pipette P1000 pour faire une ouverture d’environ trois millimètres de diamètre. Placez cette pointe sur un pipetter P1000, et utilisez-le pour transférer les oeufs du récipient au plat de moules à oeufs agarose. À l’aide d’une pince à épiler en plastique, aligner les œufs dans les puits agarose.Chaque œuf coulera au fond d’un puits individuel. Couvrir la boîte de Pétri d’un couvercle jusqu’à ce qu’elle soit prête à s’injecter. Pour commencer, placez le plat d’œufs sous le microscope disséquant et sélectionnez un faible grossissement d’environ 10x.Dessinez 1,5 microlitres de solution d’injection à l’aide de 20 conseils de chargement de microlitres et d’une pipette P10 et insérez la pointe de chargement dans l’extrémité large de l’aiguille d’injection. Expulser la solution d’injection dans l’aiguille d’injection. Insérez l’aiguille dans le boîtier d’injection et serrez-la, en vous assurant que l’aiguille est correctement et fermement insérée dans le boîtier.Insérez ensuite soigneusement le boîtier d’injection dans le micromanipulateur, en prenant soin de ne pas casser ou d’être blessé par l’aiguille. Tout en regardant les oeufs et l’aiguille à travers le microscope, déplacez l’aiguille près du X dans le coin supérieur gauche de la grille de vaisselle. Abaissez l’aiguille jusqu’à ce que la pointe entre dans le HBS plus la solution tamponnée de streptomycine de pénicilline dans le plat.Centrer l’aiguille dans le champ de vision et déplacer le plat d’oeufs de sorte que l’aiguille est de quelques millimètres plus près du bord du plat que les œufs. Après cela, réglez le microscope sur le filtre approprié pour rhodamine pour observer la fluorescence dans l’aiguille et se concentrer sur sa pointe. Sur le microinjecteur tourner lentement le bouton d’équilibre dans le sens des aiguilles d’une montre jusqu’à ce que la solution d’injection commence à s’échapper de l’aiguille dans la solution de suspension.Puis tournez le bouton en arrière dans le sens inverse des aiguilles d’une montre légèrement jusqu’à ce que le colorant cesse juste de fuir de l’aiguille. Avec l’aiguille toujours centrée dans le champ de vision, déplacer le plat d’oeufs de sorte que l’aiguille est dirigée vers l’œuf à injecter en premier. Ajustez le grossissement à environ 50x de sorte qu’un seul œuf remplit la majeure partie du champ de vision.Utilisez à la fois le micromanipulateur et la main sur le plat d’oeufs pour déplacer l’aiguille en position pour l’injection. Utilisez le micromanipulateur pour faire avancer l’aiguille et insérer la pointe dans le premier œuf à être injecté, en vous assurant d’insérer l’aiguille à 20 à 30% de la longueur de l’œuf de l’extrémité postérieure de l’œuf perpendiculairement au long axe de l’œuf. Injectez la solution avec la pédale d’injection ou le bouton d’injection sur le microinjecteur.Un petit bolus de matériel fluorescent à l’intérieur de l’œuf indiquera une injection réussie. Après cela, retirer l’aiguille de l’œuf. Si l’œuf est soulevé involontairement hors de son puits après la rétractation de l’aiguille, utilisez de petits forceps pour pousser l’œuf dans le puits tout en rétractant l’aiguille.Dans cette étude, les œufs de cricket sont injectés à l’aide d’une technique qui sert de méthode de base dans de nombreuses expériences, y compris, sans s’y limiter, l’interférence arn et la manipulation génomique. Le taux de survie est un paramètre important pour évaluer le succès de cette expérience. La plupart des œufs morts peuvent facilement être identifiés par la vue que le jaune et le tissu embryonnaire dans l’œuf commencent à s’agglutiner inégalement, et finalement la plupart du jaune migrera vers un côté de l’œuf.Lorsqu’ils ont été évalués après quatre à six jours, plus de 85 % des œufs non injectés ont survécu, tandis que les œufs injectés avec des réaignants expérimentaux avaient généralement un taux de survie inférieur. Le contrôle de tous les aspects de l’injection elle-même, y compris la ponction de l’aiguille, l’introduction de colorant et de tampon, ou la présence d’ARN de véhicule ou de double brin, est nécessaire afin de comprendre les véritables effets de la manipulation expérimentale tentée. La façon dont on évalue les résultats phénotypiques de l’injection dépend de ce qui a été injecté.Par exemple, les changements phénotypiques à la suite de renversements spécifiques de l’ARNm peuvent être évidents au niveau de l’anatomie brute. Si, d’autre part, un cDNA codant un gène EGFP marqué histone 2B sous le contrôle d’un promoteur d’actine G.bimaculatus est inséré dans le génome du cricket à l’aide de la transposase de ferroutage, il devient possible de visualiser chaque noyau de l’œuf à l’aide de fluorescence pour exciter la protéine hist 2B taguée EGFP. Ajuster l’équilibre de sorte que les aiguilles ne obstruent pas est une étape critique dans cette procédure.Vous devrez peut-être faire plusieurs ajustements après les injections subséquentes puisque le jaune obstrue parfois la pointe de l’aiguille. Le cricket est un insecte hémimétabolique qui se ramifie basiquement à des insectes holométaboliques bien étudiés tels que Drosophila. L’étude du développement du cricket nous aidera à mieux comprendre l’évolution et le développement à travers le règne animal.Cette technique demande un peu de pratique. Nous recommandons de pratiquer des injections de contrôle jusqu’à ce que le taux de survie quatre ou cinq jours après l’injection soit d’au moins 80%

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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