Name: injecting gryllus bimaculatus eggs
Uploaded: 2019-08-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Injecting Gryllus bimaculatus Eggs at JoVE.com

מחקרים שדווחו בפרויקט זה נתמך על ידי פרס פיתוח מוסדי (רעיון) מן המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכון הלאומי לבריאות תחת מספר מענק P20GM10342 כדי HH3, ועל ידי NSF מספר הפרס IOS-1257217 . בסדר.

1. התקנת חומרה והכנת חומרים
הערה: נא לעיין בטבלה 1 ובטבלת חומרים להכנת פתרונות, מגיב ופרטי ציוד.
<ol><li>הגדר מיקרוסקופ מבתר כדי לראות ביצים ולהנחות את מחט ההזרקה. (איור 1A מראה מיקרוסקופ מבתר המצויד בזריחה). יכולת הקרינה הפלואורסצנטית ...

<ol>
	<li>Abzhanov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+there+yet?+Tracking+the+development+of+new+model+systems.">Are we there yet? Tracking the development of new model systems.</a> Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).</li><li>Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+August+Krogh+principle:+&#8220;For+many+problems+there+is+an+animal+on+which+it+can+be+most+conveniently+studied.">The August Krogh principle: &#8220;For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied.</a> Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).</li><li>Krogh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Progress+of+Physiology.">The Progress of Physiology.</a> American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).</li><li>Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cricket neurobiology and behavior. , (1989).</li><li>Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , (2017).</li><li>Misof, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenomics+resolves+the+timing+and+pattern+of+insect+evolution.">Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution.</a> Science. 346 (6210), 763-767 (2014).</li><li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+transgenic+cricket+embryos+reveals+cell+movements+consistent+with+a+syncytial+patterning+mechanism.">Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism.</a> Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).</li><li>Shinmyo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac-mediated+somatic+transformation+of+the+two-spotted+cricket,+Gryllus+bimaculatus.">piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Development, growth &amp; differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).</li><li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-transgenic+genome+modifications+in+a+hemimetabolous+insect+using+zinc-finger+and+TAL+effector+nucleases.">Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases.</a> Nature communications. 3, 1017 (2012).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).</li><li>Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+crickets+for+the+study+of+learning+and+memory:+Dopamine+receptor+Dop1+mediates+aversive+but+not+appetitive+reinforcement+in+crickets.">Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets.</a> Scientific Reports. 5, 15885 (2015).</li><li>Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+in+the+Cricket.">Protocols in the Cricket.</a> The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).</li><li>Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Editing+in+the+Cricket,+Gryllus+bimaculatus.">Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).</li><li>Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch/Delta+signalling+is+not+required+for+segment+generation+in+the+basally+branching+insect+Gryllus+bimaculatus.">Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus.</a> Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).</li><li>Miyawaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Wingless/Armadillo+signaling+in+the+posterior+sequential+segmentation+in+the+cricket,+Gryllus+bimaculatus+(Orthoptera),+as+revealed+by+RNAi+analysis.">Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis.</a> Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).</li><li>Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+live-imaging+of+embryos+in+microwell+arrays+using+a+modular+specimen+mounting+system.">High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system.</a> Biology Open. 7 (7), bio031260 (2018).</li><li>Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+is+required+for+the+generation+of+primordial+germ+cells+in+an+insect.">BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect.</a> Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).</li><li>Larson, E., Andres, J., Harrison, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+male+ejaculate+on+post-mating+prezygotic+barriers+in+field+crickets.">Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets.</a> PLOS ONE. 7 (10), e46202 (2012).</li><li>Donoughe, S., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+development+of+the+cricket+Gryllus+bimaculatus.">Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus.</a> Developmental Biology. , (2016).</li><li>Matsuoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+germ+insects+utilize+both+the+ancestral+and+derived+mode+of+Polycomb+group-mediated+epigenetic+silencing+of+Hox+genes.">Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes.</a> Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).</li><li>Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heads+and+tails:+Evolution+of+antero-posterior+patterning+in+insects.">Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects.</a> Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).</li><li>Bacon, J., Strausfeld, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonrandom+resolution+of+neuron+arrangements.">Nonrandom resolution of neuron arrangements.</a> Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).</li></ol>

שני האתגרים העיקריים עם טכניקה זו הם הנושאים הקשורים של גודל מחט אופטימלית ושרידות. למרות מחטים קטנות לשפר את ההישרדות, מחטים עם צר לומן יש מידה רבה יותר של כוחות קפילר בעבודה, מה שהופך אותו סביר יותר כי החלמון יהיה לעבור לתוך המחט גורמת לו לסתום. במקרה הטוב, ניתן לנקות חסימות פשוט על-ידי הז?...

היכולת לשנות את הגנום או השפעה הביטוי הגן באורגניזמים הוא הבסיס לעיצוב של סוגים רבים של ניסויים בדיקת סיבתיות תפקודית. הוא גם קריטי לעבודה השוואתית ואבולוציונית הרלוונטית שטכניקות שינוי גנומית ושאינן גנוגנות יהיו זמינות באורגניזמים מחוץ למערכות מודל גנטיות מסורתיות בעלי חיים מעבדה (למשל, Mus מוסקולוס, דניו ראריו, דרוזופילה מלאנוגסטר, ואלבורחבאבדיטיס. בין אם מדובר ברצון להבין את הגיוון האורגאיאלי1 או את הדבקות בעיקרון של krogh, כי עבור כל שאלה ביולוגית יש אורגניזם המתאים ביותר לפתרון2,3, היכולת לשנות גנום או השפיע על ביטוי הגנים חיוני לעיצובים ניסיוניים מודרניים.
הצרצר הקריקט הוא מערכת מודל המתעוררים. במהלך המאה האחרונה בניסויים נוירואתולוגיה4, שני העשורים האחרונים היו עדים לעניין ניסיוני מוגבר בקריקט, התמקד בעיקר באבולוציה ובהתפתחות של האורגניזם הזה5. הצרצר הוא חרק מיני המסתעף בholometabolous לחרקים בעלי לימודים היטב, כגון ד. מלאנוגסטר וטריבוליום6. בשל עמדתה השימושית על העץ האבולוציוני, מדענים מעוניינים לשאול שאלות נסיוניות מודרניות ומתוחכמות בחרק זה, אשר הוביל לעניין הולך וגובר בהתאמת כלים מולקולריים לשימוש ב -G. בימרו.
זריקות של ריאגנטים מולקולרי לתוך ביצי קריקט יכול לשמש ניסויים שינוי גנומית, כמו גם מניפולציות שאינן גנומית של הביטוי גנים העוברים. לדוגמה, הטרנסגניים G. בימרו על נושאים הוספות egfp נוצרו באמצעות הטרנספססה 7,8. החוקרים יצרו בהצלחה את הנוקאאוט G. בימרו שימוש בנוקלאוסים לאצבעות אבץ (ZFNs) ותמלול activator-כמו (טל) (talens) כדי להחדיר כפול תקוע הפסקות באזורים גנומית ספציפיים9. למרות ZFNs ו TALENs לאפשר פילוח ספציפי לאתר בעלי חיים מעבר מערכות ארבע מודל גדול, אלה ריאגנטים במהירות העלתה על ידי CRISPR/Cas9 system, אשר פשוט לשימוש, יעיל יותר, וגמיש מאוד10. Crispr שימש ב -G. בימרו כדי לייצר נוק אאוט11 , כמו גם להקיש על קווים12,13 בנוסף שינוי גנומית, dsrna ניתן להזריק ביצים כדי להפיל ביטוי mrna בפיתוח עוברים, המאפשרים לחוקרים להבין את התפקיד של תעתיקים ספציפיים במהלך פיתוח14,15. כמה פרטים מוגבלים על איך להזריק ביצי קריקט פורסמו בעבר12.
כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט להזרקת ביצים מוקדמות. פרוטוקול זה יעיל וניתן בקלות להתאמה להגדרות מעבדה שונות, חומרי הזרקה, ואולי חרקים אחרים. בעוד פרטים נוספים עבור עיצוב ויישום של שינוי גנומית וניסויים בהוצאת מפורסמים פורסמו במקומות אחרים12,13, גישות אלה בסופו של דבר להסתמך על פרוטוקול ההזרקה מפורט כאן.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluorescent dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165 FC</td>
			<td>Stereomicroscope with fluorescence</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External light source for fluorescence</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EL 6000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-300</td>
			<td>-Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry filter cube</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M205FA/M165FC</td>
			<td>Filter cube for mCherry or similar red dye will work</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>M3301R</td>
			<td>Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MMO-202ND</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Holder (Needle holder)</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>HD-21</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Tubing to connect air source to microinjector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg well stamp</td>
			<td>3D printed</td>
			<td>custom</td>
			<td>3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator or temperature controlled room</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>Temperatures of 23.5-26&#176;C are needed.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cricket food</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>cat food or fish flakes are appropriate food.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cricket wter</td>
			<td>vairous</td>
			<td></td>
			<td>Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cricket shelter</td>
			<td>arious</td>
			<td></td>
			<td>Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary tubes</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>Item no. 1B100F-4</td>
			<td>Kwik-Fil&#8482; Borosilicate Glass Capillaries, 100mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Flaming/Brown</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td>Distributed by Sutter Instrument Co.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beveller/Micro grinder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>Model EG-45/EG-400</td>
			<td>EG-400 includes a microscope head</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>Product code 229693</td>
			<td>90mm diameter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Play Sand</td>
			<td>Sandtastik Products Ltd.</td>
			<td>B003U6QLVS</td>
			<td>White play sand</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB000972</td>
			<td>Agarose GPG/LE ultrapure</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers</td>
			<td>US Kitchen Supply</td>
			<td>Model SS-C123</td>
			<td>Pore size should be between 0.5 - 1.0 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>Ref 15070-063</td>
			<td>Pen Strep</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tweezers</td>
			<td>Sipel Electronic SA</td>
			<td>P3C-STD</td>
			<td>Black Static Dissipative, 118mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filters, 25mm diameter, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>725-2545</td>
			<td>Use with 1 ml syringe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309602</td>
			<td>Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air tank (optional)</td>
			<td>Midwest Products</td>
			<td>Air Works&#174;</td>
			<td>Portable air tank</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Rhodamine dye</td>
			<td rowspan="2">Thermofisher</td>
			<td rowspan="2">D-1817</td>
			<td rowspan="2">dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL loading tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Order no. 5242 956.003</td>
			<td>epT.I.P.S. 20uL Microloader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axioskope 2 plus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X objective</td>
			<td>Ziess</td>
			<td>Plan-Apochromat 20x/0.75 M27</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMC 5400</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite&#160; software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LAS</td>
			<td>Version 4.6.2 used here</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injecting gryllus bimaculatus eggs

שינוי תפקוד הגנים באורגניזם מתפתח הוא מרכזי סוגים שונים של ניסויים. בעוד כלים גנטיים מאוד חזק פותחו במערכות מודל מסורתיות, קשה לתמרן גנים או שליח RNA (mRNA) ברוב האורגניזמים האחרים. במקביל, גישות אבולוציונית והשוואתית להסתמך על חקר של תפקוד גנטי במינים שונים רבים, המחייב פיתוח והסתגלות של טכניקות לתמרן הבעה מחוץ כרגע מעוקב גנטי ינים. פרוטוקול זה מתאר שיטה להזרקת ריאגנטים לתוך ביצי קריקט כדי לעבד את ההשפעות של מניפולציה נתונה על התפתחות עובריים או זחל. הוראות כיצד לאסוף ולהזריק ביצים עם מחטים משופע מתוארים. הטכניקה הפשוטה יחסית היא גמישה ועשויה להיות מתכווננת לחרקים אחרים. אפשר לאסוף ולהזריק עשרות ביצים בניסוי אחד, ושיעורי ההישרדות לזריקות מאגר בלבד לשפר עם התרגול יכול להיות גבוה כמו 80%. טכניקה זו תתמוך מספר סוגים של גישות ניסיוני כולל הזרקה של סוכני תרופתי, ב-mRNA מתורבת לבטא גנים של עניין, כפול תקוע RNA (dsRNA) כדי להשיג הפרעות RNA, השימוש באשכולות באופן סדיר במרווחים קצר palindromic חוזר (CRISPR) בקונצרט עם CRISPR הקשורים חלבון 9 (Cas9) ריאגנטים עבור שינוי גנומית, ורכיבים טרנספראבל כדי ליצור קווי טרנסגניים ארעי או יציב.

הצרצרים מניחים בקלות ביצים בחומר הלח, ומספקים חומר מתאים, כגון חול לח או עפר, הגורם להם להטיל מספר גדול של ביצים. זה יעיל במיוחד אם הצרצרים מונעים הראשון של חומר הנחת ביצה עבור 8-10 h. ביצים הונחו בחול נקי ניתן להפריד בקלות, נאסף (איור 1B) והניח לתוך מותאם אישית ?...

Watch this Scientific Journal Video about Injecting Gryllus bimaculatus Eggs at JoVE.com

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

הזרקת גרללוס ביצי ביצה

כאן אנו מציגים פרוטוקול להזריק ביצי קריקט, טכניקה המשמשת כשיטה היסוד בניסויים רבים בקריקט, כולל, אך לא מוגבל, הפרעה RNA ומניפולציה גנומית.

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been ...

טכניקה זו משמשת כשיטה בסיסית לניסויים שנועדו להתוות את ההתפתחות העוברית או הזחלית של הקריקט. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא גמישה ותתמוך במספר סוגים של גישות ניסיוניות, כגון אלה המנצלות הפרעות RNA או מניפולציה גנומית. הדגימה להליך תהיה האדלי וילסון הורץ', החוקרת הראשית במעבדה.כדי להתחיל בהליך זה הרטיב את מישור המטחנה המסתובב של השבל עם מים נוטפים. מניחים את המחט שנמשכה לתוך המשפר ומסובבים אותה לזווית של 20 מעלות. מנמיך את המחט עד שהיא נוגעת בצלחת השחזה ומקסים אותה לשתיים עד שלוש דקות.להעריך את שיפוע על ידי הנחת המחט משופע על קלטת מקל כפול כי כבר דבק שקופית מיקרוסקופ זכוכית. מקם את השקופית על הבמה של מיקרוסקופ מורכב המצויד במצלמה ובתוכנות לרכישת תמונות. לרכוש תמונה של המחט באמצעות מטרה 20x.השתמש בתוכנת ההדמיה כדי למדוד את קוטר לומן הפנים של המחט רק קרוב לפתיחה משופעת. השלך מחטים עם פתח קטן משמונה מיקרומטר או גדול מ-12 מיקרומטר. ראשית, להכין 40 מיליליטר של 1% agarose במים ויוצקים אותו לתוך צלחת פטרי 10 ס"מ.מניחים חותמת ביצה היטב על פני השטח של agarose לפני שהוא מתגבש. לאחר התעוררות הוא התגבש, להסיר את החותמת כדי לחשוף את בארות. לאחר מכן, מלאו את צלחת הבאר עם HBS המכיל 1%פניצילין סטרפטומיצין.מניחים את המכסה על המנה, עוטפים אותה בפרפילם ומאחסנים אותה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, למלא צלחת פטרי 35 מילימטר עם חול מגרש משחקים לבן כדי להפוך את צלחת איסוף ביצים עבור הצרצרים להטיל ביצים. מכסים את צלחת הביצה עם ריבוע מגבת נייר חתוך כ 18 על 18 ס"מ.מלאו במי ברז דרך מגבת הנייר. לאחר מכן, להטות את צלחת פטרי בעדינות לסחוט את החלק העליון כדי להסיר מים עודפים. מניחים את הפינות של ריבוע מגבת הנייר מתחת לצלחת ומניחים את צלחת הביצה במכסה הפוך אשר יסייע לשמור על מגבת הנייר במקום.מניחים את צלחת הביצים לתוך פח הקריקט ומאפשרים לנקבות הבוגרות לביצת את הביציות במשך שעה עד שעתיים. בינתיים, לאפשר את צלחת אגרוז להתחמם לטמפרטורת החדר לקראת החזקת הביצים להזרקה. כאשר מוכן, להסיר את צלחת איסוף הביצים, עכשיו המכיל ביצים טריות, מפח הקריקט.מוציאים את מגבת הנייר ומניחים מסננת בגודל נקבובית בין 0.5 למילימטר אחד מעל מקור. שוטפים את תכולת צלחת הטלת הביצים לתוך מסננת תחת מי ברז זורמים בעדינות. גרגרי החול ייפלו דרך רשת מסננת לתוך המק מתחת בעוד ביצי קריקט להישאר בסל מסננת.ממלאים מיכל במים הפוכים של אוסמוזה וממקמים אותו במגש. הפוך את מסננת מעל המיכל והקש אותו על המנה כדי לנתק את הביצים למים. הביצים ישקעו לתחתית המיכל.לאחר מכן, השתמש במספריים כדי לחתוך את הקצה את קצה פיפטה P1000 כדי להפוך את הפתיחה כשלושה מילימטרים קוטר. מניחים את הטיפ הזה על צינור P1000, ולהשתמש בו כדי להעביר את הביצים מן המיכל לצלחת תבניות ביצה אגרוז. בעזרת פינצטה מפלסטיק, מרווים את הביצים בארות אגרוז.כל ביצה תשקע לתחתית באר בודדת. מכסים את צלחת פטרי עם מכסה עד מוכן להזריק. כדי להתחיל, מניחים את צלחת הביצים מתחת למיקרוסקופ לנתח ולבחור הגדלה נמוכה של סביב 10x.צייר 1.5 microliters של פתרון הזרקה באמצעות 20 טיפים טעינה microliter ו פיפטה P10 ולהכניס את קצה הטעינה לתוך הקצה הרחב של מחט ההזרקה. לגרש את פתרון ההזרקה לתוך מחט ההזרקה. הכנס את המחט לתוך דיור ההזרקה ולהדק, לוודא כי המחט מוכנס כראוי בחוזקה לתוך הדיור.ואז בזהירות להכניס את דיור ההזרקה לתוך micromanipulator, נזהר לא לשבור או להיפגע על ידי המחט. תוך כדי התבוננות הן בביצים והן במחט דרך המיקרוסקופ, הזז את המחט ליד ה- X בפינה השמאלית העליונה של רשת הכלים. מנמיכים את המחט עד שהטיפ נכנס ל- HBS בתוספת פתרון אגירת פניצילין סטרפטומיצין בצלחת.מרכזים את המחט בשדה הראייה ומזיזים את צלחת הביצה כך המחט היא כמה מילימטרים קרוב יותר לקצה המנה מאשר הביצים. לאחר מכן, הגדר את המיקרוסקופ למסנן המתאים לרודאמין כדי לבחון את הפלואורסצנטיות במחט ולהתמקד בקצה שלה. על microinjector לאט להפוך את ידית האיזון בכיוון השעון עד פתרון ההזרקה מתחיל לדלוף מתוך המחט לתוך פתרון ההשעיה.ואז להפוך את הידית לאחור נגד כיוון השעון מעט עד הצבע פשוט מפסיק לדלוף מתוך המחט. עם המחט עדיין מרוכז בשדה הנוף, להזיז את צלחת הביצה, כך המחט מכוונת הביצה להיות מוזרק הראשון. התאימו את ההגדלה ל-50x כדי שבצה אחת תמלא את רוב שדה המבט.השתמש הן micromanipulator ואת היד של אחד על צלחת הביצה כדי להזיז את המחט למקומו להזרקה. השתמש micromanipulator כדי לקדם את המחט ולהכניס את הקצה לתוך הביצה הראשונה להיות מוזרק, הקפד להכניס את המחט ב 20 עד 30% של אורך הביצה מהקצה האחורית של הביצה בניצב לציר הארוך של הביצה. להזריק את הפתרון עם דוושת רגל ההזרקה או כפתור ההזרקה על microinjector.בולוס קטן של חומר פלואורסצנטי בתוך הביצה יצביע על זריקה מוצלחת. לאחר מכן, לסגת המחט מהביצה. אם הביצה מורמת שלא במתכוון מה בארה שלה עם נסיגת המחט, השתמש במטליות קטנות כדי לדחוף את הביצה בחזרה לתוך באר תוך נסיגת המחט.במחקר זה, ביצי קריקט מוזרקות באמצעות טכניקה המשמשת כשיטה בסיסית בניסויים רבים, כולל אך לא מוגבל, הפרעות RNA ומניפולציה גנומית. שיעור ההישרדות הוא פרמטר חשוב אחד להערכת ההצלחה של ניסוי זה. רוב הביצים המתות ניתן לזהות בקלות על ידי ראייה כמו חלמון רקמה עוברית בתוך הביצה מתחילים להצמיע בצורה לא אחידה, ובסופו של דבר רוב החלמון ינדדו לצד אחד של הביצה.כאשר העריכו לאחר ארבעה עד שישה ימים, יותר מ 85% של ביצים uninjected שרדו, בעוד ביצים מוזרק עם רייגנטים ניסיוניים בדרך כלל היה שיעור הישרדות נמוך יותר. שליטה על כל ההיבטים של הזריקה עצמה, כולל ניקור מחט, כניסתה של צבע חיץ, או נוכחות של רכב או RNA תקוע כפול, נדרש כדי להבין את ההשפעות האמיתיות של ניסיון המניפולציה הניסיונית. האופן שבו אדם מעריך את התוצאות הפנוטיפיות של ההזרקה תלוי במה שהוזרק.לדוגמה, שינויים פנוטיפיים כתוצאה מנפילות mRNA ספציפיות עשויים להיות ברורים ברמת האנטומיה הגולמית. אם מצד שני cDNA קידוד EGFP מתויג histone 2B גן תחת שליטתו של מקדם ACTIN G.bimaculatus מוכנס לתוך הגנום קריקט באמצעות טרנספוזאז חזירון, ניתן לדמיין כל גרעין בביצה באמצעות פלואורסצנטיות כדי לרגש את EGFP מתויג היס 2B חלבון. התאמת האיזון כך המחטים לא לסתום הוא צעד קריטי בהליך זה.ייתכן שיהיה עליך לבצע מספר התאמות לאחר זריקות עוקבות מאז חלמון לפעמים סותם את קצה המחט. הצרצר הוא חרק hemimetabolous כי ענפים בזלת חרקים holometabolous למד היטב כגון Drosophila. לימוד התפתחות קריקט יעזור לנו להבין יותר על האבולוציה וההתפתחות ברחבי ממלכת החי.טכניקה זו דורשת תרגול מסוים. אנו ממליצים לתרגל זריקות בקרה עד שיעור ההישרדות ארבעה או חמישה ימים לאחר ההזרקה הוא לפחות 80%

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

מליחות תלויות Assay הרעילה של הכסף Nanocolloids שימוש Medaka ביצים

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

In Ovo Feeding of Commercial Broiler Eggs: An Accurate and Reproducible Method to Affect Muscle Development and Growth

In Ovo Feeding of Commercial Broiler Eggs: An Accurate and Reproducible Method to Affect Muscle Development and Growth

באובו האכלה של ביצי ברוילר מסחריות: שיטה מדויקת וניתנת לשחזור המשפיעה על התפתחות השרירים וצמיחתם

Within the past three decades, red meat and poultry scientists focused on developing strategies and technologies to manipulate muscle development during ...

Investigating Development with Optogenetic Signaling Manipulation in Zebrafish

Optogenetic Signaling Activation in Zebrafish Embryos

Manipulating Signaling in Zebrafish Embryos to Decode Cell Fate Decisions (Video) | JoVE

הפעלת איתות אופטוגנטי בעוברים של דגי זברה

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally ...

Enhancing Protein Visualization with Antibody-Mediated Live Imaging

Visualizing Low-Abundance Proteins and Post-Translational Modifications in Living Drosophila Embryos via Fluorescent Antibody Injection

Unveiling the Dynamics of Mechanical and Biochemical Signals in Animal Morphogenesis Research (Video) | JoVE

הדמיה של חלבונים בשפע נמוך ושינויים לאחר תרגום בעוברי דרוזופילה חיים באמצעות הזרקת נוגדנים פלואורסצנטיים

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein ...