Name: injecting gryllus bimaculatus eggs
Uploaded: 2019-08-22T13:00:00
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इस परियोजना में रिपोर्ट किए गए अनुसंधान को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान से एचएच 3 को अनुदान संख्या पी20जीएम10342 के तहत और एनएसएफ पुरस्कार संख्या आईओएस-1257217 द्वारा एक संस्थागत विकास पुरस्कार (आईडीईए) द्वारा समर्थित किया गया था। CGE.

1. हार्डवेयर सेटअप और सामग्री की तैयारी
नोट: समाधान, अभिकर्मक, और उपकरण विवरण तैयार करने के लिए सामग्री की तालिका 1 और तालिका देखें।
<ol><li>अंडे देखने और इंजेक्शन सुई मार्गदर्श...

<ol>
	<li>Abzhanov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+there+yet?+Tracking+the+development+of+new+model+systems.">Are we there yet? Tracking the development of new model systems.</a> Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).</li><li>Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+August+Krogh+principle:+&#8220;For+many+problems+there+is+an+animal+on+which+it+can+be+most+conveniently+studied.">The August Krogh principle: &#8220;For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied.</a> Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).</li><li>Krogh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Progress+of+Physiology.">The Progress of Physiology.</a> American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).</li><li>Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cricket neurobiology and behavior. , (1989).</li><li>Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , (2017).</li><li>Misof, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenomics+resolves+the+timing+and+pattern+of+insect+evolution.">Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution.</a> Science. 346 (6210), 763-767 (2014).</li><li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+transgenic+cricket+embryos+reveals+cell+movements+consistent+with+a+syncytial+patterning+mechanism.">Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism.</a> Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).</li><li>Shinmyo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac-mediated+somatic+transformation+of+the+two-spotted+cricket,+Gryllus+bimaculatus.">piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Development, growth &amp; differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).</li><li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-transgenic+genome+modifications+in+a+hemimetabolous+insect+using+zinc-finger+and+TAL+effector+nucleases.">Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases.</a> Nature communications. 3, 1017 (2012).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).</li><li>Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+crickets+for+the+study+of+learning+and+memory:+Dopamine+receptor+Dop1+mediates+aversive+but+not+appetitive+reinforcement+in+crickets.">Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets.</a> Scientific Reports. 5, 15885 (2015).</li><li>Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+in+the+Cricket.">Protocols in the Cricket.</a> The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).</li><li>Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Editing+in+the+Cricket,+Gryllus+bimaculatus.">Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).</li><li>Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch/Delta+signalling+is+not+required+for+segment+generation+in+the+basally+branching+insect+Gryllus+bimaculatus.">Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus.</a> Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).</li><li>Miyawaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Wingless/Armadillo+signaling+in+the+posterior+sequential+segmentation+in+the+cricket,+Gryllus+bimaculatus+(Orthoptera),+as+revealed+by+RNAi+analysis.">Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis.</a> Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).</li><li>Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+live-imaging+of+embryos+in+microwell+arrays+using+a+modular+specimen+mounting+system.">High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system.</a> Biology Open. 7 (7), bio031260 (2018).</li><li>Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+is+required+for+the+generation+of+primordial+germ+cells+in+an+insect.">BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect.</a> Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).</li><li>Larson, E., Andres, J., Harrison, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+male+ejaculate+on+post-mating+prezygotic+barriers+in+field+crickets.">Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets.</a> PLOS ONE. 7 (10), e46202 (2012).</li><li>Donoughe, S., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+development+of+the+cricket+Gryllus+bimaculatus.">Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus.</a> Developmental Biology. , (2016).</li><li>Matsuoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+germ+insects+utilize+both+the+ancestral+and+derived+mode+of+Polycomb+group-mediated+epigenetic+silencing+of+Hox+genes.">Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes.</a> Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).</li><li>Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heads+and+tails:+Evolution+of+antero-posterior+patterning+in+insects.">Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects.</a> Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).</li><li>Bacon, J., Strausfeld, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonrandom+resolution+of+neuron+arrangements.">Nonrandom resolution of neuron arrangements.</a> Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).</li></ol>

इस तकनीक के साथ दो मुख्य चुनौतियों इष्टतम सुई आकार और survivability से संबंधित मुद्दे हैं. हालांकि छोटी सुइयों survivability में सुधार, संकरे lumens के साथ सुइयों काम पर केशिका बलों का एक बड़ा डिग्री है, जो यह अधिक संभावना है ...

जीवों में जीनोम को संशोधित करने या जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित करने की क्षमता कार्यात्मक कारणता का परीक्षण प्रयोगों के कई प्रकार के डिजाइन के लिए आधार है। यह तुलनात्मक और विकासकेयोग्य कार्य के लिए भी महत्वपूर्ण है कि जीनोमिक और गैर-भूगर्भीय संशोधन तकनीक पारंपरिक आनुवंशिक प्रयोगशाला पशु मॉडल प्रणालियों के बाहर जीवों में उपलब्ध हो (उदाहरण के लिए, मस्क्यूलस, Danio रीरियो, ड्रोसोफिला मेलेनोगैस्टर, और केनोरब्डाइटिस एलेगेन्स) चाहे वह जीव विविधता1 या एक Krogh के सिद्धांत के पालन को समझने की इच्छा है, कि हर जैविक सवाल के लिए वहाँ एक जीव सबसे अच्छा इसके समाधान के लिए अनुकूल है2,3,जीनोम को संशोधित करने की क्षमता या प्रभाव जीन अभिव्यक्ति आधुनिक प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए आवश्यक है.
क्रिकेट ग्रिलस बिमाकुलेटस एक उभरती हुई मॉडल प्रणाली है। न्यूरोएथोलॉजी प्रयोगों4में पिछली शताब्दी के लिए प्रयुक्त , पिछले दो दशकों में क्रिकेट में प्रयोगात्मक रुचि में वृद्धि हुई है , विशेष रूप से इस जीव के विकास और विकास पर ध्यान केंद्रित5. क्रिकेट एक अर्धधातुबोलिक कीट है जो अच्छी तरह से अध्ययन किए गए होलोमेटाबोलस कीटों की शाखाओं को आधारित करता है, जैसे डी मेलेनोगैस्टर और ट्राइबोलियम कैस्टेनम6। विकासवादी पेड़ पर अपनी उपयोगी स्थिति के कारण, वैज्ञानिकों को इस कीट में आधुनिक, परिष्कृत प्रयोगात्मक सवाल पूछने में रुचि रखते हैं, जिसके कारण जी बिमाकुलटसमें उपयोग के लिए आणविक उपकरणों को अनुकूलित करने में बढ़ती रुचि पैदा हुई है।
क्रिकेट के अंडों में आणविक अभिकर्मकों के इंजेक्शन का उपयोग जीनोमिक संशोधन प्रयोगों के साथ-साथ भ्रूणों में जीन अभिव्यक्ति के गैर-जीनोमिक जोड़-तोड़ के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, ट्रांसपोसे पिग्गीबैक7,8का उपयोग करते हुए ईजीएफपी प्रविष्टि ले जाने वाले ट्रांसजेनिक जी बिमाकुलटस का सृजन किया गया है। जांचकर्ताओं ने जिंक-उंगली न्यूक्लेस (जेडएफएनएस) और ट्रांसक्रिप्शन एक्टिवेटर-जैसे (टीएएएए) प्रभावक न्यूक्लेस (TALENs) का उपयोग करके नॉकआउट जी bimaculatus को सफलतापूर्वक बनाया है ताकि विशिष्ट जीनोमिक क्षेत्रों9में डबल-स्ट्रेंड ब्रेक लागू किया जा सके। हालांकि [FNs और TALENs बड़े चार मॉडल सिस्टम से परे जानवरों में साइट-विशिष्ट लक्ष्यीकरण की अनुमति है, इन अभिकर्मकों जल्दी CRISPR/Cas9 प्रणाली है, जो प्रयोग करने के लिए आसान है, और अधिक कुशल, और अत्यधिक लचीला10से पार कर गया है. CRISPR जी bimaculatus में इस्तेमाल किया गया है नॉक-आउट11 के रूप में अच्छी तरह से दस्तक लाइनों12,13 जीनोमिक संशोधन के अलावा, dsRNA अंडे में इंजेक्ट किया जा सकता है विकसित करने में MRNA अभिव्यक्ति नीचे दस्तक भ्रूण, जांचकर्ताओं विकास14,15में विशिष्ट प्रतिलिपि की भूमिका को समझने के लिए अनुमति देता है. क्रिकेट के अंडों को इंजेक्ट करने के बारे में कुछ सीमित विवरण पहलेप्रकाशितकिए जा चुके हैं .
यहाँ, हम जल्दी जी bimaculatus अंडे इंजेक्शन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन. इस प्रोटोकॉल प्रभावी और आसानी से विभिन्न प्रयोगशाला सेटिंग्स के लिए अनुकूलनीय है, इंजेक्शन सामग्री, और संभवतः अन्य कीड़ों के लिए. जबकि डिजाइन और जीनोमिक संशोधन और knockdown प्रयोगों को लागू करने के लिए अतिरिक्त विवरण कहीं और प्रकाशित किया गया है12,13, इन दृष्टिकोण अंततः इंजेक्शन प्रोटोकॉल यहाँ विस्तृत पर निर्भर करेगा.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluorescent dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165 FC</td>
			<td>Stereomicroscope with fluorescence</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External light source for fluorescence</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EL 6000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-300</td>
			<td>-Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry filter cube</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M205FA/M165FC</td>
			<td>Filter cube for mCherry or similar red dye will work</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>M3301R</td>
			<td>Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MMO-202ND</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Holder (Needle holder)</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>HD-21</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Tubing to connect air source to microinjector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg well stamp</td>
			<td>3D printed</td>
			<td>custom</td>
			<td>3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator or temperature controlled room</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>Temperatures of 23.5-26&#176;C are needed.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cricket food</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>cat food or fish flakes are appropriate food.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cricket wter</td>
			<td>vairous</td>
			<td></td>
			<td>Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cricket shelter</td>
			<td>arious</td>
			<td></td>
			<td>Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary tubes</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>Item no. 1B100F-4</td>
			<td>Kwik-Fil&#8482; Borosilicate Glass Capillaries, 100mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Flaming/Brown</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td>Distributed by Sutter Instrument Co.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beveller/Micro grinder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>Model EG-45/EG-400</td>
			<td>EG-400 includes a microscope head</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>Product code 229693</td>
			<td>90mm diameter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Play Sand</td>
			<td>Sandtastik Products Ltd.</td>
			<td>B003U6QLVS</td>
			<td>White play sand</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB000972</td>
			<td>Agarose GPG/LE ultrapure</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers</td>
			<td>US Kitchen Supply</td>
			<td>Model SS-C123</td>
			<td>Pore size should be between 0.5 - 1.0 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>Ref 15070-063</td>
			<td>Pen Strep</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tweezers</td>
			<td>Sipel Electronic SA</td>
			<td>P3C-STD</td>
			<td>Black Static Dissipative, 118mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filters, 25mm diameter, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>725-2545</td>
			<td>Use with 1 ml syringe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309602</td>
			<td>Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air tank (optional)</td>
			<td>Midwest Products</td>
			<td>Air Works&#174;</td>
			<td>Portable air tank</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Rhodamine dye</td>
			<td rowspan="2">Thermofisher</td>
			<td rowspan="2">D-1817</td>
			<td rowspan="2">dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL loading tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Order no. 5242 956.003</td>
			<td>epT.I.P.S. 20uL Microloader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axioskope 2 plus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X objective</td>
			<td>Ziess</td>
			<td>Plan-Apochromat 20x/0.75 M27</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMC 5400</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite&#160; software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LAS</td>
			<td>Version 4.6.2 used here</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injecting gryllus bimaculatus eggs

किसी विकासशील जीव में जीन फलन में परिवर्तन करना विभिन्न प्रकार के प्रयोगों का केन्द्र होता है। जबकि काफी शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरण पारंपरिक मॉडल प्रणालियों में विकसित किया गया है, यह जीन या दूत आरएनए (mRNA) सबसे अन्य जीवों में हेरफेर करने के लिए मुश्किल है. एक ही समय में, विकासवादी और तुलनात्मक दृष्टिकोण कई अलग अलग प्रजातियों में जीन समारोह के एक अन्वेषण पर भरोसा करते हैं, विकास और वर्तमान में आनुवंशिक रूप से पथकेतर बाहर अभिव्यक्ति जोड़ तोड़ के लिए तकनीक के अनुकूलन की आवश्यकता प्रजातियां. यह प्रोटोकॉल भ्रूण या लार्वा विकास पर दिए गए हेरफेर के प्रभाव पर परख करने के लिए क्रिकेट के अंडों में अभिकर्मकों को इंजेक्शन लगाने की एक विधि का वर्णन करता है। कैसे इकट्ठा करने के लिए और beveled सुइयों के साथ अंडे इंजेक्ट करने के लिए निर्देश वर्णित हैं. यह अपेक्षाकृत सरल तकनीक लचीला और संभावित अन्य कीड़ों के लिए अनुकूलनीय है. एक इकट्ठा और एक ही प्रयोग में अंडे के दर्जनों सुई कर सकते हैं, और बफर केवल इंजेक्शन के लिए अस्तित्व की दर अभ्यास के साथ सुधार और 80% के रूप में उच्च के रूप में किया जा सकता है. इस तकनीक औषधीय एजेंटों के इंजेक्शन सहित प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के कई प्रकार का समर्थन करेगा, इन विट्रो छाया हुआ MRNA में ब्याज के जीन व्यक्त करने के लिए, डबल फैला आरएनए (dsRNA) आरएनए हस्तक्षेप को प्राप्त करने के लिए, नियमित रूप से संकुल का उपयोग अंतराक्रमित लघु palindromic दोहराता है (CRISPR) CRISPR संबद्ध प्रोटीन के साथ संगीत कार्यक्रम में 9 (Cas9) जीनोमिक संशोधन के लिए अभिकर्मकों, और क्षणिक तत्वों क्षणिक या स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनों उत्पन्न करने के लिए.

क्रिकेट आसानी से नम सामग्री में अंडे देना, और नम रेत या गंदगी के रूप में पर्याप्त सामग्री प्रदान, उन्हें अंडे की एक बड़ी संख्या में बिछाने के लिए प्रेरित करता है. यह विशेष रूप से तब प्रभावी ह?...

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Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

इंजेक्शन Gryllus bimaculatus अंडे

यहाँ हम क्रिकेट अंडे इंजेक्ट करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं, एक तकनीक जो क्रिकेट में कई प्रयोगों में एक मूलभूत विधि के रूप में कार्य करती है, जिसमें आरएनए हस्तक्षेप और जीनोमिक हेरफेर तक ही सीमित नहीं है।

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been ...

यह तकनीक क्रिकेट के भ्रूण या लार्वा विकास परख करने के लिए डिज़ाइन किए गए प्रयोगों के लिए एक मूलभूत विधि के रूप में कार्य करती है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह लचीला है और कई प्रकार के प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों का समर्थन करेगा, जैसे आरएनए हस्तक्षेप या जीनोमिक हेरफेर का उपयोग करना। प्रक्रिया का प्रदर्शन हैडली विल्सन होर्च, प्रयोगशाला में प्रमुख अन्वेषक होगा ।इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए टपकता पानी के साथ बेवेलर के कताई ग्राइंडर विमान गीला। खींची गई सुई को बेवेलर में रखें और इसे 20 डिग्री एंगल पर बदल दें। सुई को तब तक कम करें जब तक कि यह पीसने वाली प्लेट को छू न जाए और इसे दो से तीन मिनट तक बेवेल करे।एक ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड का पालन किया गया है कि डबल स्टिक टेप पर beveled सुई रखकर bevel का आकलन करें। एक कैमरा और छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर से लैस एक यौगिक माइक्रोस्कोप के मंच पर स्लाइड रखें। 20x उद्देश्य का उपयोग करके सुई की एक छवि प्राप्त करें।इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग सुई के इंटीरियर ल्यूमेन व्यास को मापने के लिए सिर्फ beveled खोलने के लिए समीपस्थ। आठ माइक्रोमीटर से छोटे या 12 माइक्रोमीटर से बड़े खोलने के साथ किसी भी सुई को त्यागें। सबसे पहले, 1% एगर के 40 मिलीलीटर पानी में बनाएं और इसे 10 सेंटीमीटर पेट्री डिश में डालें।एक अंडे को अच्छी तरह से स्टैंप रखें जो एगर की सतह पर जमने से पहले। एक बार अगर उठे हो जाने के बाद कुओं का खुलासा करने के लिए स्टांप हटा दें। इसके बाद, 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त एचबीएस के साथ एगर उठे अच्छी तरह से प्लेट भरें।ढक्कन को डिश पर रखें, पैराफिल्म में लपेटें और इसे चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। इसके बाद, एक 35 मिलीमीटर पेट्री डिश को सफेद खेल के मैदान रेत के साथ भरें ताकि झींगुर में अंडे डालने के लिए अंडा संग्रह पकवान बनाया जा सके। अंडे की डिश को एक पेपर तौलिया स्क्वायर कट के साथ कवर करें लगभग 18 बाय 18 सेंटीमीटर तक।कागज तौलिया के माध्यम से नल के पानी से भरें। फिर, पेट्री डिश को झुकाएं और अतिरिक्त पानी को हटाने के लिए धीरे-धीरे शीर्ष को निचोड़ें। डिश के नीचे कागज तौलिया वर्ग के कोनों टक और एक उल्टे ढक्कन जो जगह में कागज तौलिया रखने में मदद मिलेगी में अंडे पकवान जगह है ।अंडे की डिश को क्रिकेट बिन में रखें और वयस्क मादाओं को एक से दो घंटे के लिए अंडे को ओविपोसिट करने की अनुमति दें। इस बीच, एगर उठे पकवान इंजेक्शन के लिए अंडे रखने की तैयारी में कमरे के तापमान को गर्म करने की अनुमति दें। जब तैयार हो, अंडे संग्रह पकवान, अब हौसले से रखी अंडे युक्त, क्रिकेट बिन से हटा दें ।कागज तौलिया निकालें और एक बीकर पर 0.5 और एक मिलीमीटर के बीच एक ताकना आकार के साथ एक छलनी जगह है। अंडे की सामग्री को धीरे से चलने वाले नल के पानी के नीचे छलनी में पकवान बिछाने को कुल्लाएं। रेत के दाने छलनी जाल के माध्यम से नीचे बीकर में गिर जाएंगे जबकि क्रिकेट के अंडे छलनी टोकरी में रहेंगे ।एक कंटेनर को रिवर्स ऑस्मोसिस पानी से भरें और इसे एक ट्रे में रखें। कंटेनर पर छलनी उलटा और पानी में अंडे उखाड़ फेंकना करने के लिए पकवान के खिलाफ नल । अंडे कंटेनर के नीचे तक डूब जाएंगे।इसके बाद, व्यास में लगभग तीन मिलीमीटर खोलने के लिए एक P1000 पिपेट टिप से टिप काटने के लिए कैंची का उपयोग करें। इस टिप को पी1000 पिपेटर पर रखें, और इसका उपयोग कंटेनर से अंडे को एगर उठे अंडे मोल्ड्स डिश में स्थानांतरित करने के लिए करें। प्लास्टिक चिमटी का उपयोग करना, एग्राजिंग कुओं में अंडे को लाइन करें।प्रत्येक अंडा एक व्यक्ति के नीचे अच्छी तरह से डूब जाएगा। पेट्री डिश को ढक्कन से तब तक ढकें जब तक कि इंजेक्शन लगाने के लिए तैयार न हो जाए। शुरू करने के लिए, अंडों के पकवान को विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे रखें और लगभग 10x के कम आवर्धन का चयन करें।20 माइक्रोलीटर लोडिंग टिप्स और एक P10 पिपेट का उपयोग करके इंजेक्शन समाधान के 1.5 माइक्रोलीटर खींचें और इंजेक्शन सुई के व्यापक अंत में लोडिंग टिप डालें। इंजेक्शन सुई में इंजेक्शन समाधान निष्कासित। इंजेक्शन आवास में सुई डालें और कस लें, यह सुनिश्चित करें कि सुई ठीक से और दृढ़ता से आवास में डाली गई है।फिर ध्यान से इंजेक्शन आवास को माइक्रोमैनीपुलेटर में डालें, सुई से न तोड़ने या घायल होने के लिए सावधान रहें। माइक्रोस्कोप के माध्यम से अंडे और सुई दोनों को देखते हुए, डिश ग्रिड के शीर्ष बाएं कोने में एक्स के पास सुई को स्थानांतरित करें। सुई को तब तक कम करें जब तक टिप डिश में एचबीएस प्लस पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन बफर समाधान में प्रवेश नहीं करती है।दृष्टि के क्षेत्र में सुई केंद्र और अंडे पकवान ले जाने ताकि सुई अंडे की तुलना में पकवान के किनारे के करीब कुछ मिलीमीटर है। इसके बाद, माइक्रोस्कोप को रोडामाइन के लिए उपयुक्त फिल्टर में सेट करें ताकि सुई में फ्लोरेसेंस का निरीक्षण किया जा सके और इसकी नोक पर ध्यान केंद्रित किया जा सके। माइक्रोइंजेक्टर पर धीरे-धीरे संतुलन घुंडी को दक्षिणावर्त चालू करें जब तक इंजेक्शन समाधान सुई से निलंबन समाधान में लीक होना शुरू नहीं हो जाता है।फिर घुंडी वापस पलटवार थोड़ा बारी जब तक डाई सिर्फ सुई से बाहर लीक बंद हो जाता है । सुई के साथ अभी भी देखने के क्षेत्र में केंद्रित है, अंडे पकवान ले जाएँ ताकि सुई अंडे के उद्देश्य से पहले इंजेक्शन किया जा रहा है। आवर्धन को लगभग 50x तक समायोजित करें ताकि एक अंडा अधिकांश दृश्य क्षेत्र भर सके।इंजेक्शन के लिए सुई को स्थिति में ले जाने के लिए अंडे के पकवान पर माइक्रोमैनीपुलेटर और किसी के हाथ दोनों का उपयोग करें। सुई को आगे बढ़ाने और इंजेक्शन के लिए पहले अंडे में टिप डालने के लिए माइक्रोमैनिपलेटर का उपयोग करें, जिससे अंडे की लंबवत अंडे के पीछे के छोर से अंडे की लंबवत लंबाई के 20 से 30% पर सुई डालना सुनिश्चित करें। इंजेक्शन पैर पेडल या माइक्रोइंजेक्टर पर इंजेक्शन बटन के साथ समाधान इंजेक्ट करें।अंडे के अंदर फ्लोरोसेंट सामग्री का एक छोटा सा बोलस एक सफल इंजेक्शन का संकेत देगा। इसके बाद, अंडे से सुई को वापस लें। यदि अंडा अनजाने में सुई के पीछे हटने पर अपनी अच्छी तरह से बाहर उठा लिया है, छोटे संदंश का उपयोग करने के लिए अंडे को वापस अच्छी तरह से धक्का जबकि सुई वापस ।इस अध्ययन में, क्रिकेट अंडे एक तकनीक है कि कई प्रयोगों में एक मूलभूत विधि के रूप में कार्य करता है, सहित, आरएनए हस्तक्षेप और जीनोमिक हेरफेर का उपयोग कर इंजेक्शन हैं । इस प्रयोग की सफलता का आकलन करने के लिए जीवित रहने की दर एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है। अधिकांश मृत अंडे को आसानी से दृष्टि से पहचाना जा सकता है क्योंकि अंडे के भीतर जर्दी और भ्रूणीय ऊतक असमान रूप से झुरमुट करना शुरू करते हैं, और अंततः अधिकांश जर्दी अंडे के एक तरफ स्थानांतरित हो जाएगी।जब चार से छह दिनों के बाद मूल्यांकन किया जाता है, तो 85% से अधिक यूनिजेनेक्टेड अंडे बच जाते हैं, जबकि प्रायोगिक अभिकर्षकों के साथ इंजेक्शन वाले अंडे में आम तौर पर कम जीवित रहने की दर होती थी। इंजेक्शन के सभी पहलुओं के लिए ही नियंत्रित, सुई पंचर सहित, डाई और बफर की शुरूआत, या वाहन या डबल फंसे आरएनए की उपस्थिति, प्रयोगात्मक हेरफेर के सही प्रभाव को समझने के लिए आवश्यक है । जिस तरह से एक इंजेक्शन के फेनोटाइपिक परिणामों का आकलन करता है वह इस बात पर निर्भर करता है कि इंजेक्शन क्या लगाया गया था।उदाहरण के लिए, विशिष्ट एमआरएनए नॉकडाउन के परिणामस्वरूप फेनोटाइपिक परिवर्तन सकल शरीर रचना विज्ञान के स्तर पर स्पष्ट हो सकते हैं। यदि दूसरी ओर एक CDNA एक G.bimaculatus actin प्रमोटर के नियंत्रण में टैग histone 2B जीन encoding क्रिकेट जीनोम में पिग्गीबैक ट्रांसपोसेस का उपयोग कर डाला जाता है, यह संभव हो जाता है के लिए फ्लूसेंस का उपयोग कर अंडे में प्रत्येक नाभिक कल्पना करने के लिए EGFP अपने टैग 2B प्रोटीन टैग । संतुलन को समायोजित करना ताकि सुई रोकना न हो, इस प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम है।आपको बाद के इंजेक्शन के बाद कई समायोजन करने की आवश्यकता हो सकती है क्योंकि जर्दी कभी-कभी सुई टिप को रोकती है। क्रिकेट एक हेमीमेटाबोलस कीट है जो ड्रोसोफिला जैसे होलोमेटाबोलस कीटों का अच्छी तरह से अध्ययन करने के लिए बेसली शाखाओं की शाखाओं है। क्रिकेट विकास का अध्ययन करने से हमें पशु साम्राज्य में विकास और विकास के बारे में अधिक समझने में मदद मिलेगी ।इस तकनीक में कुछ अभ्यास होता है। हम नियंत्रण इंजेक्शन का अभ्यास करने की सलाह देते हैं जब तक कि इंजेक्शन के चार या पांच दिन बाद जीवित रहने की दर कम से कम 80% न हो जाए

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

लवणता निर्भर रजत Nanocolloids की विषाक्तता परख Medaka अंडे का उपयोग

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

In Ovo Feeding of Commercial Broiler Eggs: An Accurate and Reproducible Method to Affect Muscle Development and Growth

In Ovo Feeding of Commercial Broiler Eggs: An Accurate and Reproducible Method to Affect Muscle Development and Growth

Ovo में वाणिज्यिक ब्रॉयलर अंडे का भोजन: मांसपेशियों के विकास और विकास को प्रभावित करने के लिए एक सटीक और पुन: प्रस्तुत करने योग्य विधि

Within the past three decades, red meat and poultry scientists focused on developing strategies and technologies to manipulate muscle development during ...

Investigating Development with Optogenetic Signaling Manipulation in Zebrafish

Optogenetic Signaling Activation in Zebrafish Embryos

Manipulating Signaling in Zebrafish Embryos to Decode Cell Fate Decisions (Video) | JoVE

ज़ेब्राफिश भ्रूण में ऑप्टोजेनेटिक सिग्नलिंग सक्रियण

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally ...

Enhancing Protein Visualization with Antibody-Mediated Live Imaging

Visualizing Low-Abundance Proteins and Post-Translational Modifications in Living Drosophila Embryos via Fluorescent Antibody Injection

Unveiling the Dynamics of Mechanical and Biochemical Signals in Animal Morphogenesis Research (Video) | JoVE

फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी इंजेक्शन के माध्यम से रहने वाले ड्रोसोफिला भ्रूण में कम बहुतायत प्रोटीन और पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों की कल्पना

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein ...