Name: injecting gryllus bimaculatus eggs
Uploaded: 2019-08-22T13:00:00
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이 프로젝트에 보고 된 연구는 기관 개발 상에 의해 지원되었다 (IDeA) 보조금 번호 P20GM10342에 따라 국립 보건원의 국립 연구소에서 HH3에, NSF 수상 번호 IOS-1257217에 CGE.

1. 하드웨어 설정 및 재료 준비
참고: 솔루션, 시약 및 장비 세부 사항에 대한 준비는 표 1 및 재료 표를 참조하십시오.
<ol><li>계란을 보고 주사 바늘을 안내 하기 위해 해부 현미경을 설정 합니다. (그림1A는 형광이 장착된 해부 현미경을 나타낸다.) 형광 능력은 유리하지만 필요하지 않습니다.</li>
	<li>주사 바늘을 제...

<ol>
	<li>Abzhanov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+there+yet?+Tracking+the+development+of+new+model+systems.">Are we there yet? Tracking the development of new model systems.</a> Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).</li><li>Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+August+Krogh+principle:+&#8220;For+many+problems+there+is+an+animal+on+which+it+can+be+most+conveniently+studied.">The August Krogh principle: &#8220;For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied.</a> Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).</li><li>Krogh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Progress+of+Physiology.">The Progress of Physiology.</a> American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).</li><li>Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cricket neurobiology and behavior. , (1989).</li><li>Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , (2017).</li><li>Misof, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenomics+resolves+the+timing+and+pattern+of+insect+evolution.">Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution.</a> Science. 346 (6210), 763-767 (2014).</li><li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+transgenic+cricket+embryos+reveals+cell+movements+consistent+with+a+syncytial+patterning+mechanism.">Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism.</a> Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).</li><li>Shinmyo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac-mediated+somatic+transformation+of+the+two-spotted+cricket,+Gryllus+bimaculatus.">piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Development, growth &amp; differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).</li><li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-transgenic+genome+modifications+in+a+hemimetabolous+insect+using+zinc-finger+and+TAL+effector+nucleases.">Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases.</a> Nature communications. 3, 1017 (2012).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).</li><li>Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+crickets+for+the+study+of+learning+and+memory:+Dopamine+receptor+Dop1+mediates+aversive+but+not+appetitive+reinforcement+in+crickets.">Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets.</a> Scientific Reports. 5, 15885 (2015).</li><li>Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+in+the+Cricket.">Protocols in the Cricket.</a> The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).</li><li>Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Editing+in+the+Cricket,+Gryllus+bimaculatus.">Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).</li><li>Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch/Delta+signalling+is+not+required+for+segment+generation+in+the+basally+branching+insect+Gryllus+bimaculatus.">Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus.</a> Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).</li><li>Miyawaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Wingless/Armadillo+signaling+in+the+posterior+sequential+segmentation+in+the+cricket,+Gryllus+bimaculatus+(Orthoptera),+as+revealed+by+RNAi+analysis.">Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis.</a> Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).</li><li>Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+live-imaging+of+embryos+in+microwell+arrays+using+a+modular+specimen+mounting+system.">High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system.</a> Biology Open. 7 (7), bio031260 (2018).</li><li>Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+is+required+for+the+generation+of+primordial+germ+cells+in+an+insect.">BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect.</a> Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).</li><li>Larson, E., Andres, J., Harrison, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+male+ejaculate+on+post-mating+prezygotic+barriers+in+field+crickets.">Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets.</a> PLOS ONE. 7 (10), e46202 (2012).</li><li>Donoughe, S., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+development+of+the+cricket+Gryllus+bimaculatus.">Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus.</a> Developmental Biology. , (2016).</li><li>Matsuoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+germ+insects+utilize+both+the+ancestral+and+derived+mode+of+Polycomb+group-mediated+epigenetic+silencing+of+Hox+genes.">Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes.</a> Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).</li><li>Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heads+and+tails:+Evolution+of+antero-posterior+patterning+in+insects.">Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects.</a> Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).</li><li>Bacon, J., Strausfeld, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonrandom+resolution+of+neuron+arrangements.">Nonrandom resolution of neuron arrangements.</a> Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).</li></ol>

이 기술의 두 가지 주요 과제는 최적의 바늘 크기와 생존력의 관련 문제입니다. 작은 바늘은 생존을 향상하지만, 좁은 루멘을 가진 바늘은 직장에서 모세 혈관의 더 큰 정도를 가지고, 이는 노른자가 막힘을 일으키는 바늘로 이동 할 가능성이 더 높습니다. 가장 좋은 경우에, 막힘은 단순히 다른 계란을 주입하거나 위에서 설명한 대로 바늘을 치워서 지울 수 있습니다. 노른자가 바늘에서 밀려나올...

유기체에서 게놈을 수정하거나 유전자 발현에 영향을 미치는 능력은 기능적 인과관계를 테스트하는 많은 유형의 실험설계의 기초가 된다. 또한 전통적인 유전 실험실 동물 모델 시스템(예: Mus musculus,Danio) 외부의 유기체에서 게놈 및 비게놈 변형 기술을 사용할 수 있는 비교 및 진화학적 관련 작업에도 중요합니다. rerio, 드로필라 멜라노가스터,그리고 케노하브디티스 예쁜꼬마선충). 생물다양성1을 이해하려는 욕구이든, 크로의 원리를 고수하는 것이든, 모든 생물학적 질문에 대해 그 해결책2,3,게놈을 수정할 수 있는 능력에 가장 적합한 유기체가 있다는 것입니다. 현대 실험 설계에 필수적인 유전자 발현에 영향을 미칩니다.
크리켓 그릴루스 바이마쿨라투스는 신흥 모델 시스템입니다. 신경과 실험 4에서 지난 세기동안 사용, 지난 2 년 은 특히이 유기체의 진화와 개발에 초점을 맞춘 크리켓에 대한 증가 된 실험적 관심을 목격했다5. 크리켓은 D. 멜라노가스터와 트리볼륨 카스타뇌6과같은 잘 연구된 홀로메타볼루스 곤충에 기초로 분기하는 헤미메타볼루블 곤충이다. 진화 나무에 그것의 유용한 위치 때문에, 과학자들은 이 곤충에 있는 현대, 정교한 실험적인 질문을 하는 것에 흥미, G. bimaculatus에있는 사용을 위한 분자 공구 적응에 있는 증가로 이끌어 냈습니다.
크리켓 계란에 분자 시약의 주사는 배아에서 유전자 발현의 비 게놈 조작뿐만 아니라 게놈 수정 실험에 사용할 수 있습니다. 예를 들어, eGFP 삽입을 운반하는 형질전환 G. 바이마쿨라투스는 트랜스포사제 피기박7,8을사용하여 생성되었다. 연구자들은 아연 핑거 뉴클레아제(ZFNs) 및 전사 활성제(TAL) 이펙터 뉴클레아제(TALENs)를 사용하여 특정 게놈 영역에서 이중 가닥 의 분리를 도입하는 녹아웃 G. 바이마쿨라투스를 성공적으로 생성하였다9. ZFN과 TALENs는 4대 모델 시스템을 넘어서는 동물에 대한 사이트별 타겟팅을 허용하지만, 이러한 시약은 사용하기 쉽고 효율적이며 매우 유연한CRISPR/Cas9 시스템을 통해 빠르게 능가되었습니다 10. CRISPR은 G. bimaculatus에서 녹아웃11뿐만 아니라 노크 인 라인12,13 게놈 수정 이외에, dsRNA는 개발에 mRNA 발현을 노크하기 위해 계란에 주입 될 수있다 배아, 조사자가 개발 전반에 걸쳐 특정 성적 증명서의 역할을 이해할 수 있도록14,15. 크리켓 계란을 주입하는 방법에 대한 몇 가지 제한된 세부 사항은 이전에 게시 되었습니다12.
여기에서, 우리는 초기 G. bimaculatus 계란을 주입하기위한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 효과적이고 다양한 실험실 설정, 사출 재료 및 기타 곤충에 쉽게 적응할 수 있습니다. 게놈 수정 및 녹다운 실험을 설계하고 구현하기 위한 추가 세부 사항이12,13다른 곳에 게시되었지만, 이러한 접근법은 궁극적으로 여기에 상세한 주입 프로토콜에 의존할 것이다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluorescent dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165 FC</td>
			<td>Stereomicroscope with fluorescence</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External light source for fluorescence</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EL 6000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-300</td>
			<td>-Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry filter cube</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M205FA/M165FC</td>
			<td>Filter cube for mCherry or similar red dye will work</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>M3301R</td>
			<td>Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MMO-202ND</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Holder (Needle holder)</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>HD-21</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Tubing to connect air source to microinjector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg well stamp</td>
			<td>3D printed</td>
			<td>custom</td>
			<td>3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator or temperature controlled room</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>Temperatures of 23.5-26&#176;C are needed.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cricket food</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>cat food or fish flakes are appropriate food.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cricket wter</td>
			<td>vairous</td>
			<td></td>
			<td>Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cricket shelter</td>
			<td>arious</td>
			<td></td>
			<td>Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary tubes</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>Item no. 1B100F-4</td>
			<td>Kwik-Fil&#8482; Borosilicate Glass Capillaries, 100mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Flaming/Brown</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td>Distributed by Sutter Instrument Co.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beveller/Micro grinder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>Model EG-45/EG-400</td>
			<td>EG-400 includes a microscope head</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>Product code 229693</td>
			<td>90mm diameter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Play Sand</td>
			<td>Sandtastik Products Ltd.</td>
			<td>B003U6QLVS</td>
			<td>White play sand</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB000972</td>
			<td>Agarose GPG/LE ultrapure</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers</td>
			<td>US Kitchen Supply</td>
			<td>Model SS-C123</td>
			<td>Pore size should be between 0.5 - 1.0 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>Ref 15070-063</td>
			<td>Pen Strep</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tweezers</td>
			<td>Sipel Electronic SA</td>
			<td>P3C-STD</td>
			<td>Black Static Dissipative, 118mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filters, 25mm diameter, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>725-2545</td>
			<td>Use with 1 ml syringe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309602</td>
			<td>Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air tank (optional)</td>
			<td>Midwest Products</td>
			<td>Air Works&#174;</td>
			<td>Portable air tank</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Rhodamine dye</td>
			<td rowspan="2">Thermofisher</td>
			<td rowspan="2">D-1817</td>
			<td rowspan="2">dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL loading tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Order no. 5242 956.003</td>
			<td>epT.I.P.S. 20uL Microloader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axioskope 2 plus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X objective</td>
			<td>Ziess</td>
			<td>Plan-Apochromat 20x/0.75 M27</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMC 5400</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite&#160; software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LAS</td>
			<td>Version 4.6.2 used here</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injecting gryllus bimaculatus eggs

개발 유기체에서 유전자 기능을 변경하는 것은 다양한 종류의 실험의 중심입니다. 엄청나게 강력한 유전 공구가 전통적인 모형 시스템에서 개발되는 동안, 대부분의 그밖 유기체에 있는 유전자 또는 메신저 RNA (mRNA)를 조작하는 것은 어렵습니다. 동시에, 진화및 비교 접근법은 많은 다른 종에 있는 유전자 기능의 탐사에 의존합니다, 현재 유전으로 견인할 수 있는 외부 표현을 조작하기 위한 기술의 발달 그리고 적응을 필요로 합니다 종. 이 프로토콜은 배아 또는 애벌레 발달에 주어진 조작의 효력을 분석하기 위하여 크리켓 계란으로 시약을 주입하는 방법을 기술합니다. 벨바늘로 계란을 수집하고 주입하는 방법에 대한 지침이 설명되어 있습니다. 이 비교적 간단한 기술은 유연하고 잠재적으로 다른 곤충에 적응할 수 있습니다. 하나는 수집하고 하나의 실험에 계란 수십 주입 할 수 있습니다, 버퍼 전용 주사에 대한 생존율은 연습으로 개선하고 80 %로 높을 수 있습니다. 이 기술은 약리학 에이전트의 주입을 포함하여 실험적인 접근의 몇몇 모형을 지원할 것입니다, 관심있는 유전자를 표현하기 위하여 시험관 외에서 덮인 mRNA, RNA 간섭을 달성하기 위하여 이중 좌초된 RNA (dsRNA), 군집된 정규의 사용 CRISPR 관련 단백질 9(Cas9) 시약과 함께 협착한 짧은 팔린드로믹 반복(CRISPR) 및 과도 또는 안정적인 형질전환 라인을 생성하기 위한 트랜스포저 블론트.

크리켓은 촉촉한 재료에 알을 쉽게 낳고, 습한 모래 나 먼지와 같은 적절한 재료를 제공하면 많은 수의 알을 낳도록 유도합니다. 이것은 크리켓이 깨끗한 모래에 놓인 8-10 h. 계란을 먼저 알 을 박탈하는 경우에 특히 효과적이다 쉽게 분리, 수집 (그림1B)주입을위한 사용자 정의 설계 계란 우물에 배치 (그림1C). 해부 현미경, 마이?...

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Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

그릴루스 바이마쿨라투스 계란 주입

여기에서 우리는 크리켓 계란을 주입하는 프로토콜을 제시, 크리켓의 많은 실험에서 기초 방법 역할을하는 기술, 포함하되 이에 국한되지 않음, RNA 간섭 및 게놈 조작.

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been ...

이 기술은 크리켓의 배아 또는 애벌레 발달을 분석하도록 설계된 실험을위한 기본 방법 역할을합니다. 이 기술의 주요 장점은 유연하고 RNA 간섭 또는 게놈 조작을 활용하는 것과 같은 여러 유형의 실험 적 접근법을 지원할 것이라는 것입니다. 절차를 보여주는 것은 해들리 윌슨 호치, 실험실의 주요 조사자 입니다.이 절차를 시작하려면 떨어지는 물로 베클러의 회전 분쇄기 평면을 적시다. 끌어온 바늘을 베벨러에 넣고 20도 각도로 바뀝니다. 바늘을 내리고 연삭 판에 닿을 때까지 2~3분 동안 구부립니다.유리 현미경 슬라이드에 부착 된 이중 스틱 테이프에 beveled 바늘을 배치하여 bevel을 평가합니다. 카메라 및 이미지 수집 소프트웨어가 장착된 복합 현미경의 스테이지에 슬라이드를 놓습니다. 20배 의 목표를 사용하여 바늘의 이미지를 획득한다.이미징 소프트웨어를 사용하여 바늘의 내부 루멘 직경을 측정하면 경솔한 개구부까지 의 근위만 을 측정합니다. 8 마이크로미터 보다 작은 개구부 또는 12 마이크로미터보다 큰 바늘을 버리십시오. 먼저, 물에 1%의 아가로즈 40밀리리터를 만들어 10센티미터 페트리 접시에 붓습니다.아가로즈 표면에 달걀 우물 스탬프를 놓으면 고화됩니다. 아가로즈가 고화되면 스탬프를 제거하여 우물을 드러냅니다. 다음으로, 아가로즈웰 플레이트를 1%페니실린 연쇄상 구균증을 함유한 HBS로 채우는 다.뚜껑을 접시에 놓고 파라필름에 싸서 섭씨 4도에 보관하십시오. 그 후, 35mm 페트리 접시에 흰색 놀이터 모래를 채우고 크리켓이 계란을 낳을 수있는 계란 컬렉션 요리를 만듭니다. 달걀 접시를 종이 타월 사각형으로 약 18 x 18센티미터로 자른 다.종이 타월을 통해 수돗물로 채웁니다. 그런 다음 페트리 접시를 기울이고 윗쪽을 부드럽게 짜서 여분의 물을 제거합니다. 종이 타월 광장의 모서리를 접시 아래에 넣고 계란 접시를 거꾸로 된 뚜껑에 놓아 종이 타월을 제자리에 두십시오.달걀 접시를 크리켓 쓰레기통에 넣고 성인 여성이 1 ~2 시간 동안 계란을 배란할 수 있도록하십시오. 한편, 아가로즈 접시를 실온으로 따뜻하게 하여 주사를 위해 계란을 들고 있는 것을 준비하십시오. 준비가 되면, 이제 크리켓 쓰레기통에서 갓 낳은 달걀을 함유한 달걀 수집 접시를 제거하십시오.종이 타월을 제거하고 비커 위에 0.5~1밀리미터 크기의 모공 크기로 여과기를 놓습니다. 달걀 누워 접시의 내용을 부드럽게 흐르는 수돗물 아래 여과기에 헹구십시오. 모래 곡물은 스트레이너 메쉬를 통해 아래 비커에 떨어지고 크리켓 계란은 스트레이너 바구니에 남아 있습니다.용기를 역삼투물로 채우고 트레이에 놓습니다. 용기 위에 여과기를 뒤집어 접시에 대고 달걀을 물에 빼넣습니다. 계란은 용기의 바닥에 가라 앉습니다.다음으로 가위를 사용하여 P1000 파이펫 팁에서 팁을 잘라 직경이 약 3밀리미터 들어 오도록 합니다. 이 팁을 P1000 파이프터에 놓고 용기에서 아가로즈 달걀 금형 접시로 계란을 옮기는 데 사용합니다. 플라스틱 핀셋을 사용하여 아가로즈 우물에 계란을 정렬합니다.각 계란은 개인의 바닥에 잘 가라 앉습니다. 페트리 접시를 뚜껑으로 덮어 주입할 준비가 될 때까지 덮습니다. 시작하려면, 해부 현미경 아래에 계란의 접시를 배치하고 약 10 배율의 낮은 배율을 선택합니다.20 마이크로리터 로딩 팁과 P10 파이펫을 사용하여 1.5 마이크로리터의 사출 용액을 끌어내고 로딩 팁을 사출 바늘의 넓은 끝에 삽입합니다. 주입 용액을 주입 바늘로 추방하십시오. 바늘을 주입 하우징에 삽입하고 조여서 바늘이 제대로 되어 하우징에 단단히 삽입되도록 합니다.그런 다음 조심스럽게 주입 하우징을 미세 조작기에 삽입하여 바늘에 의해 파손되거나 다치지 않도록 주의하십시오. 현미경을 통해 계란과 바늘을 모두 보는 동안, 접시 그리드의 왼쪽 상단 모서리에 있는 X 근처 바늘을 이동합니다. 팁이 HBS에 들어갈 때까지 바늘을 낮추고 페니실린 연쇄절제술을 완화한 용액을 접시에 넣습니다.시현의 바늘을 중앙에 두고 달걀 접시를 움직여 바늘이 계란보다 접시 가장자리에 몇 밀리미터 더 가깝습니다. 이 후, 로다민에 적합한 필터로 현미경을 설정하여 바늘의 형광을 관찰하고 팁에 집중하십시오. 마이크로인젝터에서 주입 용액이 바늘에서 서스펜션 용액으로 누출되기 시작할 때까지 천천히 균형 노브를 시계 방향으로 돌립니다.그런 다음 염료가 바늘에서 누출되는 것을 멈출 때까지 노브를 시계 반대 방향으로 약간 돌려보세요. 바늘이 여전히 시야에 중심을 두고 있는 상황에서 계란 접시를 움직여 바늘이 먼저 주입되는 계란을 겨냥하도록 합니다. 배율을 약 50배로 조정하여 단일 계란이 대부분의 시야를 채웁니다.마이크로 조작기와 달걀 접시에 손을 모두 사용하여 바늘을 주사의 위치로 이동시킵니다. 마이크로 조작기를 사용하여 바늘을 전진시키고 주입할 첫 번째 계란에 팁을 삽입하여 계란의 뒤쪽 끝에서 계란 길이의 20~30%에 바늘을 삽입하여 계란의 긴 축에 수직으로 삽입하십시오. 주입 발 페달 또는 마이크로 인젝터의 주입 버튼중 하나와 솔루션을 주입.계란 내부형 물질의 작은 bolus 성공적인 주사를 나타냅니다. 그 후, 계란에서 바늘을 철회. 바늘을 철회할 때 계란이 의도치 않게 우물에서 들어 올린 경우 작은 집게를 사용하여 바늘을 철회하면서 계란을 우물로 밀어 넣습니다.이 연구에서, 크리켓 계란은 RNA 간섭 및 게놈 조작을 포함하되 이에 국한되지 않는 많은 실험에서 기초적인 방법으로 작용하는 기술을 사용하여 주입됩니다. 생존율은 이 실험의 성공을 평가하기 위한 중요한 매개변수 중 하나입니다. 대부분의 죽은 계란은 쉽게 계란 내의 노른자와 배아 조직이 고르지 뭉치기 시작하고, 결국 노른자의 대부분이 계란의 한쪽으로 이동하기 때문에 시력에 의해 쉽게 식별 될 수 있습니다.4~6일 후에 평가될 때, 주입되지 않은 계란의 85% 이상은 살아남았고, 실험용 시약으로 주입된 계란은 일반적으로 더 낮은 생존율을 보였습니다. 주사 자체의 모든 측면에 대한 제어, 바늘 펑크를 포함, 염료 및 버퍼의 도입, 또는 차량 또는 이중 좌초 RNA의 존재, 실험 조작 시도의 진정한 효과를 이해하기 위해 요구된다. 주사의 현상 결과를 평가하는 방법은 주입된 것에 달려 있습니다.예를 들어, 특정 mRNA 녹다운의 결과로 표형 변화는 총 해부학 수준에서 명백할 수 있다. 한편, EGFP를 코딩하는 cDNA가 G.bimaculatus 액틴 프로모터의 제어하에 히스톤 2B 유전자를 태그한 경우 피기백 트랜스포사제를 사용하여 크리켓 게놈에 삽입되며, EGFP 태그히스트 2B 단백질을 자극하기 위해 형광을 사용하여 계란내각 핵을 시각화할 수 있게 된다. 바늘이 막히지 않도록 균형을 조정하는 것은이 절차에서 중요한 단계입니다.노른자가 때때로 바늘 팁을 막히기 때문에 후속 주사 후 몇 가지 조정을해야 할 수도 있습니다. 크리켓은 드로소필라와 같은 홀로메타볼루곤충을 잘 연구하기 위해 분주하게 가지는 간질 곤충입니다. 크리켓 개발을 공부하는 것은 우리가 동물의 왕국을 가로 질러 진화와 개발에 대한 자세한 이해도움이 될 것입니다.이 기술은 몇 가지 연습을 합니다. 주사 후 4~5일 생존율이 최소 80%가 될 때까지 제어 주사를 연습하는 것이 좋습니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

메다카 계란을 사용하여 실버 Nanocolloids의 염도에 의존하는 독성 분석

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

연구

발생학

In Ovo Feeding of Commercial Broiler Eggs: An Accurate and Reproducible Method to Affect Muscle Development and Growth

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오보에서 상업용 육계 달걀 먹이기 : 근육 발달과 성장에 영향을 미치는 정확하고 재현 가능한 방법

Within the past three decades, red meat and poultry scientists focused on developing strategies and technologies to manipulate muscle development during ...

Investigating Development with Optogenetic Signaling Manipulation in Zebrafish

Optogenetic Signaling Activation in Zebrafish Embryos

Manipulating Signaling in Zebrafish Embryos to Decode Cell Fate Decisions (Video) | JoVE

제브라피시 배아의 광유전학적 신호전달 활성화

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally ...

Enhancing Protein Visualization with Antibody-Mediated Live Imaging

Visualizing Low-Abundance Proteins and Post-Translational Modifications in Living Drosophila Embryos via Fluorescent Antibody Injection

Unveiling the Dynamics of Mechanical and Biochemical Signals in Animal Morphogenesis Research (Video) | JoVE

형광 항체 주입을 통한 살아있는 초파리 배아의 저농도 단백질 및 번역 후 변형 시각화

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein ...