Name: injecting gryllus bimaculatus eggs
Uploaded: 2019-08-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Injecting Gryllus bimaculatus Eggs at JoVE.com

Forskning rapportert i dette prosjektet ble støttet av en institusjonell utvikling Award (IDeA) fra National Institute of General Medical Sciences i National Institutes of Health under Grant nummer P20GM10342 til HH3, og av NSF Award nummer IOS-1257217 til CGE.

1. hardware oppsett og utarbeidelse av materialer
Merk: Vennligst se tabell 1 og tabell over materialer for utarbeidelse av løsninger, reagens og utstyrs detaljer.
<ol><li>Sett opp et dissekere mikroskop for å se egg og veilede injeksjonsnålen. (Figur 1a viser et dissekere mikroskop utstyrt med fluorescens.) Fluorescens evne er fordelaktig, men ikke nødvendig.</li>
	<li>Plasser en 3-akse-micromanipulator for...

<ol>
	<li>Abzhanov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+there+yet?+Tracking+the+development+of+new+model+systems.">Are we there yet? Tracking the development of new model systems.</a> Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).</li><li>Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+August+Krogh+principle:+&#8220;For+many+problems+there+is+an+animal+on+which+it+can+be+most+conveniently+studied.">The August Krogh principle: &#8220;For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied.</a> Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).</li><li>Krogh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Progress+of+Physiology.">The Progress of Physiology.</a> American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).</li><li>Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cricket neurobiology and behavior. , (1989).</li><li>Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , (2017).</li><li>Misof, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenomics+resolves+the+timing+and+pattern+of+insect+evolution.">Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution.</a> Science. 346 (6210), 763-767 (2014).</li><li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+transgenic+cricket+embryos+reveals+cell+movements+consistent+with+a+syncytial+patterning+mechanism.">Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism.</a> Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).</li><li>Shinmyo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac-mediated+somatic+transformation+of+the+two-spotted+cricket,+Gryllus+bimaculatus.">piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Development, growth &amp; differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).</li><li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-transgenic+genome+modifications+in+a+hemimetabolous+insect+using+zinc-finger+and+TAL+effector+nucleases.">Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases.</a> Nature communications. 3, 1017 (2012).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).</li><li>Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+crickets+for+the+study+of+learning+and+memory:+Dopamine+receptor+Dop1+mediates+aversive+but+not+appetitive+reinforcement+in+crickets.">Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets.</a> Scientific Reports. 5, 15885 (2015).</li><li>Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+in+the+Cricket.">Protocols in the Cricket.</a> The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).</li><li>Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Editing+in+the+Cricket,+Gryllus+bimaculatus.">Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).</li><li>Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch/Delta+signalling+is+not+required+for+segment+generation+in+the+basally+branching+insect+Gryllus+bimaculatus.">Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus.</a> Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).</li><li>Miyawaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Wingless/Armadillo+signaling+in+the+posterior+sequential+segmentation+in+the+cricket,+Gryllus+bimaculatus+(Orthoptera),+as+revealed+by+RNAi+analysis.">Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis.</a> Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).</li><li>Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+live-imaging+of+embryos+in+microwell+arrays+using+a+modular+specimen+mounting+system.">High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system.</a> Biology Open. 7 (7), bio031260 (2018).</li><li>Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+is+required+for+the+generation+of+primordial+germ+cells+in+an+insect.">BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect.</a> Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).</li><li>Larson, E., Andres, J., Harrison, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+male+ejaculate+on+post-mating+prezygotic+barriers+in+field+crickets.">Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets.</a> PLOS ONE. 7 (10), e46202 (2012).</li><li>Donoughe, S., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+development+of+the+cricket+Gryllus+bimaculatus.">Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus.</a> Developmental Biology. , (2016).</li><li>Matsuoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+germ+insects+utilize+both+the+ancestral+and+derived+mode+of+Polycomb+group-mediated+epigenetic+silencing+of+Hox+genes.">Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes.</a> Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).</li><li>Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heads+and+tails:+Evolution+of+antero-posterior+patterning+in+insects.">Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects.</a> Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).</li><li>Bacon, J., Strausfeld, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonrandom+resolution+of+neuron+arrangements.">Nonrandom resolution of neuron arrangements.</a> Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).</li></ol>

De to viktigste utfordringene med denne teknikken er de relaterte problemstillingene av optimal nål størrelse og overlevelsesevne. Selv om mindre nåler bedre overlevelsesevne, nåler med smalere lumen har en større grad av kapillær krefter på jobben, noe som gjør det mer sannsynlig at eggeplomme vil flytte inn i nålen forårsaker den til å tette. I beste fall kan blokkeringer tømmes ved å injisere et annet egg eller ved å fjerne nålen som beskrevet ovenfor. Man kan også forsøke å øke balanse trykket på ...

Evnen å endre det Genova eller innvirkningen gen gjengivelsen inne organisere er grunnlaget for planen av mange typer av eksperimenter tester funksjonell årsakssammenheng. Det er også kritisk for det komparative og evolutionarily arbeidet som genomisk og ikke-genomisk modifikasjons teknikker er tilgjengelig i organismer utenfor tradisjonelle genetiske laboratoriedyr modellsystemer (f. eks mus laboratoriemusmusculus, Danio rerio, Drosophila melanogaster, og Caenorhabditis elegans). Enten det er et ønske om å forstå organismal mangfold1 eller ens overholdelse av Krogh ' s prinsipp, at for alle biologiske spørsmål er det en organisme som er best egnet til løsningen2,3, evnen til å modifisere genomer eller påvirke genuttrykket er essensielt for moderne eksperimentell design.
The cricket Gryllus bimaculatus er en ny modell system. Brukt for forrige århundre i neuroethology eksperimenter4, de siste to ti årene har vært vitne til en økt eksperimentell interesse i cricket, spesielt fokusert på utviklingen og utviklingen av denne organismen5. The cricket er et hemimetabolous insekt som grener basally til godt studert holometabolous insekter, slik som D. melanogaster og Tribolium castaneum6. På grunn av sin nyttige posisjon på den evolusjonære treet, forskere er interessert i å spørre moderne, sofistikerte eksperimentelle spørsmål i dette insekt, som har ført til en økende interesse for å tilpasse molekylære verktøy for bruk i G. bimaculatus.
Injeksjoner av molekylære reagenser i cricket egg kan brukes til genomisk modifikasjon eksperimenter så vel som ikke-genomisk manipulasjoner av genuttrykk i embryo. For eksempel er transgene G. bimaculatus bærer eGFP innsettinger opprettet ved hjelp av transposase piggyBac7,8. Etterforskerne har opprettet knockout G. bimaculatus bruke sink-finger Nukleaser (zfner) og transkripsjon aktivator-lignende (TAL) effektor Nukleaser (TALENs) å innføre dobbel-strandet pauser i bestemte genomisk regioner9. Selv om Zfner og TALENs tillater områdespesifikk målretting i dyr utover de fire store modell systemene, har disse reagensene raskt blitt overgått av CRISPR/Cas9-systemet, noe som er enklere å bruke, mer effektivt og svært fleksibelt10. CRISPR har vært brukt i G. bimaculatus å produsere Knock-Out11 samt knock-in linjer12,13 i tillegg til genomisk modifikasjon, dsRNA kan injiseres i egg for å slå ned mRNA uttrykk i utviklingsland embryo, slik at etterforskerne å forstå rollen til bestemte transkripsjoner gjennom utvikling14,15. Noen begrensede detaljer om hvordan å injisere cricket egg har blitt publisert tidligere12.
Her beskriver vi en detaljert protokoll for injisering av tidlige G. bimaculatus egg. Denne protokollen er effektiv og lett tilpasses ulike laboratorie innstillinger, injeksjon materialer, og muligens til andre insekter. Mens ytterligere detaljer for å designe og implementere genomisk modifikasjon og knockdown eksperimenter har blitt publisert andre steder12,13, vil disse tilnærmingene til slutt stole på injeksjon protokollen detaljert her.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluorescent dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165 FC</td>
			<td>Stereomicroscope with fluorescence</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External light source for fluorescence</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EL 6000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-300</td>
			<td>-Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry filter cube</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M205FA/M165FC</td>
			<td>Filter cube for mCherry or similar red dye will work</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>M3301R</td>
			<td>Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MMO-202ND</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Holder (Needle holder)</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>HD-21</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Tubing to connect air source to microinjector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg well stamp</td>
			<td>3D printed</td>
			<td>custom</td>
			<td>3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator or temperature controlled room</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>Temperatures of 23.5-26&#176;C are needed.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cricket food</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>cat food or fish flakes are appropriate food.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cricket wter</td>
			<td>vairous</td>
			<td></td>
			<td>Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cricket shelter</td>
			<td>arious</td>
			<td></td>
			<td>Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary tubes</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>Item no. 1B100F-4</td>
			<td>Kwik-Fil&#8482; Borosilicate Glass Capillaries, 100mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Flaming/Brown</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td>Distributed by Sutter Instrument Co.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beveller/Micro grinder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>Model EG-45/EG-400</td>
			<td>EG-400 includes a microscope head</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>Product code 229693</td>
			<td>90mm diameter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Play Sand</td>
			<td>Sandtastik Products Ltd.</td>
			<td>B003U6QLVS</td>
			<td>White play sand</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB000972</td>
			<td>Agarose GPG/LE ultrapure</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers</td>
			<td>US Kitchen Supply</td>
			<td>Model SS-C123</td>
			<td>Pore size should be between 0.5 - 1.0 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>Ref 15070-063</td>
			<td>Pen Strep</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tweezers</td>
			<td>Sipel Electronic SA</td>
			<td>P3C-STD</td>
			<td>Black Static Dissipative, 118mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filters, 25mm diameter, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>725-2545</td>
			<td>Use with 1 ml syringe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309602</td>
			<td>Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air tank (optional)</td>
			<td>Midwest Products</td>
			<td>Air Works&#174;</td>
			<td>Portable air tank</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Rhodamine dye</td>
			<td rowspan="2">Thermofisher</td>
			<td rowspan="2">D-1817</td>
			<td rowspan="2">dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL loading tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Order no. 5242 956.003</td>
			<td>epT.I.P.S. 20uL Microloader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axioskope 2 plus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X objective</td>
			<td>Ziess</td>
			<td>Plan-Apochromat 20x/0.75 M27</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMC 5400</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite&#160; software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LAS</td>
			<td>Version 4.6.2 used here</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injecting gryllus bimaculatus eggs

Endring av gen funksjon i en utvikler organisme er sentral for ulike typer eksperimenter. Mens enormt kraftige genetiske verktøy har blitt utviklet i tradisjonelle modellsystemer, er det vanskelig å manipulere gener eller Messenger RNA (mRNA) i de fleste andre organismer. Samtidig, evolusjonære og komparative tilnærminger stole på en utforskning av gen funksjon i mange forskjellige arter, nødvendiggjør utvikling og tilpasning av teknikker for å manipulere uttrykk utenfor for tiden genetisk medgjørlig Arter. Denne protokollen beskriver en metode for å injisere reagenser i cricket egg til analysen virkningene av en gitt manipulasjon på embryonale eller larvestadiet utvikling. Instruksjoner for hvordan du samler inn og injiserer egg med skrå nåler er beskrevet. Denne relativt enkle teknikken er fleksibel og potensielt kan tilpasses andre insekter. Man kan samle og injisere dusinvis av egg i et enkelt eksperiment, og overlevelses rater for buffer bare injeksjoner bedre med praksis og kan være så høyt som 80%. Denne teknikken vil støtte flere typer eksperimentelle tilnærminger inkludert injeksjon av farmakologiske midler, in vitro avkortet mRNA å uttrykke gener av interesse, dobbel-strandet RNA (dsRNA) for å oppnå RNA interferens, bruk av gruppert regelmessig oppdelt korte palindromic repetisjoner (CRISPR) i samspill med CRISPR-assosiert protein 9 (Cas9) reagenser for genomisk modifikasjon, og transposable elementer for å generere forbigående eller stabile transgene Lines.

Gresshopper lett legge egg i fuktig materiale, og gi tilstrekkelig materiale, for eksempel fuktig sand eller skitt, induserer dem å legge et stort antall egg. Dette er spesielt effektivt hvis gresshopper først er fratatt egg-legging materiale for 8-10 h. egg lagt i ren sand kan lett skilles, samlet (figur 1B) og plasseres i spesialdesignede egg brønner for injeksjon (figur 1C). Et dissekere mikroskop, en microinjector og en mi...

Watch this Scientific Journal Video about Injecting Gryllus bimaculatus Eggs at JoVE.com

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Sprøytebruk Gryllus bimaculatus egg

Her presenterer vi en protokoll for å injisere cricket egg, en teknikk som fungerer som en grunnleggende metode i mange eksperimenter i cricket, inkludert, men ikke begrenset til, RNA forstyrrelser og genomisk manipulasjon.

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been ...

Denne teknikken fungerer som en grunnleggende metode for eksperimenter designet for å analysere den embryonale eller larve utviklingen av cricket. Den største fordelen med denne teknikken er at den er fleksibel og vil støtte flere typer eksperimentelle tilnærminger, for eksempel de som bruker RNA-interferens eller genomisk manipulasjon. Å demonstrere prosedyren vil være Hadley Wilson Horch, hovedetterforskeren i laboratoriet.For å begynne denne prosedyren våt den roterende jekselplan av beveleren med dryppende vann. Plasser den trukket nålen i beveleren og vri den til en 20 graders vinkel. Senk nålen til den bare berører slipeplaten og skrår den i to til tre minutter.Vurder skråkanten ved å plassere skrånende nål på dobbeltpinnetape som har blitt festet til et glassmikroskopsklie. Plasser lysbildet på scenen av et sammensatt mikroskop utstyrt med et kamera og bildeoppkjøpsprogramvare. Få et bilde av nålen ved hjelp av et 20x mål.Bruk bildeprogramvaren til å måle den indre lumendiameteren på nålen bare proksimalt til skrååpningen. Kast kanyler med en åpning mindre enn åtte mikrometer eller større enn 12 mikrometer. Først lage 40 milliliter av 1% agarose i vann og hell den i en 10 centimeter Petri skål.Plasser et egg godt stempel på overflaten av agarose før det stivner. Når agarose er størknet, fjern stempelet for å avsløre brønnene. Deretter fyller du den agarose brønnplaten med HBS som inneholder 1% penicillin streptomycin.Legg lokket på parabolen, pakk det i Parafilm og lagre det på fire grader Celsius. Etter dette fyller du en 35 millimeter petriskål med hvit lekeplass sand for å lage en eggsamlingsrett for crickets å legge egg i. Dekk eggefatet med et papirhåndkle firkantet kutt til ca 18 med 18 centimeter.Fyll med vann fra springen gjennom papirhåndkleet. Deretter vipper petriskålen og klemmer forsiktig toppen for å fjerne overflødig vann. Brett hjørnene på papirhåndkleplassen under fatet og legg eggfatet i et omvendt lokk som vil bidra til å holde papirhåndkleet på plass.Legg eggefatet i cricketbeholderen og la de voksne hunnene oviposit eggene i en til to timer. I mellomtiden, la agarose parabolen varme til romtemperatur som forberedelse for å holde eggene til injeksjon. Når du er klar, fjern eggoppsamlingsfatet, som nå inneholder nylagte egg, fra cricketbeholderen.Fjern papirhåndkleet og legg en sil med porestørrelse mellom 0, 5 og en millimeter over et beger. Skyll innholdet i egget legging parabolen i silen under forsiktig rennende vann fra springen. Sandkornene vil falle gjennom silnettet inn i begeret nedenfor mens cricketeggene forblir i silkurven.Fyll en beholder med omvendt osmosevann og legg den i et brett. Inverter silen over beholderen og bank den mot parabolen for å løsne eggene i vannet. Eggene vil synke til bunnen av beholderen.Deretter bruker du saks til å kutte spissen av en P1000 pipettespiss for å lage en åpning omtrent tre millimeter i diameter. Legg dette tipset på en P1000 pipetter, og bruk den til å overføre eggene fra beholderen til agarose eggformer parabolen. Bruk plast pinsett, linje opp eggene i agarose brønner.Hvert egg vil synke til bunnen av en individuell brønn. Dekk petriskålen med et lokk til du er klar til å injisere. For å begynne, legg eggfatet under disseksjonsmikroskopet og velg en lav forstørrelse på rundt 10x.Trekk opp 1,5 mikroliter injeksjonsvæsker med 20 mikroliters lastespisser og en P10-pipette og sett lastespissen inn i den brede enden av injeksjonsnålen. Utvis injeksjonsoppløsningen i injeksjonsnålen. Sett nålen inn i injeksjonshuset og stram, og pass på at nålen er riktig og godt satt inn i huset.Sett deretter injeksjonshuset forsiktig inn i mikromanipulatoren, vær forsiktig så du ikke bryter eller blir skadet av nålen. Mens du ser på både egg og nål gjennom mikroskopet, flytt nålen nær X i øverste venstre hjørne av parabolgitteret. Senk nålen til spissen kommer inn i HBS pluss penicillin streptomycin bufret oppløsning i parabolen.Sentrer nålen i synsfeltet og flytt eggefatet slik at nålen er noen få millimeter nærmere kanten av parabolen enn eggene. Etter dette setter du mikroskopet til filteret som passer for Rhodamine å observere fluorescensen i nålen og fokusere på spissen. På mikroinjektoren dreier du langsomt balanseknappen med klokken til injeksjonsvæsken begynner å lekke ut av nålen inn i suspensjonsoppløsningen.Vri deretter knotten litt tilbake mot klokken til fargestoffet bare slutter å lekke ut av nålen. Med nålen fortsatt sentrert i synsfeltet, flytt eggfatet slik at nålen er rettet mot egget som skal injiseres først. Juster forstørrelsen til ca 50x slik at et enkelt egg fyller det meste av synsfeltet.Bruk både mikromanipulatoren og ens hånd på eggefatet til å flytte nålen på plass for injeksjonen. Bruk mikromanipulatoren til å gå videre på nålen og sett spissen inn i det første egget som skal injiseres, og pass på å sette inn nålen ved 20 til 30% av egglengden fra den bakre enden av egget vinkelrett på eggets lange akse. Injiser oppløsningen med enten injeksjonsfotpedalen eller injeksjonsknappen på mikroinjektoren.En liten bolus av fluorescerende materiale inne i egget vil indikere en vellykket injeksjon. Etter dette trekker du nålen tilbake fra egget. Hvis egget utilsiktet løftes ut av brønnen ved tilbaketrekking av nålen, bruk små tang til å skyve egget tilbake i brønnen mens du trekker nålen tilbake.I denne studien injiseres cricketegg ved hjelp av en teknikk som fungerer som en grunnleggende metode i mange eksperimenter, inkludert, men ikke begrenset til, RNA-interferens og genomisk manipulasjon. Overlevelsesraten er en viktig parameter for å vurdere suksessen til dette eksperimentet. De fleste døde egg kan lett identifiseres ved synet som eggeplomme og embryonalt vev i egget begynner å klumpe ujevnt, og til slutt vil det meste av eggeplommen migrere til den ene siden av egget.Når det ble vurdert etter fire til seks dager, overlevde mer enn 85 % av uinjekte egg, mens egg injisert med eksperimentelle reagenser generelt hadde lavere overlevelse. Kontroll for alle aspekter av injeksjonen selv, inkludert nål punktering, innføring av fargestoff og buffer, eller tilstedeværelse av kjøretøy eller dobbelt strandet RNA, er nødvendig for å forstå de sanne effektene av eksperimentell manipulasjon forsøkt. Måten man vurderer fenotypiske resultater av injeksjon avhenger av hva som ble injisert.For eksempel kan fenotypiske endringer som følge av spesifikke mRNA-knockdowns være åpenbare på brutto anatominivå. Hvis på den annen side en cDNA koding en EGFP tagget histone 2B genet under kontroll av en G.bimaculatus actin promotor er satt inn i cricket genom ved hjelp av piggyback transposase, blir det mulig å visualisere hver kjerne i egget ved hjelp av fluorescens for å opphisse EGFP merket hist 2B protein. Justering av balansen slik at nålene ikke tetter er et kritisk skritt i denne prosedyren.Du må kanskje gjøre flere justeringer etter påfølgende injeksjoner siden eggeplomme noen ganger tetter nålespissen. Cricket er et hemimetabolous insekt som grener basalt for å godt studert holometaboløse insekter som Drosophila. Å studere cricketutvikling vil hjelpe oss å forstå mer om evolusjon og utvikling over hele dyreriket.Denne teknikken tar litt øvelse. Vi anbefaler at du øver på kontrollinjeksjoner til overlevelsesraten fire eller fem dager etter injeksjonen er minst 80 %

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Saltholdighet avhengig toksisitet analysen av Silver Nanocolloids Bruke medakaegg

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

In Ovo Feeding of Commercial Broiler Eggs: An Accurate and Reproducible Method to Affect Muscle Development and Growth

In Ovo Feeding of Commercial Broiler Eggs: An Accurate and Reproducible Method to Affect Muscle Development and Growth

I Ovo Fôring av kommersielle broileregg: En nøyaktig og reproduserbar metode for å påvirke muskelutvikling og vekst

Within the past three decades, red meat and poultry scientists focused on developing strategies and technologies to manipulate muscle development during ...

Investigating Development with Optogenetic Signaling Manipulation in Zebrafish

Optogenetic Signaling Activation in Zebrafish Embryos

Manipulating Signaling in Zebrafish Embryos to Decode Cell Fate Decisions (Video) | JoVE

Optogenetisk signalaktivering i sebrafiskembryoer

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally ...

Enhancing Protein Visualization with Antibody-Mediated Live Imaging

Visualizing Low-Abundance Proteins and Post-Translational Modifications in Living Drosophila Embryos via Fluorescent Antibody Injection

Unveiling the Dynamics of Mechanical and Biochemical Signals in Animal Morphogenesis Research (Video) | JoVE

Visualisering av proteiner med lav overflod og posttranslasjonelle modifikasjoner i levende Drosophila-embryoer via fluorescerende antistoffinjeksjon

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein ...