Name: injecting gryllus bimaculatus eggs
Uploaded: 2019-08-22T13:00:00
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La investigación reportada en este proyecto fue apoyada por un Premio de Desarrollo Institucional (IDeA) del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de subvención P20GM10342 a HH3, y por el número de premio NSF IOS-1257217 a Cge.

1. Configuración de hardware y preparación de materiales
NOTA: Consulte la Tabla 1 y la Tabla de Materiales para la preparación de soluciones, reactivos y detalles del equipo.
<ol><li>Colocar un microscopio de disección para ver los huevos y guiar la aguja de inyección. (LaFigura 1A muestra un microscopio de disección equipado con fluorescencia.) La capacidad de fluorescencia es ventajosa pero no necesaria...

<ol>
	<li>Abzhanov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+there+yet?+Tracking+the+development+of+new+model+systems.">Are we there yet? Tracking the development of new model systems.</a> Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).</li><li>Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+August+Krogh+principle:+&#8220;For+many+problems+there+is+an+animal+on+which+it+can+be+most+conveniently+studied.">The August Krogh principle: &#8220;For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied.</a> Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).</li><li>Krogh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Progress+of+Physiology.">The Progress of Physiology.</a> American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).</li><li>Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cricket neurobiology and behavior. , (1989).</li><li>Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , (2017).</li><li>Misof, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenomics+resolves+the+timing+and+pattern+of+insect+evolution.">Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution.</a> Science. 346 (6210), 763-767 (2014).</li><li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+transgenic+cricket+embryos+reveals+cell+movements+consistent+with+a+syncytial+patterning+mechanism.">Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism.</a> Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).</li><li>Shinmyo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac-mediated+somatic+transformation+of+the+two-spotted+cricket,+Gryllus+bimaculatus.">piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Development, growth &amp; differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).</li><li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-transgenic+genome+modifications+in+a+hemimetabolous+insect+using+zinc-finger+and+TAL+effector+nucleases.">Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases.</a> Nature communications. 3, 1017 (2012).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).</li><li>Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+crickets+for+the+study+of+learning+and+memory:+Dopamine+receptor+Dop1+mediates+aversive+but+not+appetitive+reinforcement+in+crickets.">Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets.</a> Scientific Reports. 5, 15885 (2015).</li><li>Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+in+the+Cricket.">Protocols in the Cricket.</a> The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).</li><li>Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Editing+in+the+Cricket,+Gryllus+bimaculatus.">Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).</li><li>Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch/Delta+signalling+is+not+required+for+segment+generation+in+the+basally+branching+insect+Gryllus+bimaculatus.">Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus.</a> Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).</li><li>Miyawaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Wingless/Armadillo+signaling+in+the+posterior+sequential+segmentation+in+the+cricket,+Gryllus+bimaculatus+(Orthoptera),+as+revealed+by+RNAi+analysis.">Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis.</a> Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).</li><li>Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+live-imaging+of+embryos+in+microwell+arrays+using+a+modular+specimen+mounting+system.">High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system.</a> Biology Open. 7 (7), bio031260 (2018).</li><li>Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+is+required+for+the+generation+of+primordial+germ+cells+in+an+insect.">BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect.</a> Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).</li><li>Larson, E., Andres, J., Harrison, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+male+ejaculate+on+post-mating+prezygotic+barriers+in+field+crickets.">Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets.</a> PLOS ONE. 7 (10), e46202 (2012).</li><li>Donoughe, S., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+development+of+the+cricket+Gryllus+bimaculatus.">Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus.</a> Developmental Biology. , (2016).</li><li>Matsuoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+germ+insects+utilize+both+the+ancestral+and+derived+mode+of+Polycomb+group-mediated+epigenetic+silencing+of+Hox+genes.">Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes.</a> Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).</li><li>Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heads+and+tails:+Evolution+of+antero-posterior+patterning+in+insects.">Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects.</a> Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).</li><li>Bacon, J., Strausfeld, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonrandom+resolution+of+neuron+arrangements.">Nonrandom resolution of neuron arrangements.</a> Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).</li></ol>

Los dos principales desafíos con esta técnica son los problemas relacionados con el tamaño óptimo de la aguja y la supervivencia. Aunque las agujas más pequeñas mejoran la supervivencia, las agujas con lúmenes más estrechos tienen un mayor grado de fuerzacapilar en el trabajo, lo que hace que sea más probable que la yema se mueva en la aguja haciendo que se obstruya. En el mejor de los casos, los bloqueos se pueden eliminar simplemente inyectando otro huevo o limpiando la aguja como se describió anteriormente. ...

La capacidad de modificar el genoma o influir en la expresión génica en los organismos es la base para el diseño de muchos tipos de experimentos que prueban la causalidad funcional. También es fundamental para el trabajo comparativo y evolutivo relevante que las técnicas de modificación genómica y no genómica estén disponibles en organismos fuera de los sistemas de modelos animales de laboratorio genético sin importancia (por ejemplo, Mus musculus, Danio rerio, Drosophila melanogaster, y Caenorhabditis elegans). Ya sea el deseo de entender la diversidad del organismo1 o la adhesión de uno al principio de Krogh, que para cada pregunta biológica hay un organismo más adecuado para su solución 2,3, la capacidad de modificar genomas o la expresión génica es esencial para los diseños experimentales modernos.
El grillo Gryllus bimaculatus es un sistema modelo emergente. Utilizado durante el siglo pasado en experimentos de neuroetología4, las últimas dos décadas han sido testigos de un mayor interés experimental en el cricket, particularmente centrado en la evolución y desarrollo de este organismo5. El grillo es un insecto hemimetabolous que se ramifica basalmente a los insectos holometabolosos bien estudiados, como D. melanogaster y Tribolium castaneum6. Debido a su posición útil sobre el árbol evolutivo, los científicos están interesados en hacer preguntas experimentales modernas y sofisticadas en este insecto, lo que ha llevado a un creciente interés en adaptar las herramientas moleculares para su uso en G. bimaculatus.
Las inyecciones de reactivos moleculares en huevos de grillo se pueden utilizar para experimentos de modificación genómica, así como manipulaciones no genómicas de la expresión génica en embriones. Por ejemplo, se han creado inserciones transgénicas G. bimaculatus que transportan eGFP utilizando la transposase piggyBac7,8. Los investigadores han creado con éxito noqueos G. bimaculatus utilizando nucleasas de zinc-dedo (ZFN) y nucleasas de efector de activador de tipo activador de transcripción (TAL) (TALENs) para introducir roturas de doble cadena en regiones genómicas específicas9. Aunque los ZFN y los TALENs permiten la segmentación específica del sitio en animales más allá de los cuatro grandes sistemas de modelos, estos reactivos han sido rápidamente superados por el sistema CRISPR/Cas9, que es más fácil de usar, más eficiente y altamente flexible10. CRISPR se ha utilizado en G. bimaculatus para producir knock-out11, así como las líneas de knock-in12,13 Además de la modificación genómica, dsRNA se puede inyectar en los huevos para derribar la expresión de ARNm en el desarrollo embriones, permitiendo a los investigadores comprender el papel de las transcripciones específicas a lo largo del desarrollo14,15. Algunos detalles limitados sobre cómo inyectar huevos de grillo se han publicado anteriormente12.
Aquí, describimos un protocolo detallado para inyectar los primeros huevos de G. bimaculatus. Este protocolo es eficaz y fácilmente adaptable a varios entornos de laboratorio, materiales de inyección, y posiblemente a otros insectos. Si bien se han publicado detalles adicionales para diseñar e implementar experimentos de modificación genómica y derribo en otros lugares12,13, estos enfoques se basarán en última instancia en el protocolo de inyección detallado aquí.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluorescent dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165 FC</td>
			<td>Stereomicroscope with fluorescence</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External light source for fluorescence</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EL 6000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-300</td>
			<td>-Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry filter cube</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M205FA/M165FC</td>
			<td>Filter cube for mCherry or similar red dye will work</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>M3301R</td>
			<td>Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MMO-202ND</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Holder (Needle holder)</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>HD-21</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Tubing to connect air source to microinjector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg well stamp</td>
			<td>3D printed</td>
			<td>custom</td>
			<td>3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator or temperature controlled room</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>Temperatures of 23.5-26&#176;C are needed.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cricket food</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>cat food or fish flakes are appropriate food.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cricket wter</td>
			<td>vairous</td>
			<td></td>
			<td>Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cricket shelter</td>
			<td>arious</td>
			<td></td>
			<td>Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary tubes</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>Item no. 1B100F-4</td>
			<td>Kwik-Fil&#8482; Borosilicate Glass Capillaries, 100mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Flaming/Brown</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td>Distributed by Sutter Instrument Co.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beveller/Micro grinder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>Model EG-45/EG-400</td>
			<td>EG-400 includes a microscope head</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>Product code 229693</td>
			<td>90mm diameter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Play Sand</td>
			<td>Sandtastik Products Ltd.</td>
			<td>B003U6QLVS</td>
			<td>White play sand</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB000972</td>
			<td>Agarose GPG/LE ultrapure</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers</td>
			<td>US Kitchen Supply</td>
			<td>Model SS-C123</td>
			<td>Pore size should be between 0.5 - 1.0 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>Ref 15070-063</td>
			<td>Pen Strep</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tweezers</td>
			<td>Sipel Electronic SA</td>
			<td>P3C-STD</td>
			<td>Black Static Dissipative, 118mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filters, 25mm diameter, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>725-2545</td>
			<td>Use with 1 ml syringe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309602</td>
			<td>Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air tank (optional)</td>
			<td>Midwest Products</td>
			<td>Air Works&#174;</td>
			<td>Portable air tank</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Rhodamine dye</td>
			<td rowspan="2">Thermofisher</td>
			<td rowspan="2">D-1817</td>
			<td rowspan="2">dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL loading tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Order no. 5242 956.003</td>
			<td>epT.I.P.S. 20uL Microloader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axioskope 2 plus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X objective</td>
			<td>Ziess</td>
			<td>Plan-Apochromat 20x/0.75 M27</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMC 5400</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite&#160; software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LAS</td>
			<td>Version 4.6.2 used here</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injecting gryllus bimaculatus eggs

La alteración de la función génica en un organismo en desarrollo es fundamental para diferentes tipos de experimentos. Si bien se han desarrollado herramientas genéticas tremendamente poderosas en los sistemas de modelos tradicionales, es difícil manipular genes o ARN mensajero (ARNm) en la mayoría de los otros organismos. Al mismo tiempo, los enfoques evolutivos y comparativos se basan en una exploración de la función génica en muchas especies diferentes, lo que requiere el desarrollo y la adaptación de técnicas para manipular la expresión fuera actualmente tratable genéticamente Especies. Este protocolo describe un método para inyectar reactivos en huevos de grillo para analizar los efectos de una manipulación dada en el desarrollo embrionario o larvario. Se describen las instrucciones para recoger e inyectar óvulos con agujas biseladas. Esta técnica relativamente sencilla es flexible y potencialmente adaptable a otros insectos. Uno puede reunir e inyectar docenas de óvulos en un solo experimento, y las tasas de supervivencia para las inyecciones sólo de amortiguación mejoran con la práctica y pueden ser tan altas como 80%. Esta técnica apoyará varios tipos de enfoques experimentales, incluida la inyección de agentes farmacológicos, el ARNm tapado in vitro para expresar genes de interés, el ARN de doble cadena (dsRNA) para lograr la interferencia del ARN, el uso de Repeticiones palindrómicas cortas interespaciadas (CRISPR) en conjunto con reactivos de proteína 9 (Cas9) asociados a CRISPR para modificación genómica y elementos transposables para generar líneas transgénicas transitorias o estables.

Los grillos ponen fácilmente los huevos en el material húmedo, y proporcionando material adecuado, como arena húmeda o suciedad, los induce a poner un gran número de huevos. Esto es especialmente eficaz si los grillos se ven privados primero de material de puesta de huevos durante 8-10 h. Los huevos colocados en arena limpia se pueden separar fácilmente, recoger (Figura1B)y colocarse en pozos de huevo sin cáscara de inyección diseñados a medida (Figur...

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Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Inyección de huevos de Gryllus bimaculatus

Aquí presentamos un protocolo para inyectar huevos de cricket, una técnica que sirve como método fundamental en muchos experimentos en el cricket, incluyendo, pero no limitado a, interferencia de ARN y manipulación genómica.

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been ...

Esta técnica sirve como método fundamental para experimentos diseñados para ensayar el desarrollo embrionario o larvario del grillo. La principal ventaja de esta técnica es que es flexible y soportará varios tipos de enfoques experimentales, como los que utilizan interferencia de ARN o manipulación genómica. Demostrando el procedimiento estará Hadley Wilson Horch, la investigadora principal en el laboratorio.Para comenzar este procedimiento humedezca el plano de la trituradora giratoria del biselador con agua goteando. Coloque la aguja tirada en el biselador y gírela a un ángulo de 20 grados. Baje la aguja hasta que toque la placa de molienda y bisele durante dos o tres minutos.Evalúe el bisel colocando la aguja biselada en cinta de doble palo que se ha adherido a un portaobjetos de vidrio. Coloque la diapositiva en el escenario de un microscopio compuesto equipado con una cámara y un software de adquisición de imágenes. Adquirir una imagen de la aguja utilizando un objetivo 20x.Utilice el software de imágenes para medir el diámetro del lumen interior de la aguja sólo proximal a la abertura biselada. Deseche las agujas con una abertura inferior a ocho micrómetros o más de 12 micrómetros. Primero, haz 40 mililitros de 1% de ágarosa en agua y vierta en un plato de Petri de 10 centímetros.Coloque un sello de huevo en la superficie de la agarosa antes de que se solidifique. Una vez que la agarosa se solidifice, retire el sello para revelar los pozos. A continuación, llene la placa del pozo de agarosa con HBS que contiene 1%estreptomicina de penicilina.Coloque la tapa en el plato, envuélvalo en Parafilm y guárdelo a cuatro grados centígrados. Después de esto, llene un plato de Petri de 35 milímetros con arena blanca del patio de recreo para hacer un plato de recolección de huevos para que los grillos pongan huevos. Cubra el plato de huevo con una toalla de papel cortada en cuadrados de aproximadamente 18 por 18 centímetros.Llene con agua del grifo a través de la toalla de papel. A continuación, incline el plato de Petri y apriete suavemente la parte superior para eliminar el exceso de agua. Coloque las esquinas de la toalla de papel cuadrada debajo del plato y coloque el plato de huevo en una tapa invertida que ayudará a mantener la toalla de papel en su lugar.Coloque el plato de huevo en el recipiente de cricket y deje que las hembras adultas oviposite los huevos durante una o dos horas. Mientras tanto, deje que el plato de agarosa se caliente a temperatura ambiente en preparación para la celebración de los huevos para inyección. Cuando esté listo, retire el plato de recolección de huevos, que ahora contiene huevos recién puestos, de la papelera de cricket.Retire la toalla de papel y coloque un colador con un tamaño de poro entre 0,5 y un milímetros sobre un vaso de precipitados. Enjuague el contenido del plato de puesta de huevos en el colador bajo el agua del grifo que corre suavemente. Los granos de arena caerán a través de la malla coladora en el vaso de precipitados de abajo, mientras que los huevos de cricket permanecen en la cesta de colador.Llene un recipiente con agua de ósmosis inversa y colóquelo en una bandeja. Invierta el colador sobre el recipiente y tócalo contra el plato para desalojar los huevos en el agua. Los huevos se hundirán en el fondo del recipiente.A continuación, utilice tijeras para cortar la punta de una punta de pipeta P1000 para hacer una abertura de aproximadamente tres milímetros de diámetro. Coloque este consejo en un pipeteador P1000 y úselo para transferir los huevos del recipiente al plato de moldes de huevo de agarosa. Usando pinzas de plástico, alinee los huevos en los pozos de agarosa.Cada huevo se hundirá en el fondo de un pozo individual. Cubra el plato de Petri con una tapa hasta que esté listo para inyectar. Para comenzar, coloque el plato de huevos bajo el microscopio de disección y seleccione un aumento bajo de alrededor de 10x.Extraiga 1,5 microlitros de solución inyectable utilizando puntas de carga de 20 microlitros y una pipeta P10 e inserte la punta de carga en el extremo ancho de la aguja de inyección. Expulse la solución inyectable a la aguja de inyección. Inserte la aguja en la carcasa de inyección y apriete, asegurándose de que la aguja esté correctamente insertada y firmemente en la carcasa.A continuación, inserte cuidadosamente la carcasa de inyección en el micromanipulador, teniendo cuidado de no romperse o lesionarse por la aguja. Mientras mira los huevos y la aguja a través del microscopio, mueva la aguja cerca de la X en la esquina superior izquierda de la rejilla del plato. Baje la aguja hasta que la punta entre en la solución tamponada de estreptomicina de HBS más estrecilina en la bandeja.Centrar la aguja en el campo de visión y mover el plato de huevo para que la aguja esté unos milímetros más cerca del borde del plato que los huevos. Después de esto, ajuste el microscopio al filtro apropiado para Que Rhodamine observe la fluorescencia en la aguja y concéntrese en su punta. En el microinyector gire lentamente la perilla de la balanza en el sentido de las agujas del reloj hasta que la solución de inyección comience a salir de la aguja a la solución de suspensión.A continuación, gire la perilla hacia atrás ligeramente hasta que el tinte deje de salir de la aguja. Con la aguja todavía centrada en el campo de visión, mueva el plato de huevo para que la aguja esté dirigida al huevo que se va a inyectar primero. Ajuste el aumento a aproximadamente 50x para que un solo huevo llene la mayor parte del campo de visión.Utilice tanto el micromanipulador como la mano en la bandeja de huevo para mover la aguja a su posición para la inyección. Utilice el micromaniprógrafo para avanzar la aguja e inserte la punta en el primer óvulo que se va a inyectar, asegurándose de insertar la aguja en 20 a 30% de la longitud del huevo desde el extremo posterior del huevo perpendicular al eje largo del huevo. Inyecte la solución con el pedal de inyección o con el botón de inyección del microinyector.Un pequeño bolo de material fluorescente dentro del huevo indicará una inyección exitosa. Después de esto, retraiga la aguja del huevo. Si el huevo se levanta involuntariamente de su pozo al retracción de la aguja, utilice pequeños fórceps para empujar el huevo de nuevo en el pozo mientras retrae la aguja.En este estudio, los huevos de cricket se inyectan utilizando una técnica que sirve como un método fundamental en muchos experimentos, incluyendo pero no limitado a, interferencia de ARN y manipulación genómica. La tasa de supervivencia es un parámetro importante para evaluar el éxito de este experimento. La mayoría de los óvulos muertos se pueden identificar fácilmente por la vista, ya que la yema y el tejido embrionario dentro del óvulo comienzan a aglucuarse de manera desigual, y con el tiempo la mayor parte de la yema migrará a un lado del óvulo.Cuando se evalúa después de cuatro a seis días, más del 85% de los óvulos no inyectados sobrevivieron, mientras que los óvulos inyectados con reactivos experimentales generalmente tenían una tasa de supervivencia más baja. Se requiere el control de todos los aspectos de la inyección en sí, incluida la punción de la aguja, la introducción de tinte y tampón, o la presencia de ARN de vehículo o de doble cadena, para comprender los verdaderos efectos de la manipulación experimental intentada. La forma en que se evalúan los resultados fenotípicos de la inyección depende de lo que se inyectó.Por ejemplo, los cambios fenotípicos como resultado de derribos específicos de ARNm pueden ser obvios a nivel de anatomía bruta. Si por otro lado se inserta un ADNC que codifica un gen de histona 2B etiquetado por EGFP bajo el control de un promotor de G.bimaculatus actin en el genoma del grillo utilizando transposasa de piggyback, se hace posible visualizar cada núcleo en el óvulo utilizando fluorescencia para excitar la proteína EGFP tagged hist 2B. Ajustar la balanza para que las agujas no se obstruyan es un paso crítico en este procedimiento.Es posible que deba realizar varios ajustes después de las inyecciones posteriores, ya que la yema a veces obstruye la punta de la aguja. El grillo es un insecto hemimetabolous que se ramifica basalmente a insectos holometabolos bien estudiados como Drosophila. Estudiar el desarrollo del cricket nos ayudará a entender más sobre la evolución y el desarrollo en todo el reino animal.Esta técnica requiere un poco de práctica. Recomendamos practicar inyecciones de control hasta que la tasa de supervivencia cuatro o cinco días después de la inyección sea al menos del 80%

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Ensayo de toxicidad dependiente de la salinidad del Plata nanocoloides Usando Medaka huevos

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

Investigación

Biología del Desarrollo

In Ovo Feeding of Commercial Broiler Eggs: An Accurate and Reproducible Method to Affect Muscle Development and Growth

In Ovo Feeding of Commercial Broiler Eggs: An Accurate and Reproducible Method to Affect Muscle Development and Growth

En Ovo Alimentación de huevos de pollos de engorde comerciales: un método preciso y reproducible para afectar el desarrollo y el crecimiento muscular

Within the past three decades, red meat and poultry scientists focused on developing strategies and technologies to manipulate muscle development during ...

Investigating Development with Optogenetic Signaling Manipulation in Zebrafish

Optogenetic Signaling Activation in Zebrafish Embryos

Manipulating Signaling in Zebrafish Embryos to Decode Cell Fate Decisions (Video) | JoVE

Activación de la señalización optogenética en embriones de pez cebra

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally ...

Enhancing Protein Visualization with Antibody-Mediated Live Imaging

Visualizing Low-Abundance Proteins and Post-Translational Modifications in Living Drosophila Embryos via Fluorescent Antibody Injection

Unveiling the Dynamics of Mechanical and Biochemical Signals in Animal Morphogenesis Research (Video) | JoVE

Visualización de proteínas de baja abundancia y modificaciones postraduccionales en embriones vivos de Drosophila mediante inyección de anticuerpos fluorescentes

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein ...